专利名称：人尿胰蛋白酶抑制物制剂及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种安全性极高的人尿胰蛋白酶抑制物制剂及其生产方法。
Proksch等人首先从人尿中以完整的形式分离并纯化出一种人尿胰蛋白酶抑制物(下文简称HUTI)J.Lab.Clin.Med.，79，491(1972)。这种人尿胰蛋白酶是一种含有百分之几十的唾液酸和中性己糖的糖蛋白，并且经凝胶过滤后该蛋白的分子量大约是67KD，等电点是2-J.Lab.Clin.Med.，79，491(1972)，Jap.J.Urol.，74，1627(1983)，Proteinase Inhibi tors，12，389(1986)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，109，1247(1982)。
当HUTI特别强烈地抑制胰腺酶中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶时，它不象抗凝血酶III(AT-III)或甲磺酸加贝酯(gabexate mesylate)(FOY)，几乎或完全不抑制凝聚和溶血纤维蛋白酶Folia pharmacol.Japan，81，235(1983)。鉴于HUTI在溶酶体膜上的稳定作用，一般认为它能够抑制溶酶体酶和心肌抑制因子的生产Jap.J.Anes th.，33，137(1984)。
由于HUTI具有上述活性和效应，可以将其用于急性胰腺炎和急性循环衰竭，并且临床上已经使用把HUTI制剂作为一种没有较大副作用的制剂用于处理急性胰腺炎，手术和内毒素休克。
源于人的蛋白制剂(不仅是由体液制备的那些制剂，而且还有由一种经过重组技术生产的材料制备的那些制剂)在原料中存在含有各种污染物病毒的可能。在这些污染物病毒中，近年来已经发现了肝炎C病毒(下文简称HCV)，并且对它的感染的预防和治疗没有完整地确立。尽管HUTI制剂仍然可能含有这种病毒的基因组，但是就污染病毒而言，通过液体加热处理，它们在HUTI制剂中基本已经失活。虽然病毒基因组本身是没有传染性的，但是需要将其从制剂中除去从而保证制剂的高纯度和安全性。
因此，本发明的一个目的是提供一种抗病毒的HUTI制剂，它基本上不含病毒基因组并且具有很高的安全性，也提供了一种具有高效率和良好操作性的生产方法。
按照本发明，目前已经发观采用液体加热处理方法，使污染物病毒失活以及酸性蛋白酶失活但基本上不使HUTI失活，再用一种多孔膜(平均孔径1nm-100nm)过滤能够生产出一种不含病毒基因组并且具有高纯度和高稳定性的更安全的HUTI制剂。
本发明的HUTI制剂基本上不含病毒基因组，特别是不含HCV基因组。
“基本上不含病毒基因组”的含义是在制剂中不能检测到病毒基因组；即，病毒基因组的含量不超过1PCR单位/毫升，其中1PCR单位指的是通过Transfusion Vol.32，pp.824-828(1992)中所述的PCR方法，即Nested(Double)RT-PCR方法检测到的RNA的最小量。Nested(Double)RT-PCR方法的优选方法在实验例1中作详细介绍。
本发明的HUTI制剂优选在制剂中具有至少2000单位/毫克蛋白，更优选2000-4500单位/毫克蛋白的特异活性的HUTI。这里1个单位的HUTI指的是当HUTI与2ug胰蛋白酶反应时，它抑制1ug胰蛋白酶的活性的HUTI量。将特异活性表示为每1毫克总蛋白的HUTI单位，它能够通过Kjeldahl方法测定本发明制剂中含有的HUTI优选具有分子量60000-70000并且等电点约为2-3。
本发明HUTI制剂的原料不被特别限定，只要它是含有HUTI的组合物，它可以含有源于尿、培养细胞，通过遗传工程制备的或其他衍生物的任何HUTI。本发明中所用的HUTI包括只要不失去活性的一种具有部分缺失或部分替代的氨基酸序列的HUTI，具有把一种或多种氨基酸加入到该氨基酸序列的HUTI和其他HUTI。
在HUTI制剂的原料中可能含有的病毒例包括HCV，肝炎B病毒(HBV)，细胞肥大病毒(CMV)，细小病毒以及其他这类病毒。
本发明的方法优选用于生产本发明的HUTI制剂，该方法包括以下步骤在充分去除可能的污染物病毒传染性和基本上不使HUTI失活的条件下，处理一种含有HUTI的原料组合物，再通过一种多孔膜(平均孔径1nm-100nm)过滤。基本上不使HUTI失活的条件是将病毒失活处理后，使得HUTI的残留活性不低于90％。
能够充分去除可能的污染物病毒传染性和基本上不使HUTI失活的处理方法优选加热处理，特别是在液态下加热处理。
使用这种液体加热处理时，在充分去除可能的污染物病毒传染性和基本上不使HUTI失活的条件下将含有HUTI的溶液加热，这些条件是pH值的范围是5-7，处理温度是60℃-100℃，处理时间是3分钟-15小时。
在上述加热处理后，优选将该溶液在液态下进一步加热1-60分钟，优选大约30分钟(将pH值调到2-5时)。在所述较低的pH值范围内的这种加热处理能够使同时使HUTI溶液中降解HUTI的酸性蛋白酶和上述在高温失活的病毒失活。酸性蛋白酶的失活使得制剂具有高稳定性并且在制剂中不含降解的HUTI。
这里的酸性蛋白酶包括具有下列性质的酸性蛋白酶(i)特别是在一种酸性环境下(pH值在2-4的范围内)能够分解HUTI；(ii)用胃酶抑制剂(一种天冬氨酸抑制剂)或苯丁抑制素(一种氨肽酶抑制剂)将其抑制；和(iii)将其在100℃处理1分钟，或在60℃pH值在2-4的范围内处理大约30分钟，会失活。
在液体加热处理后，将含有HUTI的溶液通过多孔膜如多孔中空纤维和膜滤器过滤，优选多孔中空纤维。这种多孔中空纤维是一种具有众多孔的管状丝，所述的孔从空心丝的空心部分内侧至外侧贯穿外周壁，这种外周壁起过滤膜的作用。
本发明所用的多孔膜平均孔径为1nm-100nm。这种大小的孔能够从含有HUTI溶液中除去污染的病毒。就多孔中空纤维来说，本发明所用的多孔中空纤维外周壁上孔的平均孔径为1nm-100nm，优选10nm-50nm，更优选15+/-2nm。
此外，多孔中空纤维的空心部分内径优选330+/-30um。外周壁的厚度(膜厚度)优选27+/-3um。
当构成多孔膜的材料不受到特殊限制时，优选再生的纤维素。从纤维素铜铵溶液采用微相分离法(Am.Chem.soc.，9，197-228(1985))能够制备一种由再生纤维素制成的多孔中空纤维。
这种多孔中空纤维优选在一种组件中使用。例如，将许多多孔中空纤维以相互平行的方式捆在一起，装在一个筒中并用粘合剂粘合。
在过滤过程中，含HUTI的溶液温度是4℃-50℃，优选4℃-20℃。
过滤所用的压力为0.1kgf/cm2-1kgf/cm2，优选0.4kgf/cm2-0.9kgf/cm2。
在上述温度和压力条件下，能够将含有HUTI的溶液进行有效的过滤。
当含有HUTI的溶液的蛋白浓度为0.01W/V％-10W/V％，优选0.1W/V％-4W/V％时，能够将该溶液有效地过滤。
所用的过滤方法包括交叉过滤法(循环法)和死端过滤法(非循环法)，其中交叉过滤法是以应变速率过滤溶液的，死端过滤法不以应变速率过滤溶液。优选交叉过滤法或使用一个气压的死端过滤法。
在上述条件下进行过滤之前，最好把用于本发明方法的含HUTI的溶液采用一种不同于本发明的中空纤维或膜滤器进行初步过滤。
在液体加热处理后，将含HUTI的溶液进行过滤时，能够使该溶液更容易通过滤器对该溶液进行有效的处理。
过滤后，采用常规方法将含有HUTI的溶液制成一种液体制剂或干制剂。
本发明的HUTI制剂可以含有适当的药学上可接受的常用的药物添加剂，如，防腐剂，螯合剂，增稠剂，等渗剂和药物制剂配方所必需的成分。
防腐剂的例子包括氯化苄烷铵，对羟基苯甲酸酯，苯甲醇，对氯甲基联苯醇(parachloromethaxenol)，氯甲酚，苯乙醇，山梨酸及其盐，乙基汞硫代水杨酸钠，氯代丁醇等等；螯合剂的例子包括乙二胺四乙酸钠，柠檬酸钠，缩聚磷酸钠等等；增稠剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基纤维素，聚乙烯醇，聚丙烯酸钠等等；等渗剂的例子包括氨基酸(如甘氨酸)，甘油，聚乙二醇，丙二醇，氯化钠，单糖，二糖，糖醇等等。
按照本发明在充分去除可能的污染物病毒传染性和基本上不使HUTI失活的条件下进行处理再使用一种多孔膜进行过滤能够生产制剂中没有HUTI降解的不含污染物病毒并且具有高纯度、高安全性和高稳定性的一种HUTI制剂。此外，也提供了有效生产所述制剂的方法。
在下面的实施例和实验例中对本发明进行更详细地描述，但是它们并不是用来限制本发明的。实施例1(1)原料按照J.Lab.Clin.Med.，79，491(1972)中所述的方法，采用新鲜的人尿作为制剂的原料来制备一种HUTI溶液。该HUTI溶液的浓度约为2W/V％。(2)液体加热处理将(1)中的HUTI溶液的pH值调到5.5，在60℃把该溶液加热10小时。然后，把pH值调到3.5，再加热30分钟。(3)过滤把经过液体加热处理的HUTI溶液进行下面的过滤。
把含有BMM(本伯格微孔膜，由Asahi Chemical制造)用作多孔中空纤维。BMM是一种从再生纤维中按照铜铵法制得的多孔中空纤维。
PLANOVA15(商标，由Asahi Chemical Indus try Co.，Ltd.制造)具有不少于150层的多层结构的外周壁，用它作BMM组件。在组件中多孔中空纤维的形式如下平均孔径 15+/-2nm中空纤维的内径 330+/-2um膜的厚度 27+/-3um这种组件是由上述多孔中空纤维，一种可加压加热的聚碳酸酯塑料容器和一种将其粘合的聚氨基甲酸酯粘合剂组成。将这种组件在一种高压灭菌器中进行灭菌，再将注射用的蒸馏水装满组件。按照日本药典中确定的方法来证明构成PLANOVA15的各种材料的安全性(摘自BMM的产品说明书)。
过滤的条件是HUTI溶液的温度为10℃-15℃，过滤的压力为0.8kgf/cm2。按照实施例的过滤条件将12L的HUTI溶液在每1m2的上述多孔中空纤维有效膜面上处理1小时，其中有效膜面多孔中空纤维外周壁的总面积，起着膜的作用。在过滤处理完成后，调整HUTI溶液的效价并将该溶液过滤除菌。把所得的HUTI溶液配制成液体制剂。
通过下面实验例1中介绍的方法来测定所得的制剂中肝炎C病毒基因组的量。结果测定的量没有超过检测极限(1PCR单位/毫升)。
实验例1病毒去除的确认用HCV突起试验验证结果。具体是在实施例1(3)中所述的过滤条件下将加有HCV阳性血浆的2W/V％的HUTI溶液样品进行过滤，过滤前后，用PCR方法测定溶液中的HCV基因组。
(a)从样品中提取HCV RNA把胍，硫氰酸胍和sarcosil加入可能含有污染物病毒的样品溶液中。然后，用苯酚/氯仿对该溶液脱蛋白。用异戊醇沉淀RNA。每种反应都在室温下进行。
(b)用逆转录酶制备HCV cDNA把无序六聚物与(a)中获得的RNA结合，然后用逆转录酶在42℃反应1小时得到HCV cDNA。
(c)用Nes ted PCR方法扩增cDNA用HCV引物(用从HCV基因组的非编码区的5’端侧得到的5’-GTGAGTACACCGGAATTGCC-3’和5’-CACGGTCTACGAGACCTCCC-3’作第一引物以及5’-ACGACCGGGTCCTTTCTTGG-3’和5’-GCACTCGCAAGCACCCTATC-3’作第二引物)和Taq聚合酶扩增(HCV)cDNA。在94℃时，进行30秒的热变性，在55℃时，进行2分钟的退火，在72℃时，进行2分钟的延伸。将这些步骤重复循环20次或更多次，得到一种反应产物。
(d)PCR产物的分析将在(c)中得到的产物进行6W/V％的聚丙烯酰胺凝胶电泳处理并用溴化乙锭染色对其进行检测。
试验结果显示过滤前样品溶液中HCV基因组的量是103PCR单位/毫升，过滤后它的量下降到不超过检测极限(1PCR单位/毫升)。实验例2过滤条件(1)过滤压力使用2W/V％HUTI溶液和与实施例1中所用的相同组件，在下列条件下过滤溶液温度，15℃，过滤压力，0.2kgf/cm2，0.5kgf/cm2和0.8kgf/cm2；测定每分钟过滤的溶液量。结果见表1。
表1
2)初步过滤过滤前，用一种除菌膜(孔径0.45um，膜滤器)过滤HUTI溶液。这种初步过滤能够使过滤处理更有效。实验例3制剂的性质和稳定性(1)性质在实施例1中测定过滤前后HUTI的活性，HUTI的特异活性，糖含量，pH值和热源(按照日本药典中的热源试验)的变化。结果见表2。此外，用HPLC测定过滤前后分子量分布的变化。从这些结果中，表明HUTI的回收率不低于95％(与作为原料的含有HUTI的溶液相比)，并且在处理前后，没有发现HUTI的活性，分子量分布等性质的改变。
表2
2)稳定性试验把实施例1中所得的HUTI制剂在25℃下保存6个月，测定热稳定性，分子量分布和HUTI的活性来检测其稳定性。
结果稳定性良好，并且分子量分布等没有变化。实验例4DNA阴性试验用Threshold系统(由Molecular Debices制造)测定实施例1中所得的HUTI制剂的总DNA的量。按照其所附的材料用一种DNA提取试剂盒(由Wako PureChemical Industries，Ltd.制造)提取DNA。结果发现总DNA的含量不超过检测极限(2pg/ml)，证明在本发明的过滤处理后制剂没有受到病毒污染。
权利要求
1.一种含有人尿胰蛋白酶抑制物的制剂，其特征在于该制剂基本上不含病毒基因组。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中病毒基因组是肝炎C病毒的基因组。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中人尿胰蛋白酶抑制剂具有至少2000单位/毫克蛋白的特异活性。
4.根据权利要求1至权利要求3中所述的任何一种制剂，它是使用一种多孔膜过滤含有人尿胰蛋白酶抑制物的溶液得到的，所述的多孔膜平均孔径为1nm-100nm，所述的溶液已经在充分去除可能污染物病毒的传染性和基本上不使人尿胰蛋白酶抑制物失活的条件下处理过。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中多孔膜是一种多孔中空纤维。
6.根据权利要求4所述的制剂，其中过滤是在下列条件下进行的温度为4℃-50℃和过滤压力为0.1kgf/cm2-1kgf/cm2。
7.根据权利要求4所述的制剂，其中溶液含有的蛋白浓度为0.01W/V％-10W/V％。
8.根据权利要求4所述的制剂，其中处理是加热处理。
9.根据权利要求8所述的制剂，其中加热处理是在液体加热处理。
10.根据权利要求9所述的制剂，它是在pH5-7和60℃-100℃经过液体加热处理3分钟-15小时得到的。
11.根据权利要求10所述的制剂，其中的液体加热处理还包括另外的把pH值调整到2-5后进行的液体加热处理。
12.一种用于生产一种人尿胰蛋白酶抑制物制剂的方法，它包括使用一种多孔膜过滤含有人尿胰蛋白酶抑制物的溶液，所述的多孔膜平均孔径为1nm-100nm，所述的溶液已经在充分去除可能污染物病毒的传染性和基本上不使人尿胰蛋白酶抑制物失活的条件下处理过。
13.根据权利要求12的方法，其中多孔膜是一种多孔中空纤维。
14.根据权利要求12的方法，其中过滤是在下列条件下进行的温度为4℃-50℃和过滤压力为0.1kgf/cm2-1kgf/cm2。
15.根据权利要求12所述的方法，其中溶液含有的蛋白浓度为0.01W/V％-10W/V％。
16.根据权利要求12所述的方法，其中处理是加热处理。
17.根据权利要求16所述的方法，其中加热处理是在液体加热处理。
18.根据权利要求17所述的方法，其中液体加热处理在pH5-7和60℃-100℃进行3分钟-15小时。
19.根据权利要求18所述的方法，在液体加热处理后还包括另外的把pH值调整到2-5后进行的液体加热处理。
全文摘要
一种人尿胰蛋白酶抑制物(HUTI)制剂，它基本上不含病毒基因组，以及一种用于生产该HUTI制剂的方法，它包括使用一种多孔膜过滤含有HUTI的溶液，所述的多孔膜平均孔径为1nm-100nm，所述的含有HUTI的溶液已经在充分去除可能污染物病毒的传染性和基本上不使人尿胰蛋白酶抑制物失活的条件下处理过。按照本发明，由于制剂中HUTI没有被降解，因此能够生产一种高度安全的HUTI制剂，该制剂不含污染物病毒并且具有很高的稳定性。此外，本发明还提供了一种用于有效生产所述制剂的方法。
文档编号A61K38/55GK1153062SQ9612113
公开日1997年7月2日 申请日期1996年10月4日 优先权日1996年10月4日
发明者河畠芳明, 园田雅树, 后藤节, 西槙秀雄 申请人:株式会社绿十字