专利名称：：一种高效裂解衣原体胞壁的方法
技术领域：
：本发明涉及微生物学领域，衣原体属(G^7迈,Wa)，不同衣原体种的衣原体胞壁的裂解技术，特别提供了一种高效裂解衣原体胞壁，充分释放胞内物质，并保持其完整生物学活性。提高了分子生物检测方法检测衣原体感染的灵敏度和准确性。
背景技术：
：衣原体易感人类、哺乳动物和禽类，引起肺炎、结膜炎、鼻炎和腹泻等，在家畜以流产和肺炎为特征，是一类十分重要的自然疫源性人兽共患疾病的病原体，严重地危害人畜禽类的健康，同时对我国公共卫生事业造成极大的影响。衣原体在生物学分类上属于衣原体属(^W顶7^'a)，是一类在真核细胞内专营寄生生活的微生物。多呈球形或卵圆形大小不同的颗粒，直径0.21.5"m。衣原体内含有DNA和RNA两种类型的核酸；具有独特的发育周期，具有独立的酶系统，能分解葡萄糖释放C02，有些还能合成叶酸盐，但缺乏产生代谢能量的作用，必须依靠宿主细胞的代谢中间产物，因而表现严格的细胞内寄生。衣原体具有粘肽组成的胞壁，常规采用裂解衣原体胞壁的方法是置衣原体样品在-20-40。C冷冻，取出于室温融解，再冷冻，如此反复冻融三次，其目的是导致衣原体胞壁破裂，释放胞内具生物学活性物质于介质中；或采用石炭酸、木瓜蛋白酶或加温6(TC所破坏，此类方法会导致核蛋白质变性，丧失其生物学活性。衣原体都可在68日龄鸡胚卵黄囊中繁殖，或采用HeLa细胞、猴肾细胞、人羊膜细胞培养增殖。当前，人、畜和禽类感染衣原体的诊断方法多采用设计不同的特异性引物，应用多聚酶链式反应(PCR)可特异性地诊断沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体感染，PCR检测方法具有敏感性高，特异性强的特点，现被广泛应用。但提供PCR检测衣原体的样品需将衣原体胞壁进行裂解，使胞内核酸释放于介质中作为检测样品。
发明内容本发明的目的在于提供一种高效裂解衣原体胞壁的方法，采用本方法会使核蛋白质保持较高的生物学活性。本发明提供了一种高效裂解衣原体胞壁的方法，其特征在于将衣原体样品放置-80°C，1012h;取出后放入预冷-5(TC左右的真空杯中，维持负压5.5Xl(Tmbar，2_3h。本发明高效裂解衣原体胞壁的方法中，所述衣原体样品最好来源于鸡胚卵黄囊膜或细胞培养物。采用本发明方法针对不同种的衣原体样品进行处理后，采用多聚酶链式反应(PCR)实验结果显示，本方法可高效裂解衣原体胞壁，充分释放胞内核酸，提高核酸检测灵敏度和准确性，从而提高人、畜、禽类感染衣原体感染的诊断率。具体实施例方式具体操作步骤鸡胚卵黄囊膜或细胞培养衣原体样品0.51毫升放置-80°C，1012h(或过夜)，取出后放入预冷-5(TC左右的真空杯中，维持负压5.5X10—imbar，2-3h后，使样品中衣原体胞壁高效裂解，胞内核酸物质充分释放于介质中，并保持其较高的生物学活性。实施例l采用本发明方法裂解衣原体样品:采集湖北省某县24户农户伺养猪63份粪便样品(份/个体)，样品经无菌处理后，在无菌条件下接种68d龄鸡胚卵黄囊腔，37t:培养7天，收集36天死亡鸡胚的卵黄囊膜，用组织匀浆器制成卵黄囊膜匀浆。分别设计沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体的特异性引物，进行多聚酶链式反应(PCR)检测实验，结果如下种/衣原体样品(n)阳性(+)阴性(-)检出百分率(％)肺炎衣原体63115217.46沙眼衣原体63194430.15鹦鹉热衣原体6375611.11合计3758.7比较例63份样品同上，采用常规采用裂解衣原体胞壁的方法是置衣原体样品在-20-40。C冷冻，取出再室温溶解，再冷冻，如此反复冻融三次。PCR检测方法同上，结果如下种/衣原体样品(n)阳性(+)阴性(-)检出百分率(％)肺炎衣原体633604.76沙眼衣原体6385512.60鹦鹉热衣原体630630合计1117.46比较例1-263份样品同上，采用常规采用裂解衣原体胞壁的方法是加温6(TC后，如上述方法作PCR检测，结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2采用本发明方法裂解衣原体样品采集湖北省某县3农户伺养观赏鹦鹉鸟110份粪便样品(份/个体)，样品经无菌处理后，在无菌条件下接种68d龄鸡胚卵黄囊腔，37'C培养7天，收集36天死亡鸡胚的卵黄囊膜，用组织匀浆器制成卵黄囊膜匀浆。分别设计沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体的特异性引物，进行多聚酶链式反应(PCR)检测实验，结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>比较例2-1:110份样品同上，采用常规采用裂解衣原体胞壁的方法是置衣原体样品在-20-4(TC冷冻，取出再室温溶解，再冷冻，如此反复冻融三次。PCR检测方法同上，结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>比较例2-2110份样品同上，采用常规采用裂解衣原体胞壁的方法是在样品中0.25%木瓜蛋白酶，置37匸，20分钟后，如上述方法作PCR检测，结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种高效裂解衣原体胞壁的方法，其特征在于将衣原体样品放置-80℃，10～12h；取出后放入预冷-50℃左右的真空杯中，维持负压5.5×10-1mbar，2-3h。2、按照权利要求1所述高效裂解衣原体胞壁的方法，其特征在于所述衣原体样品来源于鸡胚卵黄囊膜或细胞培养物。全文摘要一种高效裂解衣原体胞壁的方法，其特征在于将衣原体样品放置-80℃，10～12h；取出后放入预冷-50℃左右的真空杯中，维持负压5.5×10<sup>-1</sup>mbar，2-3h。本发明方法充分释放胞内物质，并保持其完整生物学活性。提高了分子生物检测方法检测衣原体感染的灵敏度和准确性。文档编号C12N1/06GK101285037SQ20071001093公开日2008年10月15日申请日期2007年4月12日优先权日2007年4月12日发明者吴勇敢,霜唐,忠张,李天宪,李永东,范兆军,陈绳亮申请人:中国科学院武汉病毒研究所