专利名称：一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化细胞的制备方法，特别是涉及一种以改性聚丙烯酰胺为载体固定化微生物细胞的制备方法。
背景技术：
微生物细胞固定化方法中，以包埋法最为常用。作为包埋载体，天然高分子多糖类的海藻酸钠和卡拉胶应用最多，它们具有固化、成型方便，对微生物毒性小及固定化密度高等优点。但它们抗微生物分解性能较差，机械强度较低。这两种载体的凝胶虽然可以用交联剂进行稳定化处理，但活性和传质性能又会下降。合成高分子化合物中常用的载体物质有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化树脂等。它们的突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定。但是聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大。尤其是聚丙烯酰胺作为微生物细胞包埋固定化载体，虽然其机械强度、化学稳定性、抗微生物分解性能及价格低廉等都优于其它合成高分子载体，但因其单体丙烯酰胺的细胞毒性、环境毒性、聚合反应时间长、聚合温度高等问题，严重影响了其在食品、制药、环保、新能源开发及化学合成等领域固定化微生物细胞或固定化酶的使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，该方法用单体丙烯酰胺合成一定分子量的改性聚丙烯酰胺后作为固定化载体，可快速制备改性聚丙烯酰胺固定化微生物细胞。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，该方法包括以下步骤1)改性聚丙烯酰胺的合成以丙烯酰胺为单体，以过硫酸铵为引发剂，以甲酸钠为链转移剂合成低分子量的聚丙烯酰胺；用甲醛在碱性条件下对低分子量的聚丙烯酰胺羟甲基化；使羟甲基化聚丙烯酰胺和丙烯酰胺在碱性条件下进行缩合反应得到改性聚丙烯酰胺；2)固定化微生物细胞的制备取改性聚丙烯酰胺水溶液与配制好的菌悬液充分混匀，加入交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和引发剂过硫酸铵，再加入催化剂四甲基乙二胺快速混匀，室温下静置数分钟后得到固定化细胞凝胶。
如上所述的一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，其载体改性聚丙烯酰胺的固含量为12.98％，其低分子量聚丙烯酰胺、甲醛、单体丙烯酰胺的质量比为1∶0.6∶0.6。
如上所述的一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，其细胞悬液加入量V/V为2％～3％，交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的加入量为0.7％～0.8％，引发剂过硫酸铵的加入量为0.3％～0.4％。
如上所述的一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，所述交联温度为室温，交联时间为3～5min。
本发明的优点与效果是
1.本发明的改性聚丙烯酰胺无毒，在室温时凝胶速度快，凝胶时温度低，可保持包埋微生物的活性。
2.在包埋浓度下改性聚丙烯酰胺对细胞活性几乎无影响，细胞相对活性达100％，而单体丙烯酰胺对细胞的毒性很大，细胞相对活性为52.9％。与单体丙烯酰胺法比较，改性聚丙烯酰胺法固定化细胞相对活性为77.6％，而单体丙烯酰胺法固定化细胞相对活性只有35.1％。
3.本发明的改性聚丙烯酰胺凝胶的吸水性和水解性低，使凝胶具有很好的稳定性和机械性能。改性聚丙烯酰胺固定化微生物细胞凝胶使用寿命长。
4.本发明的改性聚丙烯酰胺固定化方法工艺简单，成本低，可工业化生产。
具体实施例方式
苯酚降解菌NT-1的固定化方法1.改型聚丙烯酰胺法取固含量为12.98％的改性聚丙烯酰胺水溶液5mL，将配制好的苯酚降解菌NT-1的菌悬液(OD＝0.5)0.1mL与之充分混匀，加入0.0464gN，N′-亚甲基双丙烯酰胺和5％的过硫酸铵0.4mL混匀，再加入两滴四甲基乙二胺混匀，室温下静置3min～5min，得到固定化微生物细胞凝胶。将其切成粒径约为4mm×4mm×4mm的正方体小块，然后用蒸馏水冲洗三次备用。
2.聚丙烯酰胺法取丙烯酰胺0.2375g，加入5mL蒸馏水，取配制好苯酚降解菌NT-1的菌悬液0.1mL与之充分混匀，然后，加入N，N′-亚甲基双丙烯酰胺0.0125g，5％过硫酸铵0.1mL，四甲基乙二胺2滴，室温下静置3h。使用前将其切成粒径约为4mm×4mm×4mm的正方体小块，然后用蒸馏水清洗。
3.海藻酸钙法称取海藻酸钠0.2g，加入5mL蒸馏水，配制成4％的海藻酸钠溶液，取0.1mL苯酚降解菌NT-1的菌悬液与其充分混合后，用注射器滴入4％冰浴的CaCl2溶液中，将形成的固定化小球于室温放置1h后，用蒸馏水冲洗，再加入4％的CaCl2溶液于4℃冰箱固定24h，使用前用蒸馏水清洗小球(小球直径为4mm左右)。
4.聚乙烯醇-硼酸法称取聚乙烯醇0.4g，海藻酸钠0.15g，加入5mL蒸馏水，配制成8％聚乙烯醇与3％海藻酸钠的混合溶液，冷却至室温，取配制好的苯酚降解菌NT-1菌悬液0.1mL与之充分混匀。在配好的饱和硼酸水中加入等量的2％CaCl2溶液，用NaOH调节pH至7.4左右。最后，将硼酸混合液缓慢倒入聚乙烯醇混合液，无需搅拌，然后于4℃冰箱固定24h。使用前将其切成粒径约为4mm×4mm×4mm的正方体小块，用蒸馏水清洗备用。
降解苯酚实验将250mL三角瓶装苯酚含量为400mg/L的无机盐培养液50mL，加入上述包埋苯酚降解菌的凝胶或与该固定化细胞固定菌量相同的游离菌体，在30℃、120r/min的摇床上振荡培养，定时测定苯酚浓度，计算苯酚降解率。待苯酚降解率超过90％后，滤出固定化凝胶，用蒸馏水清洗后进行下一批次的苯酚降解实验。
实验结果表1四种固定化方法的比较
表2四种固定化凝胶的重复使用情况
表3改性聚丙烯酰胺与丙烯酰胺单体对微生物活性的影响
表4固定化细胞与游离细胞降解苯酚的比较
使用六批次后，改性聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺凝胶的机械强度基本无改变，而海藻酸钙凝胶和聚乙烯醇硼酸凝胶的机械强度发生了明显的变化，凝胶变软或吸水膨胀。将改性聚丙烯酰胺凝胶在自制的流化床中处理含酚废水，3周后凝胶的机械强度仍无改变。
权利要求
1.一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1)改性聚丙烯酰胺的合成以丙烯酰胺为单体，以过硫酸铵为引发剂，以甲酸钠为链转移剂合成低分子量的聚丙烯酰胺；用甲醛在碱性条件下对低分子量的聚丙烯酰胺羟甲基化；使羟甲基化聚丙烯酰胺和丙烯酰胺在碱性条件下进行缩合反应得到改性聚丙烯酰胺；2)固定化微生物细胞的制备取改性聚丙烯酰胺水溶液与配制好的菌悬液充分混匀，加入交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和引发剂过硫酸铵，再加入催化剂四甲基乙二胺快速混匀，室温下静置数分钟后得到固定化细胞凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，其特征在于，载体改性聚丙烯酰胺的固含量为12.98％，其低分子量聚丙烯酰胺、甲醛、单体丙烯酰胺的质量比为1∶0.6∶0.6。
3.根据权利要求1所述的一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，其特征在于，细胞悬液加入量V/V为2％～3％，交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的加入量为0.7％～0.8％，引发剂过硫酸铵的加入量为0.3％～0.4％。
4.根据权利要求1所述的一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，其特征在于，所述交联温度为室温，交联时间为3～5min。
全文摘要
一种改性聚丙烯酰胺固定化细胞的制备方法，涉及一种固定化细胞的制备方法，包括以下步骤1)改性聚丙烯酰胺的合成以丙烯酰胺为单体，以过硫酸铵为引发剂，以甲酸钠为链转移剂合成低分子量的聚丙烯酰胺；用甲醛对聚丙烯酰胺羟甲基化；使羟甲基化聚丙烯酰胺和丙烯酰胺进行缩合反应得到改性聚丙烯酰胺；2)固定化微生物细胞的制备取改性聚丙烯酰胺水溶液与配制好的菌悬液充分混匀，加入交联剂和引发剂，再加入催化剂四甲基乙二胺快速混匀，室温下静置数分钟后得到固定化细胞凝胶。该方法在室温时凝胶速度快，凝胶时温度低，可保持包埋微生物的活性。所制备的固定化微生物细胞凝胶可用于活细胞及酶的固定化。
文档编号C12N11/04GK101054575SQ20071001082
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月3日 优先权日2007年4月3日
发明者刘桂萍, 刘长风, 刘学贵, 张月澜 申请人:沈阳化工学院