专利名称：重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的合成方法，具体是一种重复利用活 细胞作为生物催化剂的手性生物合成方法。
技术背景生物催化剂的立体选择性使生物合成手性化合物在药物、食品、农业化学和 化妆品方面有着潜在的工业应用。利用活细胞作为生物催化剂不但可以避免制备 纯化酶的繁琐步骤，更为重要的是利用活细胞作为生物催化剂有利于多酶催化或 需要辅酶的生物转化过程。面包酵母因生长快、培养条件简单、是非病源微生物，且具有多种酶催化系 统而具有作为生物催化剂的潜在工业价值。利用活细胞代谢葡萄糖再生辅酶转化芳香酮合成手性芳香醇是经典例子，如式1所示的面包酵母为催化剂催化芳香酮苯乙酮还原制备手性芳香醇s-i-苯乙醇。S-1-phenylethanol R-1-phenylethanol式i如式2所示，利用面包酵母的脱羧酶对丙酮酸的脱羧反应和苯甲醛结合合成 手性苯基乙酰基原醇是工业上制备麻黄素前体的重要反应，该反应需要活细胞代 谢葡萄糖(glucose)产生丙酮酸作为催化反应的底物之一。Glu<pose O i
上述反应的特点是必须利用活细胞作为生物催化剂以便循环利用辅酶或利 用活细胞的代谢产物。而且这类反应都是以非极性或弱极性的有机化合物作为底 物/产物。高浓度的底物/产物将抑制甚至毒害微生物的生长和活性。这导致常规 的水溶液系统中生物转化过程的产物浓度很低而使其缺乏工业化价值。为了提高催化反应的效率，除采用催化剂工程技术外，介质工程已成为研究 的又一热点。其中水一有机溶剂两相分配系统被视为一种有效的手段，但其生物 相容性，尤其是具有中等极性的底物/产物的生物转化，是其工业化应用的限制 因素。非离子表面活性剂水溶液在温度高于某一温度时形成互不相溶的两相，这一 温度称为浊点。这一表面活性剂水溶液系统称为浊点系统。浊点系统中的溶质将 不均匀地分配于浊点系统的两相，利用这一性质而分离或浓縮溶质的技术称为浊 点萃取。底物、产物和生物催化剂在两相系统将不均匀地分配于系统的两相，其 中一相充当着底物的贮存库和产物的萃取剂，从而实现底物的原位添加和产物的 原位萃取，这一技术称为两相分配生物反应技术。浊点系统应用于酶催化反应或 生物转化过程的优势有非离子表面活性剂在操作温度下基本不挥发，环境友好； 系统具有特殊的微水环境结构，使酶、微生物保持了高度活性和稳定性；溶质在系统中分配的可调节因素多，操作弹性大；操作工艺和常规水一有机溶剂两相系 统基本一致，工业化基础好。经对现有技术文献的检索发现，Zhilong Wang， "The potential of cloud point system as a novel two-phase partitioning system for biotransformation. Applied microbiology and biotechnology. '， 2007, 75: 1-10.(王志龙."浊度系统作为新的两相分配系统应用于生物转化的潜力". 《应用微生物与生物技术》，2007， 75: 1-10)中介绍，在水-有机溶剂两相分 配系统的萃取生物转化过程中萃取极性产物和维持细胞的活性，但是往往难以同 时实现。在进一步的检索中，还没有发现于本发明关于浊度系统中萃取极性产物 生物转化的文献报道。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种重复利用活细胞作为生物 催化剂的手性生物合成方法。本发明利用浊点系统两相分配技术，实行在高底物 /产物浓度下，活细胞作为生物催化剂并重复利用的生物转化过程，以获得具有 手性结构的生物产品，如手性芳香醇、苯基乙酰基原醇等，从而提高过程的生产 效率。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体包括如下步骤 步骤一，构建由非离子表面活性剂与微生物培养基组成，或者由聚合物、非 离子表面活性剂与微生物培养基组成的浊点系统；步骤二，检测步骤一构建的浊点系统的生物相容性将步骤一中得到的浊点系统装入摇瓶中，接种新鲜面包酵母种子，然后添加 一定浓度的底物/产物，于摇床中培养，离心收获细胞并测定湿细胞重量，以湿 细胞重量测定在此底物/产物浓度范围内的生物相容性，并将测定具有生物相容 性的浊点系统用于步骤三的反应；步骤三，浊度系统中的活细胞微生物转化在微生物培养基中接种新鲜面包酵母种子装入摇瓶中，于摇床中培养，离心 收获细胞并测定湿细胞质量，将收获新鲜细胞加入步骤一中得到的、且经步骤二 检测后具有生物相容性的浊点系统中，添加底物苯乙酮或苯甲醛，在摇床中反应后，离心去除细胞，取清液。所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂、多元醇系非离 子表面活性剂、聚醚型非离子表面活性剂、烷醇酰胺系非离子表面活性剂中的任 意一种或者组合。所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂，包括脂肪醇聚氧乙烯醚(AE0)、脂 肪酸聚氧乙烯酯、烷基酚聚氧乙烯醚(APE0)、聚氧乙烯酰胺、聚氧乙烯脂肪胺、 聚氧乙烯醇、吐温等。其中烷基酚聚氧乙烯醚类包括Triton X-100、 Triton X-114 (辛基酚聚氧乙烯醚类)；其中聚氧乙烯醇类包括Brij (买译)30、 Brij35、 Bri j56、 C12E7;聚氧乙烯醚类包括Tween(吐温)20、 Tween40、 Tween60、 Tween80、 Span (司盘)20、 Span40、 Span60、 Span80;以上化合物都可以直接购买得到。所述的多元醇系非离子表面活性剂，包括脂肪酸乙二醇酯、单脂肪酸甘油酯 (单甘酯)、季戊四醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。所述的聚醚型非离子表面活性剂，包括环氧乙烷和环氧丙垸嵌段共聚物。所述的烷醇酰胺系非离子表面活性剂包括脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇 酰胺、氧化胺和烷基多苷(APG)等。所述非离子表面活性剂与微生物培养基组成的浊点系统，具体为通常非离
子表面活性剂对微生物细胞具有生理毒性，如Triton X-45对微生物具有毒性。 混合的非离子表面活性剂Triton X-114与Triton X-45的体积比大于6: 4 ， 与微生物培养基按体积比l: IO组成浊点系统。所述由聚合物、非离子表面活性剂与微生物培养基组成的浊点系统，具体为 聚乙二醇(PEG)浓度大于8g/100ml和Triton X-100浓度大于7. 5 ml/100ml与微生物培养基也能组成浊点系统。所述微生物培养基，其组成为100ml水中含2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡 萄糖或9g葡萄糖、lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0. 3 g KH2P04、 0. 2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。所述检测步骤一构建的浊点系统的生物相容性，具体为将20-50ml浊点系 统装入250ml的摇瓶中，接种新鲜面包酵母种子，然后添加浓度小于1% (v/v) 的底物或浓度小于0.6% (v/v)的产物，于30°C， 200rpm的摇床中培养1天， 离心收获细胞并测定湿细胞重量。以湿细胞重量测定在此底物/产物浓度范围内 的生物相容性。所述浊度系统中的活细胞微生物转化，具体为在20ml微生物培养基中接 种新鲜面包酵母种子装入250ml摇瓶中，于30°C， 200rpm的摇床中培养1天， 离心收获细胞并测定湿细胞质量。将收获新鲜细胞按浓度2-20% (g/ml)加入上 述的浊点系统中，添加浓度为O. 1-P/。(v/V)底物苯乙酮或苯甲醛，在30。C， 200rpm 的摇床中反应8-24小时后，离心去除细胞，取清液用HPLC分析产物浓度，由于 微生物酶催化的立体选择性，产物的光学纯度用GC分析表明ee值在95%以上。本发明采用活细胞作为生物催化剂的目的在于利用其多酶系统或辅酶系统。本发明开采用浊点系统应用于生物转化的目的在于利用解除底物/产物，尤 其是极性相对较强的底物/产物，对生物催化剂的抑制和毒害作用。本发明解除底物/产物对生物催化剂抑制的目的在于实现高底物/产物浓度 下的生物转化过程和实现全细胞生物催化剂的重复利用。本发明实现高底物/产物浓度下的生物转化和重复利用细胞作为生物催化剂 的目的在于降低生物合成手性化学品的生产成本。如s-l-苯乙醇，苯基乙酰基 原醇。本发明优先使用了混合的非离子表面活性剂Triton X系列和聚乙二醇 (PEG)系列多聚物诱导的非离子表面活性剂Triton X系列获得了具有生物相容
性的浊点系统。本发明采用浊点系统两相分配反应技术，实现了在高底物/产物浓度下的活 细胞生物催化。活细胞生物催化有利于辅酶循环和利用细胞的代谢产物，高浓度 的底物反应和对极性相对较强的产物的原位萃取有利于实现高产物浓度的生物 转化，推动其产业化进程。然而，由于上述反应都要利用葡萄糖的代谢再生辅酶 或产生辅底物，应用本技术提高目标产物的浓度将需要进一步优化其过程技术。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。本发明实施的具体条件构建由非离子表面活性剂与微生物培养基组成，或者由聚合物、非离子表面活性剂与微生物培养基组成生物相容性的浊点系统，如非离子表面活性剂Triton X-45在水溶液中存在Krafft点和浊点。在温度低于其Krafft点时形成混浊的 不分相的分散体系。在温度高于其浊点时溶液出现混浊并出现分相现象。不同体 积比的非离子表面活性剂Triton X-114与Triton X-45混合非离子表面活性剂 水溶液有分相行为。在低Triton X-45份率时，混合表面活性剂溶液的Krafft 点较室温低，其浊点温度随其分率的增加而降低。在高Triton X-45份率时，室 温下是混浊且不分相的，这表明其Krafft点高于室温。在低Triton X-45分率 的TritonX-45和Triton X-114混合常规培养液可以获得浊点温度低于培养温 度的浊点系统。生物相容性由接种酵母细胞后20ml表面活性剂-培养液混合系统 在30°C摇床培养2天的细胞量(湿细胞重)测定。只要当浊点低于培养温度30°C 时，表面活性剂溶液具有生物相容性。采用一定浓度的PEG溶液滴定一定浓度的Triton X-100或者采用一定浓度 的Triton X-100溶液滴定一定浓度的PEG，类似于双水相系统，在一定浓度范 围内，PEG和Triton X-100形成单相的稳定的水溶液。而在高于一定的浓度范 围内，PEG和Triton X-100在水溶液中形成两相分配体系，其中一相富含非离 子表面活性剂，而另一相富含多聚物。有机溶剂-水溶液组成的两相分^体系统 的生物相容性随有机溶剂的极性降低而升高，即微生物在极性有机溶剂中不具有 生物相容性。而浊点系统和PEG诱导的浊点系统虽极性较强但同时具有生物相容性。微生物转化的背景技术提及的式1和2所示的反应都存在产物/底物对微生 物活性的抑制，在获得上述生物相容性的浊点系统和PEG诱导浊点系统中进行微 生物转化，浊点系统能提高面包酵母细胞生长对毒性底物的耐受能力。在PEG诱导的Triton X-100浊度系统进一步提高了式2中微生物生长耐受 有机底物的浓度。通过浊点系统的两性分配解决了常规水溶液中底物/产物抑制， 维持了高浓度下的微生物全细胞的生物反应活性。利用酵母细胞内酶的立体选择性进行手性生物合成，在高底物浓度下活细胞 能再生辅酶并且活细胞作为生物催化剂可以进一步重复利用，并且可以实现对相 对极性较高的产物的原位萃取以解除产物抑制。从而实现高底物浓度下活细胞生 物转化获得高浓度的手性产物。下列实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件或按照制造厂 商所建议的条件。 实施例1Triton X-45和Triton X-114比例为1:，的混合表面活性剂溶液，与培养 基按体积比为l: 10组成体积为22ml的浊点系统，培养基组成为100ml水中含 2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖或9g葡萄糖、lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0. 3 g KH2P04、 0.2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。将浊点系统装入 50ml的摇瓶中接种酵母细胞在30°C， 200rpm的摇床中培养2天，离心后测定 湿细胞重量为1.7g。这表明该浊点系统具有生物相容性。实施例2培养基组成为100ml水中含2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖或9g葡萄糖、 lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0. 3 g KH2P04、 0. 2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。在100ml培养基中加入PEG 20000 8g、表面活性剂Triton X-100 7.5ml 组成浊点系统。将20ml浊点系统装入50ml的摇瓶中接种酵母细胞在30°C， 200rpm的摇床中培养2天，离心后测定湿细胞重量为1. 5g。这表明该浊点系统 具有生物相容性。实施例3在实施例1中的浊点系统中，将22ml浊点系统装入50ml的摇瓶中接种酵母
细胞，并添加底物苯乙酮1% (v/v)浓度，在30°C， 200rpm的摇床中培养2天， 离心后测定湿细胞重量为1.2g。这表明浊点系统能耐受高浓度的毒性底物。 实施例4在实施例1中的浊点系统中，将22ml浊点系统装入50ml的摇瓶中接种酵母 细胞，并添加产物1-苯乙醇0.6 % (v/v)浓度，在30t， 200rpm的摇床中培 养2天，离心后测定湿细胞重量为1.3g。这表明浊点系统能耐受高浓度的毒性产物。实施例5在实施例2中的浊点系统中，将20ml浊点系统装入50ml的摇瓶中接种酵母 细胞，并添加底物苯甲醛0. 3 % (v/v)浓度，在30°C， 200rpm的摇床中培养2 天，离心后测定湿细胞重量为1.2g。这表明浊点系统能耐受高浓度的毒性底物。实施例6100 ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉的培养液中，加入混 合表面活性剂10ml，其中TritonX-45 : Triton X-114=1: 9, 组成浊点系统。 加入新鲜的湿酵母20g，底物苯乙酮2ml。装入500ml摇瓶中，在30°C、 280r卿 的摇床中反应1天。测定转化液中苯乙醇的浓度为0.4 mM。本实施例表明浊点 系统中在非常高的底物浓度下也存在底物抑制现象。实施例7100 ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉的培养液中，加入混 合表面活性剂10ml，其中Triton X-45 : Triton X-114=1: 9， 组成浊点系统。 加入新鲜的湿酵母20g，底物苯乙酮0. 8 ml。装入500ml摇瓶中，在30°C、 280rmp 的摇床中反应1天。测定转化液中苯乙醇的浓度为0.6 mM。本实施例和实例6 比较表明在底物浓度低于其抑制生物催化剂活性浓度内有利于获得高产物浓度。实施例8100ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉、1.07g拧檬酸、3. 5g N&HP04的培养液中，加入混合表面活性剂10 ml，其中Triton X-45 : Triton X-114=l: 9，组成浊点系统。加入新鲜的湿酵母20g，底物苯乙酮1.2 ml。装 入500ml摇瓶中，在30t、 280rmp的摇床中反应1天。测定转化液中苯乙醇的 浓度为0. 72 mM。本实施例和实例6比较表明高底物浓度有利于获得高产物浓度。实施例9 100 ml水溶液中含20g葡萄糖、2g蛋白胨、2g酵母粉的培养液中，加入混 合表面活性剂10ml，其中TritonX-45 : Triton X-114=1: 9， 组成浊点系统。 加入新鲜的湿酵母20g，底物苯乙酮1. 4ml。装入500ral摇瓶中，在30°C、 280rmp 的摇床中反应1天后再次加入葡萄糖20g后在相同条件下再转化1天，测定转化 液中苯乙醇的浓度为1.2 raM。且微生物消耗了大部分的葡萄糖。本实施例表明 浊点系统中高底物浓度下微生物作为生物催化剂长时间保持了再生辅酶的能力。实施例10100 ml水溶液中含3 g葡萄糖、lg酵母粉、2g蛋白胨、0. 3 g KH2P04、 0. 2g Na異、0. lg MgS04 、 0.005g CaCl2和0.6ml乙醛的培养液中，加入表面活性 剂Triton X-100 7.5ml， PEG 20000 8g组成PEG诱导的浊点系统。在浊点系统 中接种酵母细胞3g，加入0. 8ml底物苯甲醛。装入500ml摇瓶中，在30。C、280r卿 的摇床中培养并继续反应24小时。测定苯基乙酰基原醇的浓度为2.8g/L，且浊 点系统中富含表面活性剂相和富含PEG相产物浓度之比为3: 1。反应系统中的 葡萄糖几乎全部消耗。本实施例表明PEG诱导浊点系统能在较高底物浓度下微生 物保持了代谢活性而使反应继续进行，而且能萃取极性相对较强的产物，从而使 产物浓度有明显提高。实施例11100 ml水溶液中含3 g葡萄糖、lg酵母粉、2g蛋白胨、1. 07 g柠檬酸、3. 5g Na風、0. lg MgS04 、 0.005g CaCl2和0.6ml乙醛的培养液中，加入表面活性 剂Triton X-100 7.5ml， PEG 20000 8g组成PEG诱导的浊点系统。在浊点系统 中接种酵母细胞4g，加入lml底物苯甲醛，装入500ml摇瓶中，在30°C、 280rmp 的摇床中培养并继续反应24小时。测定苯基乙酰基原醇的浓度为5.2g/L。这表 明在高底物浓度下，浊度系统能实现高产物浓度的转化。
权利要求
1.一种重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤步骤一，构建由非离子表面活性剂与微生物培养基组成，或者由聚合物、非离子表面活性剂与微生物培养基组成的浊点系统；步骤二，检测步骤一构建的浊点系统的生物相容性将步骤一中得到的浊点系统装入摇瓶中，接种新鲜面包酵母种子，然后产物，于摇床中培，离心收获细胞并测定湿细胞重量，以湿细胞重量测定在此底物/产物浓度范围内的生物相容性，并将测定具有生物相容性的浊点系统用于步骤三的反应；；步骤三，浊度系统中的活细胞微生物转化在微生物培养基中接种新鲜面包酵母种子装入摇瓶中，于摇床中培养，离心收获细胞并测定湿细胞质量，将收获新鲜细胞加入步骤一中得到的、且经步骤二检测后具有生物相容性的浊点系统中，添加底物苯乙酮或苯甲醛，在摇床中反应后，离心去除细胞，取清液。
2. 根据权利要求1所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂、多元 醇系非离子表面活性剂、聚醚型非离子表面活性剂、垸醇酰胺系非离子表面活性剂 中的任意一种或者组合。
3. 根据权利要求2所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂，包括脂肪醇聚氧乙烯醚、脂 肪酸聚氧乙烯酯、烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酰胺、聚氧乙烯脂肪胺、聚氧乙烯 醇、吐温。
4. 根据权利要求3所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述垸基酚聚氧乙烯醚类包括Triton X-IOO、 Triton X-114;其中 聚氧乙烯醇类包括买译30、买译35、买译56、 C12E7;聚氧乙烯醚类包括吐温20、 吐温40、吐温60、吐温80、司盘20、司盘40、司盘60、司盘80。
5. 根据权利要求2所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述的多元醇系非离子表面活性剂，包括脂肪酸乙二醇酯、单脂肪 酸甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯；所述的聚醚 型非离子表面活性剂，包括环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物；所述的垸醇酰胺系非 离子表面活性剂包括脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、氧化胺和烷基多苷。
6. 根据权利要求1所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述浊点系统由非离子表面活性剂与微生物培养基组成，具体为-非离子表面活性剂Triton X-114与Triton X-45按照体积比大于6: 4混合，然后 与微生物培养基按体积比l: IO组成浊点系统。
7. 根据权利要求1所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述浊点系统由聚合物、非离子表面活性剂与微生物培养基组成， 具体为采用浓度大于8g/100ml的聚乙二醇和浓度大于7.5 ml/100ml的Triton X-100与微生物培养基组成浊点系统。
8. 根据权利要求1或6或7所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物 合成方法，其特征是，所述微生物培养基，其组成为100ml水中含2g蛋白胨、2g 酵母粉、2g葡萄糖或9g葡萄糖、lg酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0.3gK跳、0. 2g Na2HP04、 0. lg MgS04和0. 005g CaCl2。
9. 根据权利要求1所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述采用浊点系统提高微生物对底物/产物的耐受性，具体为将 20-50ml浊点系统装入250ml的摇瓶中，接种新鲜面包酵母种子，然后添加浓度小 于1%体积比的底物或浓度小于0.6%体积比的产物，于30°C， 200rpm的摇床中 培养1天，离心收获细胞并测定湿细胞重量，以湿细胞重量测定在此底物/产物浓 度范围内的生物相容性。
10. 根据权利要求1所述的重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方 法，其特征是，所述浊度系统中的活细胞微生物转化，具体为在20ml微生物培 养基中接种新鲜面包酵母种子装入250ml摇瓶中，于30t， 200rpm的摇床中培养1 天，离心收获细胞并测定湿细胞质量，将收获新鲜细胞按g/ml浓度2-20%加入上述 的浊点系统中，添加浓度为0. 1-1%体积比底物苯乙酮或苯甲醛，在30t， 200rpm的 摇床中反应8-24小时后，离心收获细胞后重复用于生物转化反应过程。
全文摘要
一种重复利用活细胞作为生物催化剂的手性生物合成方法，属于生物工程技术领域。步骤为构建由非离子表面活性剂与微生物培养基组成，或者由聚合物、非离子表面活性剂与微生物培养基组成的浊点系统；将得到的浊点系统装入摇瓶中，接种新鲜面包酵母种子，然后产物，于摇床中培，离心收获细胞并测定湿细胞重量，以湿细胞重量测定在此底物/产物浓度范围内的生物相容性；在微生物培养基中接种新鲜面包酵母种子装入摇瓶中，于摇床中培养，离心收获细胞并测定湿细胞质量，将收获新鲜细胞加入经步骤二检测后具有生物相容性的浊点系统中，添加底物反应。本发明实现了高底物/产物浓度下活细胞作为生物催化剂的重复利用。
文档编号C12P1/00GK101153286SQ200710045630
公开日2008年4月2日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者张文智, 丽 王, 王志龙, 齐瀚实 申请人:上海交通大学