检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量pcr方法

专利名称：：检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量pcr方法
技术领域：
：本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其涉及一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：猪伪狂犬病毒(Porcinepseudorabiesvirus,PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)、II型猪圆环病毒(Porcinecircoviruses，PCV2)、猪瘟病毒(Hogcholeravirus，HCV)等都属于猪呼吸道病和繁殖障碍综合症病原，并且4种病毒常出现混合感染。PCV-2还与猪呼吸道病综合症(Porcinerespiratorydiseasecomplex,PRDC)、断乳仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(Porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)等均具有密切的相关性，是引起多种综合症的重要原发病原(SegalesJ,AllanGM，DomingoM.Porcinecircovirusdiseases.AnimHealthResRev.2005Dec;6(2):119-42;LipejZ,SegalesJ,ToplakI，etal.Postweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)inpigsinCroatia:detectionandcharacterisationofporcinecircovirustype2(PCV2).ActaVetHung.2005;53(3):385國96;SiposW，DuvigneauJC,PietschmannP,etal.Porcinedermatitisandnephropathysyndrome(PDNS)isassociatedwithasystemiccytokineexpressionprofileindicativeofproinflammationandaThlbias.VetImmunolImmunopathol.2005Sep15;107(3-4):303-13;KimJ，ChungHK,ChaeC.Associationofporcinecircovirus2withporcinerespiratorydiseasecomplex.VetJ.2003Nov;166(3):251-6.)，PRV引起乳猪患病死亡率高达100。/。。反刍动物发病无药治疗，均已死亡告终；猪瘟遍布于全世界，具有高度接触传染性，是国际兽医局明列的A类15种法定传染病之一；PPV于1966年进行猪瘟病毒组织培养时发现的，是猪繁殖障碍的重要病原。目前，检测各种病毒的方法很多，如检测PRV潜伏感染的方法有血清学试验、体内潜伏病毒的激活与检测、组织块培养和共培养技术、核酸杂交和常规PCR检测技术，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染和EB等对操作者的危害。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效方法(KimJ,ChimgHK，ChaeC.Associationofporcinecircovirus2withporcinerespiratorydiseasecomplex.VetJ.2003Nov;166(3):251-6.)，实时荧光定量PCR比较以往的荧光抗体试验FA、IPMA法、以及病毒分离法，具有更加快速、敏感、安全的特点。其检测的灵敏度优于传统检测方法(KimJ,ChungHK，ChaeC.Associationofporcinecircovirus2withporcinerespiratorydiseasecomplex.VetJ.2003Nov;166(3):251-6.)，比较PCR法敏感性达10-100倍(GunsonRN,CollinsTC，CarmanWRPracticalexperienceofhighthroughputrealtimePCRintheroutinediagnosticvirologysetting.JClinVirol.2006Apr;35(4):355-67.Epub2006Feb7)。建立4种病毒同时快速、敏感及准确定量的方法，对各种病原诊断及各种病原病因学研究具有重要的意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，该方法能快速、敏感、特异地检测对经济危害严重的四种病毒，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可应用四种病毒感染的前期诊断。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，包括制备4种病毒的标准质粒并建立标准曲线，确定判定样品阳性或阴性的标准，设计检测引物进行样品的荧光定量PCR扩增并获得样品的Tm值，将所获得的Tm值用所确定的判定标准评判样品的阳性或阴性等步骤，其中，所述的标准曲线的建立方法如下(1)按照常规方法分别提取猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒的核酸；(2)以SEQIDNO:l和SEQIDNO:2为引物，以所提取的II型猪圆环病毒(PCV2)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得II型猪圆环病毒标准质粒；以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4为引物，以所提取的猪细小病毒(PPV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪细小病毒标准质粒；以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6为引物，以所提取的猪伪狂犬病毒(PRV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪伪狂犬病毒标准质粒；以SEQIDNO:7和SEQIDNO:8为引物，以所提取的猪瘟病毒(HCV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪瘟病毒标准质粒；(3)将步骤(2)所制备的4种标准质粒分别作IO倍系列稀释，以稀释液为模板，进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，经计算机软件Rotor-gene6.0生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线。所述的确定判定阳性或阴性的标准是在CT值在35循环内；Tm值分别为PCV-2:86.69士0.21;PPV:79.97士0.15;PRV:88.56士0.15;HCV:84.61±0.16。所述的检测引物为检测II型猪圆环病毒(PCV2)的引物为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10;检测猪细小病毒(PPV)的引物为SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12;检测猪伪狂犬病毒(PRV)的引物为SEQIDNO:B和SEQIDNO:14;检测猪瘟病毒(HCV)的引物为SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。优选的，所述检测II型猪圆环病毒的标准曲线是图3所示；检测猪细小病毒病毒的标准曲线是图4所示；检测猪伪狂犬病毒的标准曲线是图5所示；检测猪瘟病毒的标准曲线是图6所示。本发明方法(SyMuReTi-PCR)能高敏感、特异、迅速简便地同时检测PRV、PPV、PCV-2、HC。在构建引物和检测引物设计上，在GENEBANK下载核酸序列，分别选取PRV、PPV、PCV-2、HC具有代表性gE、VP2、ORF2、E2基因的保守区域设计构建引物和检测引物引物，NCBI中BLAST中比对，发现PCV-2与195株PCV-2分离毒核酸具有100%的同源性，扩增产物135nt与PCV-2的100株分离毒核酸100y。同源性，未见点突变，且与PCV-1无任何同源；HC检测引物与100株毒株100y。同源性；PPV检测引物和67株毒株有100W同源；PRV跟其他病毒无任何同原。检测引物设计的保守性决定了样品检测定性的特异性及稳定性，同时支持SyMuReTi-PCR方法具有良好的线性关系；继而决定了定量的精确性。本发明方法(SyMuReTi-PCR)检测PCV-2的方法中应用SYBRGREEN荧光染料作为标记物，因其成本较低，更适用于兽医病原的检测；在PCR反应体系中，加入适量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子发射的荧光信号检测不到，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。因此其应用稳定性较好，并不会随着病毒核酸序列发生点变异而出现检测受限。本发明同时检测4种病毒方法(SyMuReTi-PCR)具有良好的特异性、敏感性及稳定性。同时检测4种病毒无交叉反应，判定SyMuReTi-PCR同时检测4种病毒方法特异性Tm值应用统计学软件来判定是否显著不显著；批间及批内重复性试验表明CV都小于2y。均在稳定范围内；4种细胞培养病毒敏感度都高于普通PCR100倍，4种不同细胞毒检测的最低极限不同,PCV-2检测到0.00001TCID5()、PPV检测到0.001TCIDs。、PRV检测到0.01TCIDs。、HC检测到0.1TCIDs。，这与细胞毒核酸的特性、细胞毒致病性及培养特性密切相关，如PCV-2有的不使细胞致病，检测的最低极限高，并且3种DNA病毒是应用煮沸法不提核酸的过程，不考虑损失率问题，所以3种DNA病毒检测的最低极限高于HC。所以SyMuReTi-PCR具有操作更为简便、灵敏度更高、且可以有效避免普通PCR污染的缺陷等优点。本发明方法可在1.5hr内完成。可见，本方法应用于现地临床样品的检测具有良好的前景。应用本发明方法(SyMuReTi-PCR)对实验攻毒动物的脏器定量检测发现，不同的脏器病毒分布的量差别较大。在腹股沟淋巴结病毒分布量较大，为l()Scopies/ul，在十二指肠中分布较少，为7个拷贝/ul。可见通过本发明SyReTi-PCR方法可以应用于实验研究，评估病毒感染程度、监测病毒感染水平，进一步探讨病毒的致病性，进行病因学的研究。总之，本发明所建立的SyMuReTi-PCR检测各种病原的方法具有良好的特异7性、敏感性和稳定性，可以应用于临床的病原诊断及试验研究中的病因学研究。图l琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。l，MarkerDL2000;2，PCV的PCR扩增产物792bp;3，PCV的阴性对照；4，MarkerDL2000;5，PRV的阴性对照；6,PRV的PCR扩增产物265bp;7，MarkerDL2000;8，PPV的PCR扩增产物764bp;9，PPV的阴性对照；IO，HCV的阴性对照；ll，HCV的PCR扩增产物303bp;12,MarkerDL2000。图2琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒标准品。l,MarkerDL2000;2,质粒PCV的PCR扩增产物792bp;3，质粒PCV的阴性对照；4,MarkerDL2000;5，质粒PRV的阴性对照；6，质粒PRV的PCR扩增产物265bp;7，MarkerDL2000;8,质粒PPV的PCR扩增产物764bp;9，质粒PPV的阴性对照；IO，质粒HC的阴性对照；ll,质粒HCV的PCR扩增产物303bp;12，MarkerDL2000.图3PCV-2的标准曲线。图4PPV的标准曲线。图5PRV的标准曲线。图6HCV的标准曲线。图7SyMuReTi-PCR检测4种病毒的特异性试验结果。为溶解曲线的负一次微分曲线，X轴代表溶解温度，Y轴代表荧光信号值与温度的求导；BinA为PPV的Tm值；BinB为HC的Tm值；BinC为PCV-2的Tm值；BinD为PRV的Tm值。以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。具体实施方式试验材料1.1毒株II型猪圆环病毒(Porcinecircoviruses，PCV2)、猪伪狂犬病毒(Porcinepseudorabiesvirus,PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、猪瘟病毒(Hogcholeravirus，HCV)各l株；1.2待检样品13份脏器采集自试验猪(由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘长明教授提供)；47份病料分别自黑龙江、吉林、河南、湖南等地的猪场采集；1.3试齐UpMD18國T载体、SYBRPremixExTaqTM(PerfectRealTime)、EASYDilution(TOKARA);质粒小提试剂盒(天为时代)；PlasmidMiniprepKit(AXYGEN);inVitroTranscriptionT7Kit、DNaseI(TOKARA);TRlzolRLSReagent、反转录酶(Invitrogen)。1.4仪器Rotor-gene3000定量PCR仪；EppendorfBiophotometer。实施例l标准质粒制备1目的片段的制备按照常规方法提取PRV、PPV、PCV-2、HCV的核酸，将核酸储存于-2(TC备用。设计引物，应用OLIG06.24，根据GENEBANK中的核酸序列进行比对，设计引物(表l)。以提取的PRV、PPV、PCV-2、HCV病毒核酸作为模板，以表1的引物进行PCR扩增，预计扩增产物长度为265bp、764bp、792bp303bp。将获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图l。_表l扩增目标基因的引物对序列_VirusTargetgenePrimersequence(5'-3')Expectedproduct(bp)PCV-2构建ORF2ORF2-F15隱GGCGAGGAGGGTAATGAG-3(SEQIDNO:l)ORF2-R5-TGGAAATTCAGGGCATGG-3(SEQIDNO:2)792PPV构建VP2VP2-F15-TCAATACTTGGGGGAGGG-3(SEQIDNO:3)VP2—Rl5-GTGTTCCTGGGTGTTGGTC-3(SEQIDNO:4)754PRV构建gEgE-Fl5-GGCATCGGCGACTACCTG-3(SEQIDNO:5)gE-Rl5-AGAAGAGCTGCGAGTGGA懇3(SEQIDNO:6)265HC构建E2gE2-Fl5-TGCAACTGAATGACGGGAC-3(SEQIDNO:7)_gE2-Rl5-CTATAACACCCGTCCACCC-3(SE(jIDNO:8)_3032标准质粒的制备按照PlasmidMiniprepKi漲作方法回收目的片段，将回收产物连接到pMD18-T载体上，通过大肠杆菌DH5a感受态转化，挑取白色菌落，鉴定，阳性菌增殖，提取质粒DNA，作为实时荧光定量PCR检测四种病毒的标准质粒。将265bp、764bp、792bp303bp的扩增产物克隆于T-Vector,制备标准品。经过转化、阳性菌筛选、鉴定，表明获得了含有目的片段的质粒T-PRV、T-PPV、T-PCV-2、T-HCV，结果见图2。实施例2SyMuReTi-PCR检测4种病毒方法的建立1.1四种病毒标准质粒的稀释应用EppendorfBiophotometer定量标准质粒为4-97xl012Copies尔l、3.44x1012Copies//tl、8.18x1012Copies//il、7.98x1012Copies//xl，以EASYDilution稀释液将标准品质粒按照1.0xl()81.0x101Copies//dIO倍稀释，-2(TC保存。1.2检测引物设计将实施例l中克隆的目的基因测序，根据测定的序列，应用OLIG06.24设计四对特异引物(表2)。表2扩增目标基因的引物对序列VirusTargetgenePrimersequence(5，-3，)Expectedproduct(bp)PCV-2检测ORF2ORF2匿F25-ATTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3(SEQIDNO:9)ORF2-R25-CTTGTTGGAGAGCGGGAGTC_3(SEGIDNO:10)135PPV检测VP2VP2-F25-GGGACAAATGGTACAAGA-3(SEQIDNO:11)VP2-R25-TTTCTGTCATGTTGTTGG-3(SEQIDNO:12)128PRV检测gEgE-F25-GAGCCGCCCATCGTCACCC-3(SEQIDNO:13)gE-R25-CCACCGCCACAAAGAACAC-3(SEpIDNO:14)130HC检测E2gE2-F25-TGCAACTGAATGACGGGAC-3(SEQIDNO:15)gE2-R25-GCCAAACACCTCCTACTGACCAC-3(SE(^IDNO:16)921.3SyMuReTi-PCR在AxygenScientificQuality离心管(200/nl)中依次加入灭菌无离子水9.5/il、二甲基亚砜ljul、表2的4对引物各0.5/xl、不同离心管中分别加入不同稀释度的不同病毒的标准品l/il、SYBRPremixExTaqTM12.5/il，反应体系25ul。每种病毒的标准品按高稀释度到底稀释度的顺序放在一排，便于分析。反应参数为95°C，10sec;95°C,5sec、60°C,20sec，45个循环。1.4建立SyMuReTi-PCR检测4种病毒的标准曲线用含有PRV、PPV、HC、PCV-2目的片段的克隆质粒作为标准品，将PRV、PPV、HC、PCV-2质粒分别作10倍系列稀释，1.0x1081.0x10Copies/pd、1.0xl081.0xl02Copies/pd、1.0xl0s1.0x10Copies/jLd、1.0xl091.0xl0Copies//xl作为模板，进行实时荧光定量PCR。Rotor-gene3000定量PCR仪采集荧光信号，经计算机软件Rotor-gene6.0将自动生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线(图3-6)。在分析其中一种标准曲线时，用Rotor-gene6.0软件将其他三种病毒的标准品和样品都隐藏，这样就可以在不同的界面分析四种病毒的标准曲线。经分析PCV标准品的9个稀释点均在一条直线上，表明当基因拷贝数在10910范围内，检测域值与拷贝数之间均呈良好线性关系,回归分析显示，二者相关系数为R2〉0.999，扩增效率达到97%;PRV标准品的8个稀释点均在一条直线上，并且当基因拷贝数在108102范围内，检测临界循环数(CT)与拷贝数之间均呈良好线性关系，回归分析显示，二者相关系数为R2〉0.996,扩增效率达到93%;HCV标准品8个稀释点均在一条直线上，二者相关系数为R、0.996;PPV标准品按照6个稀释度均在一条直线上，二者相关系数为R、0.994，扩增效率达到99%。试验例3本发明SyMiiReTi-PCR方法检澜4种病毒敏感性试验PK-15细胞培养的PCV-2自1(^TCIDso10—6TCID5()系列10倍稀释，PRV自1(yTCID5o10-6TCID5()系列10倍稀释，系列10倍稀释，PPV自2i血凝价2—6血凝价系列10倍稀释和HC自10iTCID5。l(^TCID5。系列10倍稀释，三种DNA病毒直接煮沸5分钟，RNA病毒提取核酸,反转录.分别进行定量PCR、普通PCR检测敏感度，比较敏感性，结果见表3。试验结果表明，本发明定量检测方法的敏感性高于普通PCR约10-100倍。表3SyMuReTi-PCR检领!]4种病毒的敏感性病毒的稀释度PCV-2PPV*PRVHCVSMRT-PCR常规PCRSMRT-PCR常规PCRSMRT-PCR常规PCRSMRT-PCR常规PCRiOTCID50++++++++TCIDw++++++++O.lTClDw+++++—十-0.01TCID50+++++---O.OOITCID50+++-----0.0001TCID5+-_-----0.00001TCID50+-------0.000001TC1D5————一—注PPV^^是以同等稀释度的血凝价；+:阳性；一阴性。TCIDso为半数细胞培养物感染量。Note:+:Positive;-:Negative.TCID50Tissuecultureinfectiousdose试验例4本发明SyMuReTi-PCR检測4种病毒的特异性试验将PRV的引物与、PPV、HCV、PCV-2、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；PPV的引物与PRV、HCV、PCV-2、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；HC的引物与PRV、PPV、PCV-2、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；PCV-2的引物与PRV、PPV、、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；共同进行实时荧光定量PCR特异性检测试验。特异性试验结果显示4种病毒的阳性样品各2份DNA/cDNA标准质粒均有特异性扩增，并且溶解曲线的峰值单一；而用4种引物分别扩增的除自身之外的3种细胞培养病毒、PRRSV、SIV无扩增的荧光信号，无CT值，无溶解曲线的峰值(图3)。特异性试验结果表明SRT-PCR特异性良好。4种病毒检测的特异性可以通过同一界面对4种病毒的目的基因Tm来值判断是否是特异性扩增(表5)，从图3可见BinA、BiiiB、BinC、BinD分别为PPV、HC、PCV-2、PRV的Tm。PPV、HC、PCV-2、PRV的Tm范围是通过100份阳性样品的Tm值，再用统计学方法计算出平均数和标准偏差，所得范围PPV为79.82-80.12、HC为84.45-84.77、PCV-2为86.48-86.90、PRV为88.41-88.71(表4)。表4溶解曲线的Tm值PCV-2PPVPRVHCM土SDM土SDM土SDM±SDTm86.69±0.2179.97±0.1588.56±0.1584.61±0.16注；M为平均数；SD为标准偏差；Tm为溶解温度。表5SyMuReTi-PCR检测4种病毒的特异性PrimersPCV-2PrimersPPVPrimersPRVp"隨sHCVPCV-2*PPV*PRV*—一+HCV*—一—SIV*——-PRRSV*_—-YL544124+—L訓+—4Y1104—+-D45-+D46--D45xiao——注标*是细胞培养病毒；+:阳性；一阴性;YL544124、L1001、Y1104、D45、D46、D45xmo为待检阳性样品。Note:*isvirusofcell;+:Positive;-:Negative;YL544124,LIOOI,Y1104，D45，D46,D45xiaoissample.试验例5本发明SyMiiReTi-PCR检测4种病毒稳定性试验将PRV、PPV、PCV-2、HC，分别取5份阳性样品和1份阴性样品分别进行批内、批间重复试验。批内重复试验是将5份样品在同一次实时荧光中重复3次，结果见表6;批间重复试验是在3次不同时间的试验中(间隔4天)进行实时荧光定量PCR试验，结果见表6。4种病毒的批间、批内重复试验的平均变异系数CV值均小于2。/。；表6SyMuReTi-PCR检测4种病毒的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数PCV-2PPV*PRVHC批内cv%批间cv%批内cv%批间cv%批内cv%批间cv%批内cv%批间cv/。0.470.660.160.821.971.391.352.020.171.050.220.391.581.830.891.790.700.650.150.651.061.491.291.260.460.640.160.780.211.771.472.100.460.830.210.691.671.431.412.43注CV为变异系数；Note:CViscoefficientofvariability试验例6本发明SyMuReTi-PCR检测4种病毒样品试验检测样品共计60份，其中现地采集全血27份，试验攻毒猪脏器13份，20病料分别从河南、湖南等地的猪场采集，根据常规方法提取核酸，应用建立的SyMuReTi-PCR方法和普通PCR检测样品。待检样品为全血，自表现有PRV、PPV、PCV-2、HC相关疫病临床症状的疑似猪只中采集，临床主要表现为背毛蓬乱、食欲不振，有些出现振颤及呼吸道症状，或出现生殖障碍等。皮肤坏死性出血，有黄豆粒大小的紫斑，淋巴结肿，肺充血、淤血、肉变，肠淋肿(河南、湖南等地猪群的临床症状)。普通PCR法检测与SyMuReTi-PCR检测的结果见表7和表8。由表7可以看出PCV-2普通PCR检测出39份阳性，本发明SyMuReTi-PCR检出45份阳性；PRV普通PCR检出14份阳性，SyMuReTi-PCR检出19份阳性；HC普通PCR检出3份阳性，SyMuReTi-PCR检出4份阳性；PPV普通PCR和SyMuReTi-PCR检出3份；HC和PCV曙2混合感染病毒的有3份；HC和PRV混合感染病毒的有1份；PCV-2和PRV混合感染的有4份。表7SyMuReTi-PCR检测样品结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注判定标准确定为在CT值在35循环内，Tm值分别为PCV-2:86.69±0.21PPV:79.97±0.15PRV:88.56±0.15HCV:84.61±0.16。表8SyMuReTi-PCR检测4种病毒的样品结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1617181920212223242526272829303132333435363738394041424344化47注+:阳性；一阴性Note:+:Positive;-:Negative.16序列表<110>中国农业科学研究院哈尔滨軎医研究所<120>检測猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘇病毒的多重实时荧光定量PCR方法<130>55<歸16'<170>Patentlnversion3.1<210><211><212><213>18朋APorcinecircoviruses<柳>1鹏gagg鄉gtaatgag18<210>2<211>18<212>DNA<213>Porcinecircoviruses<柳>2tggaaattcagggcatgg18<210>3<211>18<212>D貼<213>Porcineparvovirus<400>3tc助tacttgggggaggg18<210>4<211>19<212>DNA<213>Porcineparvovirus序列表<400>4gtgttcctgggtgttggtc19<210>5.<211>18<212>醒<213>Porcinepseudorabiesvirus<400>5ggcatcggcgactacctg18<210>6<211>18<212>DNA<213>Porcinepseudorabiesvirus<400>6agaagagctgcgagtgga18<210〉7<211>19<212>DNA<213>Hogcholeravirus<400>7tgc幼ctgaatgacgggac19<210>8<211>19<212>DNA<213>Hogcholeravirus<400>8ctataacacccgtccaccc19<210>-9<211>24<212>DNA<213>Porcinecircoviruses<婦9attagtcttccaatcacgcttctg24<210>10<211>20<212>DNA<213>Porcinecircoviruses序列表<400>10cttgttggagagc鹏agtc20<210>11<211>18<212>腿<213>Porcineparvovirus<衡11鹏ac助atggtac助ga<210>12<211>18<212>DNA<213>Porcineparvovirus<400>12tttctgtcatgttgttgg<210>13<211>19<212>腿<213>Porcinepseudorabiesvirus<400>13gagccgcccatcgtcaccc<210>14<211>19<212>DNA<213>Porcinepseudorabiesvirus181819<400>14ccaccgccacaaagaacac19<210>15<2U>19<212>DNA序列表<213>Hogcholeravirus<400>15tgcaact卿tgacgggac19<210>16<211>23<212>DNA<213>Hogcholeravirus<楊16gccaaacacctcctactgaccac2权利要求1.一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，包括制备4种病毒的标准质粒并建立标准曲线，确定判定样品阳性或阴性的标准，设计检测引物进行样品的荧光定量PCR扩增并获得样品的Tm值，将所获得的Tm值用所确定的判定标准评判样品的阳性或阴性等步骤，其特征在于，所述的标准曲线的建立方法如下(1)按照常规方法分别提取猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒的核酸；(2)以SEQIDNO1和SEQIDNO2为引物，以所提取的II型猪圆环病毒(PCV2)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得II型猪圆环病毒标准质粒；以SEQIDNO3和SEQIDNO4为引物，以所提取的猪细小病毒(PPV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪细小病毒标准质粒；以SEQIDNO5和SEQIDNO6为引物，以所提取的猪伪狂犬病毒(PRV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪伪狂犬病毒标准质粒；以SEQIDNO7和SEQIDNO8为引物，以所提取的猪瘟病毒(HCV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪瘟病毒标准质粒；(3)将步骤(2)所制备的4种标准质粒分别作10倍系列稀释，以稀释液为模板，进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，经计算机软件Rotor-gene6.0生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线；所述的确定判定阳性或阴性的标准是在CT值在35循环内；Tm值分别为PCV-286.69±0.21；PPV79.97±0.15；PRV88.56±0.15；HCV84.61±0.16；所述的检测引物为检测II型猪圆环病毒(PCV2)的引物为SEQIDNO9和SEQIDNO10；检测猪细小病毒(PPV)的引物为SEQIDNO11和SEQIDNO12；检测猪伪狂犬病毒(PRV)的引物为SEQIDNO13和SEQIDNO14；检测猪瘟病毒(HCV)的引物为SEQIDNO15和SEQIDNO16。2、按照权利要求1的多重实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述检测II型猪圆环病毒的标准曲线是图3所示；检测猪细小病毒病毒的标准曲线是图4所示；检测猪伪狂犬病毒的标准曲线是图5所示；检测猪瘟病毒的标准曲线是图6所示。全文摘要本发明公开了一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法。本发明方法同时检测四种病毒都呈良好的线性关系，构建的标准质粒10倍系列稀释的各个点均在一条直线上，CT值与拷贝数之间均呈良好线性关系，回归分析显示，二者相关系数为R²＞0.99。本发明方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，能快速、敏感、特异地检测对经济危害严重的4种病毒，可应用病毒感染的前期诊断。文档编号C12Q1/70GK101260442SQ20071007976公开日2008年9月10日申请日期2007年3月9日优先权日2007年3月9日发明者曦李,童光志,芳符申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所