专利名称：山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及从山羊肌肉细胞分离的编码S6K1蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码S6K1蛋白质的cDNA编码区1563bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。
背景技术：
S6K1是一个属于AGC激酶家族的Ser/Thr激酶，蛋白包含了5个主要的结构域，自N端始分别为NT(N-terminal domain)，catalytic domain，the linker region，autoinhibitory domain和CT(C-terminal domain)。哺乳动物中，目前已经清楚牛的S6K1基因cDNA编码区有1584个核苷酸组成，编码了527个氨基酸残基，兔、人和大鼠的S6K1基因编码区由1578个核苷酸组成，编码525个氨基酸残基。
S6K1是细胞生长和细胞周期进程的正调节器，在mTOR信号通路中它接受来自上游的mTOR(themammalian target of rapamycin)的刺激，至少可以在3个方面发生作用1)对rpS6、eIF4B发生作用，促进占细胞内总mRNA的15％-20％的5′TOP mRMA的翻译，翻译合成核糖体蛋白、延伸因子eEF1A和eEF2及mRNA稳定蛋白PABP，进而调节细胞的形态大小、更新和存活；2)抑制IRS-1调节细胞对胰岛素的敏感性；3)激活CREM促进基因转录。有实验证明敲除了S6K1(S6K1-/-)的小鼠，成活率显著降低，说明S6K1影响新生儿的存活率。
迄今，关于S6K1在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在人、鼠、牛等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见有关山羊细胞中S6K1的研究报道，也未见有山羊S6K1基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。
在各种情况下，有重要的原因研究和开发与山羊S6K1蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究清楚山羊的S6K1基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的质量等方面，由重组S6K1蛋白制备的抗体可以检测S6K1基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。
发明内容
本发明人已经努力从山羊的不同组织细胞中分离S6K1基因。作为结果，本发明人从山羊肌肉组织细胞分离了S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。本发明人通过比对已知的人、大鼠、兔、牛的S6K1基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛的S6K1基因(AY396564)cDNA编码区的序列，在不打破氨基酸编码的前提下设计上游引物(5’端从起始密码子开始)，下游引物5’端起始于牛S6K1基因的1563bp并加上终止密码子TGA，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增山羊S6K1基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了山羊S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段，序列分析表明与牛的序列(AY396564)同源性为99％(1550/1563)，且保持了正确的编码，推导出的由此序列编码的氨基酸序列与牛的相比有2个氨基酸的差别。这一cDNA片段称为“gS6K1”。
所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的mTOR的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法克隆山羊S6K1基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码山羊S6K1蛋白的基因的cDNA的编码区1563bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。
附图的简要说明 从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中
图1显示了牛S6K1基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号AY396564)。
图2显示了1563bp的山羊S6K1基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO1)和由此推断的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图3是显示从山羊肌肉组织分离的总RNA的RT-PCR的结果(1563bp的cDNA gS6K1)的电泳图。
图4是显示以质粒pMD19-T-gS6K1为模板，以P1、P2为引物进行PCR鉴定的电泳图。
图5是显示将质粒pMD19-T-gS6K1进行EcoRI酶切鉴定的电泳图。
图6显示了山羊S6K1基因cDNA的编码区核苷酸序列与牛(AY396564)的S6K1基因cDNA的序列的比较。
具体实施例方式 为了从山羊组织细胞中分离S6K1基因，本发明人首先按照提取RNA的标准要求采集内蒙古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat，Capra hircus)的各类组织样本。即，现场宰杀内蒙古白绒山羊后立即采取肌肉、肝、肾、淋巴结、脾及睾丸等组织块(将组织块大小控制在30～50μg)，放入冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于-80℃冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊肌肉组织、睾丸组织、肾组织、肝组织、淋巴结组织及脾脏组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物S6K1基因在各类组织中的表达情况和总RNA提取结果，选定以肌肉组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-gS6K1。
为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-gS6K1，将其转化Ecoli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gS6K1转化了的Ecoli DH5α细胞涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、白菌落筛选。37℃培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定白色菌落为获得的重组菌落。
重组菌落和重组质粒pMD19-T-gS6K1的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先挑取划线培养的菌落用Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定，阳性的初步认定为重组质粒，其相应的菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒进一步进行EcoR I酶切鉴定。经过了PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质粒pMD19-T-gS6K1。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质粒和重组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-gS6K1的Ecoli DH5α液体培养的样品送上海生工生物工程有限公司测序。作为结果，获得了1563bp的山羊S6K1基因cDNA编码区的核苷酸序列。
显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物P1和P2，可以利用RT-PCR方法扩增出山羊的S6K1基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测S6K1基因的组织表达特异性，也可进一步实现羊S6K1基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的S6K1蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的S6K1基因的表达情况等等。
在下面的实施例中进一步说明了本发明，但这并不限制本发明的范围。
实施例1山羊S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段的克隆 为了克隆来自山羊肌肉组织细胞的S6K1基因包含1563bp编码区的cDNA，根据图1公开的核苷酸序列(AY396564)，首先制备允许扩增1563bp的cDNA的PCR引物，即上游引物5′ATGAGGCGACGAAGGAGGC 3′和下游引物5′CAGGTGCTCTGGTCGTTTG 3′。然后在上游引物5′端加上BamHI酶切位点和保护性碱基GC，在下游引物5′端加上终止密码子TGA和EcoRI酶切位点和保护性碱基GC，即有上游引物P15′GC GGATCC ATGAGGCGACGAAGGAGGC 3′，下游引物P25′GC GAATTC TCA CAGGTGCTCTGGTCGTTTG 3′。
为了利用RT-PCR方法克隆S6K1基因的cDNA，从山羊肌肉组织分离总RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊肌肉组织总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80℃冰箱保存备用。然后，利用TaKaRa的M-MLV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA第一链。
以上面得到的cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，利用TaKaRa LATaqDNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应体系为10μl模板cDNA 1μl，2×GC bufferII(5mM Mg2+)5μl，dNTP(各2.5mM)1.6μl，P1(10pmol/μl)0.5μl，P2(10pmol/μl)0.5μl，LA Taq酶(5U/μl)0.2μl，ddH2O 1.2μl。反应循环为94℃4分钟；94℃1分钟，58℃1分钟，72℃，2分钟，35个循环；72℃10分钟。PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照相。作为结果，得到了1563bp的特异性目的片段(参见图3)。
为了将获得的1563bp的cDNA特异性目的片段连接到pMD19-T克隆载体上，首先将电泳分离的1563bp的cDNA特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段，紫外测定浓度后按照pMD19-T克隆载体说明书操作程序完成连接。为了检测连接反应是否成功和进一步扩增质粒pMD19-T-gS6K1，将其转化Ecoli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gS6K1转化了的Ecoli DH5α细胞涂在含有氨苄青霉素和X-gal的选择性平板上，并同时涂上IPTG进行诱导，实现蓝、白菌落筛选。涂布的平板37℃培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，得到了白色的重组菌落。
进一步的工作是对重组菌落和重组质粒进行鉴定(理论上将只有含有重组质粒的菌落才是真正的重组菌落)。首先将白色的重组菌落进行划线培养12小时，然后挑取菌落，用Kieser法提质粒。再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定。对阳性的菌落进行摇床振荡液体培养12小时，精提质粒，紫外检测浓度并进行1％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)检测，作为结果，得到了与预期结果大小相符的质粒。最后一步是对精提的质粒利用PCR反应和酶切反应进行二次鉴定。PCR反应以质粒为模板，以P1、P2为引物，反应体系为10μl质粒DNA 0.1μl，2×GC bufferII(5mM Mg2+)5μl，dNTP(各2.5mM)1.6μl，P1(10pmol/μl)0.5μl，P2(10pmol/μl)0.5μl，LATaq酶(5U/μl)0.2μl，ddH2O 2.1μl。反应循环为94℃4分钟；94℃1分钟，58℃1分钟，72℃，2分钟，35个循环；72℃10分钟。PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照像。作为结果，得到了1563bp的特异性目的片段(参见图4)。酶切鉴定采用TaKaRa EcoR I单酶切，由于设计引物时加了一个EcoRI酶切位点，同时pMD19-T载体上也有一个EcoRI酶切位点，故根据克隆片段插入T载体的方向，切出的片段有可能是一段或两段。作为结果，两个克隆的单酶切分别得到了与预期结果大小相符的一个片段和两个片段(参见图5)。
经过两次鉴定的重组质粒，与其相应的菌落即是重组菌落。将液体培养的重组菌落样品1ml送往上海生工生物工程有限公司用测序。作为结果，获得了1563bp的山羊S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段的核苷酸序列(参见图2)。
实施例2山羊S6K1基因的cDNA的核苷酸序列 图2显示了实施例1中获得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，和由此推断的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在图2中，显示的序列是S6K1基因的核苷酸序列，它包括了cDNA编码区的1563bp的核苷酸序列，编码形成分子量推断的58.6KDa的成熟蛋白质的521个氨基酸。
图6显示了山羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列与牛(AY396564)的S6K1基因cDNA的核苷酸序列的比较。表明1)山羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列与牛的S6K1基因cDNA的核苷酸序列有99％的同源性。由山羊的这段核苷酸序列推导出的氨基酸序列与牛的S6K1蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(AAR01025)有2个氨基酸的差别，同源性99.6％(519/521)。
正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆山羊S6K1基因cDNA编码区的引物和编码山羊的S6K1蛋白质的包括1563bp的cDNA的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。此cDNA包括了1563bp的核苷酸序列，它编码含有521个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的S6K1蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的S6K1基因的表达情况等等。
1.山羊S6K1 cDNA的编码区片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述。
2.由cDNA编码区的核苷酸序列推断出的山羊S6K1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2所述。
山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>旭，日干
吴，应积
王，志钢
<120>山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列
<130>NO
<140>NO
<141>2007-02-02
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1563
<212>DNA
<213>Capra hircus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1563)
<400>1
atg agg cga cga agg agg cgg gac ggt ttc tac ccg gcg ccg gac ttc 48
Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Asp Phe
1 5 10 15
cga gac agg gaa gct gag gac atg gca ggg gtg ttt gac ata gac ctg 96
Arg Asp Arg Glu Ala Glu Asp Met Ala Gly Val Phe Asp Ile Asp Leu
20 25 30
gac cag ccg gag gac gcg ggc tct gag gat gag ctg gag gag ggg ggt144
Asp Gln Pro Glu Asp Ala Gly Ser Glu Asp Glu Leu Glu Glu Gly Gly
35 40 45
cag tta aat gaa agc atg gac cat ggg gga gtt gga cca tat gaa ctt192
Gln Leu Asn Glu Ser Met Asp His Gly Gly Val Gly Pro Tyr Glu Leu
50 55 60
ggc atg gag cat tgt gag aaa ttt gaa atc tca gaa act agt gtg aac240
Gly Met Glu His Cys Glu Lys Phe Glu Ile Ser Glu Thr Ser Val Asn
65 70 75 80
aga ggg cca gaa aaa atc aga cca gaa cgt ttt gag cta ctt cga gta288
Arg Gly Pro Glu Lys Ile Arg Pro Glu Arg Phe Glu Leu Leu Arg Val
85 90 95
ctt ggt aaa ggg ggc tat gga aag gtt ttt caa gta cga aaa gta aca336
Leu Gly Lys Gly Gly Tyr Gly Lys Val Phe Gln Val Arg Lys Val Thr
100 105 110
gga gca aat acc ggg aaa ata ttt gcc atg aag gtg ctt aaa aag gca384
Gly Ala Asn Thr Gly Lys Ile Phe Ala Met Lys Val Leu Lys Lys Ala
115 120 125
atg ata gta aga aat gct aaa gat aca gct cat aca aaa gca gaa cgg432
Met Ile Val Arg Asn Ala Lys Asp Thr Ala His Thr Lys Ala Glu Arg
130 135 140
aat att ctg gag gaa gta aag cat cct ttc att gtg gat tta att tat480
Asn Ile Leu Glu Glu Val Lys His Pro Phe Ile Val Asp Leu Ile Tyr
145 150 155 160
gcc ttt cag acc ggt gga aaa ctc tac ctc atc ctt gag tat ctc ggc528
Ala Phe Gln Thr Gly Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
gga gga gaa tta ttt atg cag tta gaa aga gaa gga ata ttt atg gaa576
Gly Gly Glu Leu Phe Met Gln Leu Glu Arg Glu Gly Ile Phe Met Glu
180 185 190
gac aca gcc tgc ttt tac ttg gca gaa atc tcc atg gct ttg ggg cat 624
Asp Thr Ala Cys Phe Tyr Leu Ala Glu Ile Ser Met Ala Leu Gly His
195 200 205
tta cat caa aag ggg atc atc tac aga gac ctg aag ccg gag aat atc 672
Leu His Gln Lys Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile
210 215 220
atg ctt aat cac caa ggt cac gtc aaa cta aca gat ttt gga cta tgc 720
Met Leu Asn His Gln Gly His Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys
225 230 235 240
aaa gaa tct att cat gac gga aca gtc aca cac acc ttt tgt gga aca 768
Lys Glu Ser Ile His Asp Gly Thr Val Thr His Thr Phe Cys Gly Thr
245 250 255
ata gaa tac atg gcc cct gag atc ttg atg aga agt ggc cac aat cgt 816
Ile Glu Tyr Met Ala Pro Glu Ile Leu Met Arg Ser Gly His Asn Arg
260 265 270
gct gtg gat tgg tgg agt ttg gga gca tta atg tat gac atg ctg act 864
Ala Val Asp Trp Trp Ser Leu Gly Ala Leu Met Tyr Asp Met Leu Thr
275 280 285
gga gca ccc ccg ttc act ggg gag aat aga aag aaa aca att gac aaa 912
Gly Ala Pro Pro Phe Thr Gly Glu Asn Arg Lys Lys Thr Ile Asp Lys
290 295 300
atc ctc aaa tgt aaa ctc aat ttg cct ccc tac ctc acg caa gaa gcc 960
Ile Leu Lys Cys Lys Leu Asn Leu Pro Pro Tyr Leu Thr Gln Glu Ala
305 310 315 320
aga gat ctg ctt aaa aag ctg ctg aaa cga aat gct gct tct cgt ctt1008
Arg Asp Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Arg Asn Ala Ala Ser Arg Leu
325 330 335
gga gct ggt cct ggg gat gct gga gaa gtt caa gct cat cca ttc ttc1056
Gly Ala Gly Pro Gly Asp Ala Gly Glu Val Gln Ala His Pro Phe Phe
340 345 350
aga cat att aac tgg gaa gaa ctg ctg gct cgg aag gtg gag ccc ccc1104
Arg His Ile Asn Trp Glu Glu Leu Leu Ala Arg Lys Val Glu Pro Pro
355 360 365
ttc aaa cct ctt ttg caa tca gaa gag gat gtg agt cag ttt gat tcc1152
Phe Lys Pro Leu Leu Gln Ser Glu Glu Asp Val Ser Gln Phe Asp Ser
370 375 380
aag ttt aca cgt cag aca cct gtt gac agc cca gat gac tca gct ctc1200
Lys Phe Thr Arg Gln Thr Pro Val Asp Ser Pro Asp Asp Ser Ala Leu
385 390 395 400
agt gaa agt gcc aac cag gtc ttt ctg ggt ttt acg tat gtg gct cca1248
Ser Glu Ser Ala Asn Gln Val Phe Leu Gly Phe Thr Tyr Val Ala Pro
405 410 415
tct gta ctt gaa agc gtg aaa gaa aag ttt tcc ttt gaa cca aaa atc1296
Ser Val Leu Glu Ser Val Lys Glu Lys Phe Ser Phe Glu Pro Lys Ile
420 425 430
cga tcc cct cga aga ttt att ggc agc cca cga aca cct gtc agc cca1344
Arg Ser Pro Arg Arg Phe Ile Gly Ser Pro Arg Thr Pro Val Ser Pro
435 440 445
gtc aaa ttt tct cct ggg gat ttc tgg gga aga ggt gct tca gcc agc1392
Val Lys Phe Ser Pro Gly Asp Phe Trp Gly Arg Gly Ala Ser Ala Ser
450 455 460
acg gca aat ccg cag acg cct gtg gaa tac ccc atg gag aca agt ggg1440
Thr Ala Asn Pro Gln Thr Pro Val Glu Tyr Pro Met Glu Thr Ser Gly
465 470 475 480
ata gag cag atg gac gtg aca atg agc ggg gag gct tca gca ccg ctt1488
Ile Glu Gln Met Asp Val Thr Met Ser Gly Glu Ala Ser Ala Pro Leu
485 490 495
cca ata cga cag cca aac tcc gga ccg tac aaa aag caa gct ttt ccc1536
Pro Ile Arg Gln Pro Asn Ser Gly Pro Tyr Lys Lys Gln Ala Phe Pro
500 505 510
atg atc tcc aaa cga cca gag cac ctg1563
Met Ile Ser Lys Arg Pro Glu His Leu
515 520
<210>2
<211>521
<212>PRT
<213>Capra hircus
<400>2
Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Asp Phe
1 5 10 15
Arg Asp Arg Glu Ala Glu Asp Met Ala Gly Val Phe Asp Ile Asp Leu
20 25 30
Asp Gln Pro Glu Asp Ala Gly Ser Glu Asp Glu Leu Glu Glu Gly Gly
35 40 45
Gln Leu Asn Glu Ser Met Asp His Gly Gly Val Gly Pro Tyr Glu Leu
50 55 60
Gly Met Glu His Cys Glu Lys Phe Glu Ile Ser Glu Thr Ser Val Asn
65 70 75 80
Arg Gly Pro Glu Lys Ile Arg Pro Glu Arg Phe Glu Leu Leu Arg Val
85 90 95
Leu Gly Lys Gly Gly Tyr Gly Lys Val Phe Gln Val Arg Lys Val Thr
100 105 110
Gly Ala Asn Thr Gly Lys Ile Phe Ala Met Lys Val Leu Lys Lys Ala
115 120 125
Met Ile Val Arg Asn Ala Lys Asp Thr Ala His Thr Lys Ala Glu Arg
130 135 140
Asn Ile Leu Glu Glu Val Lys His Pro Phe Ile Val Asp Leu Ile Tyr
145 150 155 160
Ala Phe Gln Thr Gly Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
Gly Gly Glu Leu Phe Met Gln Leu Glu Arg Glu Gly Ile Phe Met Glu
180 185 190
Asp Thr Ala Cys Phe Tyr Leu Ala Glu Ile Ser Met Ala Leu Gly His
195 200 205
Leu His Gln Lys Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile
210 215 220
Met Leu Asn His Gln Gly His Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys
225 230 235 240
Lys Glu Ser Ile His Asp Gly Thr Val Thr His Thr Phe Cys Gly Thr
245 250 255
Ile Glu Tyr Met Ala Pro Glu Ile Leu Met Arg Ser Gly His Asn Arg
260 265 270
Ala Val Asp Trp Trp Ser Leu Gly Ala Leu Met Tyr Asp Met Leu Thr
275 280 285
Gly Ala Pro Pro Phe Thr Gly Glu Asn Arg Lys Lys Thr Ile Asp Lys
290 295 300
Ile Leu Lys Cys Lys Leu Asn Leu Pro Pro Tyr Leu Thr Gln Glu Ala
305 310 315 320
Arg Asp Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Arg Asn Ala Ala Ser Arg Leu
325 330 335
Gly Ala Gly Pro Gly Asp Ala Gly Glu Val Gln Ala His Pro Phe Phe
340 345 350
Arg His Ile Asn Trp Glu Glu Leu Leu Ala Arg Lys Val Glu Pro Pro
355 360 365
Phe Lys Pro Leu Leu Gln Ser Glu Glu Asp Val Ser Gln Phe Asp Ser
370 375 380
Lys Phe Thr Arg Gln Thr Pro Val Asp Ser Pro Asp Asp Ser Ala Leu
385 390 395 400
Ser Glu Ser Ala Asn Gln Val Phe Leu Gly Phe Thr Tyr Val Ala Pro
405 410 415
Ser Val Leu Glu Ser Val Lys Glu Lys Phe Ser Phe Glu Pro Lys Ile
420 425 430
Arg Ser Pro Arg Arg Phe Ile Gly Ser Pro Arg Thr Pro Val Ser Pro
435 440 445
Val Lys Phe Ser Pro Gly Asp Phe Trp Gly Arg Gly Ala Ser Ala Ser
450 455 460
Thr Ala Asn Pro Gln Thr Pro Val Glu Tyr Pro Met Glu Thr Ser Gly
465 470 475 480
Ile Glu Gln Met Asp Val Thr Met Ser Gly Glu Ala Ser Ala Pro Leu
485 490 495
Pro Ile Arg Gln Pro Asn Ser Gly Pro Tyr Lys Lys Gln Ala Phe Pro
500 505 510
Met Ile Ser Lys Arg Pro Glu His Leu
515 520
权利要求
独立权利要求
本发明涉及一段从山羊肌肉细胞分离的编码S6K1蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码S6K1蛋白质的cDNA编码区核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。目前应用RT-PCR方法克隆基因并获得相应的核苷酸序列是获得基因(cDNA)核苷酸序列的常用方法。本项发明设计了一对引物并应用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了山羊S6K1基因cDNA的编码区特异性片段，经过测序后得到这一片段的1563bp的核苷酸序列，其特征是在还没有羊S6K1基因核苷酸序列的情况下，通过比较已知的人、大鼠、兔、牛的S6K1基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛S6K1基因cDNA序列在不打破氨基酸编码的前提下设计PCR引物，进而通过RT-PCR方法扩增出了山羊S6K1基因cDNA的编码区片段，测序后得到了1563bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列，这一山羊S6K1基因cDNA编码区片段的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列在国内外是首次获得。
基于上述说明的本发明的技术特征，本发明的独立权利要求表述为一种自山羊分离的多核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列，是下列序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的cDNA序列；2)与序列表中SEQID NO1的cDNA序列对应的标注为SEQ ID NO2的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及从山羊肌肉细胞分离的编码S6K1蛋白的cDNA的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。本发明通过比对已知的人、大鼠、兔、牛S6K1基因cDNA的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛S6K1基因cDNA序列(GenBank登陆号AY396564)设计出了一对用于RT-PCR扩增羊S6K1基因cDNA编码区片段的引物并用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了特异性片段，测序后得到了羊S6K1基因cDNA的编码区的1563bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。获得的这1563bp的核苷酸序列可进一步用于羊S6K1基因全长cDNA的克隆及用于通过RT-PCR或杂交的方法检测S6K1基因的组织表达特异性，也可用于重组表达得到蛋白后制备检测S6K1的抗体。
文档编号C12N15/12GK101245345SQ20071008451
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月12日 优先权日2007年2月12日
发明者旭日干, 吴应积, 王志钢 申请人:旭日干, 吴应积, 王志钢