专利名称：：化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种化学合成的单纯疱疹病毒1型(Herpessimplexvirus1，HSV1)糖蛋白B(glycoproteinB，gB糖蛋白)胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV1病毒gB糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
背景技术：
：单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)是危害人类健康的常见病原体，容易导致复发性感染和潜伏感染，对人体危害严重，分为HSV-l及HSV-2两型。l型单纯疱疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宫颈癌的发生密切相关。近年HSV1的感染显著增多，约占该病的10%40%。目前药物治疗HSV感染时常出现相应耐药性,所以研制疫苗是切实可行的有效方法，它能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。至今已研制了多种HSV疫苗，已有两种HSV糖蛋白疫苗进入III期临床试验，即Chiron公司研制的重组gD2/gB2糖蛋白与MF59佐剂配伍而成的疫苗以及GlaxoSmithKline(GSK)公司开发的重组gD2糖蛋白与另一佐剂(3-de-0-酰化单磷酸类脂A和明砜)配伍而成的疫苗，这两种疫苗均有一定的保护作用，但临床效果有限。国内目前对HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。HSV包膜糖蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激机体产生免疫应答及疫苗研制中具有重要地位。目前正式命名的HSV包膜糖蛋白有12种，其中gB糖蛋白在感染的细胞中含量最多，是疱疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株间差异较小，且与所有的疱疹类病毒亚群有较大的同源性，同时gB蛋白具有较强的免疫原性,可诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应，因此HSVlgB糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。HSVlgB糖蛋白基因全长2712bp，编码29个氨基酸序列的信号肽、696氨基酸序列的胞外区、69氨基酸序列的跨膜区、109氨基酸序列的胞内区。去除部分信号肽序列不影响其在原核细胞中的分泌表达。研究表明，为增强编码抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性编码序列，特别在完整抗原蛋白对宿主具有毒性或免疫抑制作用的情况下，对抗原蛋白进行截短表达就尤其重要。而截短后的gB基因构建的疫苗，与用完整gB基因构建的疫苗对HSV-1病毒攻击具有相同的保护作用。目前应用的HSV1病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，其使用的抗原是全病毒抗原，具有生产较危险、成本高、与其它病毒有交叉反应等缺点。目前缺乏HSV1病毒疫苗。灭活疫苗的研究取得了较大进展，但是生产成本高、危险大。
发明内容本发明目的是针对上述不足之处提供一种化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSVl病毒gB糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSVl病毒gB糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸一第696个氨基酸，共6%个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSVl病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSVl病毒单抗和多抗等。化学合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下方案实现的1.HSVl病毒gB糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSVl病毒gB糖蛋白的氨基酸序列，筛选出gB糖蛋白的N端(第l氨基酸一第696氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC),在3'端增加了终止密码子(TGA)和^boRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的5s/zHI和AcoRI酶切位点内。筛选的HSV1病毒gB糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第1个aa—第696个ProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProLysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla化学合成的含HSV1病毒gB糖蛋白胞外区抗原表位基因的DNA序列(2107bp):GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGAC(XTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCGACGCCTAAGAATTCGC2.表达HSVl病毒gB糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建提取质粒pGEX4T-2,用HI和￡boRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用及mHI和￡boRI双酶切化学合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4DNA连接酶连接，使HSVl病毒gB糖蛋白基因片段插入到载体pGEX4T-2内的fe/出I和￡boRI位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。3.重组质粒的筛选与鉴定将重组质粒转化大肠杆菌TGl，涂布含氨苄青霉素(100yg/ml)LB平板，置37°C过夜。次日随机挑取转化菌落和l个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSVl病毒gB糖蛋白胞外区基因片段,含HSVl病毒gB糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约2107bp的基因片段。将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段，序列完全正确CCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCC:GACGCCTGA构建的重组质粒表达HSV1的病毒gB糖蛋白胞外区片段(696个氨基酸)，在其N端融合了载体上的238个氨基酸，全长934个氨基酸,其氨基酸序列如下MetProMetlieLeuGlyTyrTrpAsplieArgGlyLeuAlaHisAlalieArg!LeuLeuLeuGluTyrThrAspSerSerTyrGluGluLysLysTyrThrMetGlyGlyAlaProAspTyrAspArgSerGinTrpLeuAsnGluLysPheLysLeuGlyLeuAspPheProAsnLeuProTyrLeulieAspGlyAlaHisLyslieThrGinSerAsnAlalieLeuCysTyrlieAlaArgLysHisAsnLeuCysGlyGluThrGluGluGluLyslieArgValAsplieLeuGluAsnGinAlaMetAspValSerAsnGinLeuAlaArgValCysTyrSerProAspPheGluLysLeuLysProGluTyrLeuGluGluLeuProThrMetMetGinHisPheSerGinPheLeuGlyLysArgProTrpPheValGlyAspLyslieThrPheValAspPheLeuAlaTyrAspValLeuAspLeuHisArgliePheGluProAsnCysLeuAspAlaPheProAsnLeuLysAspPhelieSerArgPheGluGlyLeuGluLyslieSerAlaTyrMet<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>4.表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定将重组质粒转化大肠杆菌TG1，涂布含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，置37'C过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段，含HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约2107bp的基因片段，将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100yg/mL的LB培养基内，37'C振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.51.0mmol/L，继续振荡培养诱导46h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为96kD的HSV病毒gB糖蛋白，表达量约为30%，而对照菌TG1无此蛋白带；5.表达HSVl病毒gB糖蛋白的纯化1)表达HSV1病毒GB糖蛋白工程菌的超声裂解将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、20miru4'C)收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液内，裂解液为50mmol/LTris-HC1pH8.0、10mmol/LEDTA、10,ol/LDTT，冰浴超声破菌10min，离心(8000rpm、20min、4'C)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。2)表达HSVl病毒gB糖蛋白的纯化上清溶液加已经平衡的GlutathioneS印harose4B凝胶3ml，室温结合60min，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1XPBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50,1/LTris-HCLpH8.0+10mraol/LGST，分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段。6.纯化的HSV1病毒gB糖蛋白的ELISA检测将初步纯化获得的融合蛋白按l:10001:32000倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度倍比稀释，用HumanHSV-1ELISA试剂盒检测表达蛋白的抗原性(具体操作方法见试剂盒说明书)。结果显示(表l)此融合表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。7.将表达的HSV1病毒gB糖蛋白片段，用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。8.将合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段与其它基因片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。上述方法制备的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段在制备HSVl病毒亚单位疫苗中的应用。化学合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，可利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。本发明与现有技术相比具有的优点本发明表达的HSVl病毒的gB糖蛋白片段，有较多优点1.本发明表达的HSVl病毒gB糖蛋白胞外区片段用作抗原制备HSVl病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，具有生产较安全、成本低、与其它病毒交叉反应少等优点。2.HSV1病毒的gB糖蛋白在感染的细胞中含量最多，是疱疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株间差异较小，且与所有的疱疹类病毒亚群有较大的同源性，同时gB蛋白具有较强的免疫原性,可诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应,因此HSVlgB糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。本发明选择了其强抗原表位，利用基因工程技术表达制备，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗安全、成本低。3.本发明根据筛选出的HSVl病毒的gB糖蛋白胞外区片段氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，该基因适宜在真核和原核细胞内高表达。4.本发明构建的表达HSVl病毒的gB糖蛋白的工程菌，表达量可达菌体蛋白的30%，易于纯化，可大量纯化制备该蛋白。以下将结合附图对本发明作进一步说明。图1是本发明表达HSV1病毒的gB糖蛋白的重组质粒构建流程图。图2是本发明PCR扩增HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片断的电泳图。图3是本发明用1.0%的Agarose凝胶检测5个重组子的PCR扩增产物。附图3中M:低分子量DNA标准(TaKaRa，500bp);15:5个转化子均扩增出2107bp的目的基因片段。图4是本发明表达HSV1病毒的gB糖蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。附图4中M:低分子量蛋白标准(Pharmacia);7:对照菌E.coliTGl;16表示16号重组菌，2号、5号2个重组子表达相对分子量约为96000的融合蛋白，1、3、4、6号4个转化子无此蛋白带。图5是本发明表达HSV1病毒的gB糖蛋白纯化前后的SDS-PAGE分析结果。附图5中M:低分子量蛋白标准(Pharmacia);1:对照菌TG1;2:表达HSVl病毒的gB糖蛋白的工程菌；3:HSVl病毒的gB糖蛋白的包涵体；4:HSV1病毒的gB糖蛋白的纯化过程中的穿过峰；5:GlutathioneS印harose4B亲和层析柱纯化后的的HSV1病毒的gB糖蛋白；6:HSVl病毒的gB糖蛋白的纯化过程中的上清。具体实施例方式本发明实施方式的详细说明HSVl病毒的gB糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及表达通过计算机分析HSV1病毒的gB糖蛋白的全部氨基酸序列，筛选出HSVl病毒的gB糖蛋白内的强抗原表位，选用细菌偏爱的密码子，化学合成HSVl病毒的gB糖蛋白强抗原表位的全新基因片段。将基因片段克隆至质粒pGEX4T-2内的feMil/￡boRI位点，与载体上的起始密码子的翻译框架一致，可表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌TGI,筛选获得了高效表达HSVl病毒的gB糖蛋白的工程菌，表达的HSVl病毒的gB糖蛋白约占菌体蛋白总量的30%左右。材料与方法1.菌种与质粒宿主菌TGl及表达载体pGEX4T-2为实验室保存。2.分子生物学试剂限制性内切酶5』I、fcoRI、及T4DNA连接酶为市售TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为市售TaKaRa公司产品。DTT及IPTG为市售Promega公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。3.基因片段的合成由公司按设计合成。4.基因克隆方法DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。5.DNA序列分析用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。实施方式1.HSV1病毒的gB糖蛋白抗原表位筛选及基因片段的合成利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSVl病毒的gB糖蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank,接通号AY278488)，筛选出HSVl病毒的gB糖蛋白内的强抗原表位(图1),即从第1个氨基酸到第696个氨基酸，其氨基酸序列如下ProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProLysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspleuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla根据筛选的HSV1病毒gB糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了^sWI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，在3'端增加了终止密码子(TGA)和￡CORI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的ife^il和￡C0RI酶切位点内。化学合成的含HSV1病毒gB糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(2107bp)如下GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCGACGCCTGAGAATTCGC2.表达HSVl病毒gB糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建提取质粒pGEX4T-2，用^3/7HI和fcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用^^I和fcoRI双酶切化学合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4DNA连接酶连接，使HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的I和￡coRI位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白(构建流程见图2)。3.重组质粒的筛选与鉴定将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌TGl，将转化产物涂布含氨苄青霉素(100Pg/ml)的固体LB培养基上，置37'C培养过夜。次日随机挑选5个转化子菌落(分别标记为l一5号)和1个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，分别接种到含3ml液体LB培养基(含氨苄青霉素lOOPg/ml)的试管内，置37'C振荡培养5h，取菌液lml，离心收菌。分别用50y1去离子水悬浮菌体，沸水煮5min,离心(4。C，12000rpm)5min,取上清(内有质粒)2u1用作PCR模板，PCR扩增插入载体内的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，PCR反应浓度为质粒模板2ul、HSVl病毒gB糖蛋白胞外区基因片段的正链Pl(GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTC)和负链引物P2(GCGAATTCTTAGGCGTCGGC)各1n1、10Xpyrobestbuffer5.Oy1、2.5画1/LdNTP4.0nl、PyrobestDNATaq酶O.5yl(2.5U)、去离子水36.1，总体积50u1。扩增条件为94°C30秒、55°C30秒、72。C4分钟，35个循环；最后72。C延伸7分钟。取PCR扩增产物5ul,用1.0X的Agarose凝胶检测，结果，5个转化子均扩增出2107bp的目的基因片段(见图3)，而含质粒pGEX4T-2的对照菌没有扩增出该基因片段。初步证实，这5个转化子均含有HSVl病毒gB糖蛋白基因片段。提取l号重组子的质粒，测定质粒内的HSVl病毒gB糖蛋白基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段，序列完全正确CCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGAGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCCCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCGACGCCTGA构建的重组质粒表达HSV1的病毒gB糖蛋白片段(696个氨基酸)，在其N端融合了载体上的238个氨基酸，全长934个氨基酸，其氨基酸序列如下MetProMetlieLeuGlyTyrTrpAsplieArgGlyLeuAlaHisAlalieArgLeuLeuLeuGluTyrThrAspSerSerTyrGluGluLysLysTyrThrMetGlyGlyAlaProAspTyrAspArgSerGinTrpLeuAsnGluLysPheLysLeuGlyLeuAspPheProAsnLeuProTyrLeulieAspGlyAlaHisLyslieThrGinSerAsnAlalieLeuCysTyrlieAlaArglysHisAsnLeuCysGlyGluThrGluGluGluLyslieArgValAsplieLeuGluAsnGinAlaMetAspValSerAsnGinLeuAlaArgValCysTyrSerProAspPheGluLysLeuLysProGluTyrLeuGluGluLeuProThrMetMetGinHisPheSerGinPheLeuGlyLysArgProTrpPheValGlyAspLyslieThrPheValAspPheLeuAlaTyrAspValLeuAspLeuHisArgliePheGluProAsnCysLeuAspAlaPheProAsnLeuLysAspPhelieSerArgPheGluGlyLeuGluLyslieSerAlaTyrMetLysSerSerArgPheLeuProLysProLeuTyrThrArgMetAlaValTrpGlyAsnLysProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPhelysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnCeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProCysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla4.表达HSVl病毒gB糖蛋白工程菌的筛选鉴定将含有重组质粒的5个阳性转化子和1个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，接种至含3mlLB培养基(含氨苄青霉素10(^g/ml)的试管内，37。C振荡培养3h，加IPTG至终浓度1.0隱ol/L,继续振荡培养诱导5h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为96kD的HSV1病毒gB糖蛋白，表达量约为30%，而对照菌TG1无此蛋白带(图4)。表达HSV1病毒gB糖蛋白的纯化根据表达HSVl病毒gB糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。我们所表达的HSVlgB糖蛋白融合有载体上的GST蛋白，GST融合蛋白在表达时同时表达了谷胱甘肽s转酶，可很方便用GST琼脂糖凝胶FF分离，因此我们决定采用亲和层析法，用GlutathioneS印harose4B凝胶进行纯化。具体步骤如下材料和方法1.主要试剂-.GlutathioneS印harose4B凝胶为GEHeathcare公司产品，IPTG、DTT为Promega公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。2.表达HSVl病毒的gB糖蛋白的超声裂解将培养的表达HSV1病毒的gB糖蛋白的工程菌离心(8000rpm,20mins,4'C),弃上清，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/LTris-HClpH8.0、10mmol/LEDTA、10画1/LDTT)内，冰浴超声破菌10mins，离心(8000rpm、20mins，4°C)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。3.表达HSVl病毒gB糖蛋白的纯化上清溶液加巳经平衡的GlutathioneS印harose4B凝胶3ml室温结合60min，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1XPBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液(50画l/LTris-HCLpH8.0+10画1/LGST)分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段。结果将从GlutathioneSepharose4B凝胶柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示(见图5)，经诱导明显表达出HSVlgB/GST融合蛋白，表达产物主要存在于上清液中。SDS-PAGE显示表达产物约96kDa。纯化HSV1病毒的gB糖蛋白的鉴定及应用将纯化的重组HSV1病毒gB糖蛋白抗原，通过双抗体夹心ELISA试验方法检测，以鉴定表达的HSVl病毒gB糖蛋白的抗原性和特异性。实验结果显示，该重组蛋白有很好的抗原性和特异性。材料和方法1.酶联反应试剂盒HumanHSV-1ELISA试剂盒为美国Uscnlife公司产品。2.ELISA试验将初步纯化获得的融合蛋白按1:10001:32OOO倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度倍比稀释，用HumanHSV-1ELISA试剂盒检测表达蛋白的抗原性(具体操作方法见试剂盒说明书)。结果HSVlgB蛋白的ELISA检测将初步纯化获得的融合蛋白按h10001:32000倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度倍比稀释，用HumanHSV-1ELISA试剂盒检测表达蛋白的抗原性。结果显示(表l)此融合表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。表l表达蛋白的ELISA实验结果Table1.EUSAresultsoftheexpressedprotein<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>化学合成的HSV病毒gB蛋白胞外区基因片段序列表〈110>李越希〈120>化学合成的HSV病毒gB蛋白胞外区基因片段及其表达、应用〈160〉2<210>1〈211〉696<212>PRT〈213>HSV病毒gB蛋白胞外区片段<220>〈223〉含强抗原表位的HSV病毒gB蛋白胞外区片段，第1个氨基酸一第696个氨基酸，共696个氨基酸。〈400>1ProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAla151015AsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaPro202530ThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThr354045ProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAla505560ThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAla65707580AsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPhe859095GluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThr100105110GluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPhe115120125LysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPhe130135140GlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaPro145150155160ValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCys165170175ArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPhe180185190HisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAla195200205AlaPro225lieValArgLysAla305ValLysPheThrAsp385ThrPheTyrThrLys465HisTrpLysSerVal545Thr210SerValLeuGluGin290ThrAlaTrpArgGlu370AlaHisLeuValPro450ThrlieCysLeuAla530AlaArgArgGluAlaGly275ValAlaTrpGinPhe355TyrArglielieArg435ProThrGinGluAsn515ArgAlaThrValGluThr260SerAspProAspGlu340SerProAspLysAla420GluProSerAsnLeu500ProMetAspSerGluVal245GlyHisGlyThrTrp325ValSerLeuAlaVal405TyrHisProSerHis485GinAsnLeuAsnArgAla230AspAspThrPheThr310ValAspAspSerMet390GlyGinLeuGlylie470ValAsnAlaGlyVal550Gly215PheAlaPheGluTyr295ArgProGluAlaArg375AspGinProArgAla455GluAsnHislieAsp535lieTrpHisThrThrHisArgValHis280AlaAsnLysMetlie360ValArgProLeuGlu440SerPheAspGluAla520ValArgSerTyr265ThrArgLeuArgLeu345SerAsplieGinLeu425GinAlaAlaMetl>eu505SerMetTyrVal250MetSerAspLeuPro330ArgThrLeuPheTyr410SerSerAsnArgLeu490ThrAlaAlaGly235TyrSerTyrLeuThr315SerSerThrGlyAla395TyrAsnProAlaLeu475GlyLeuThrValValGinAsnSer555Asp220ThrProProAlaThr300ThrValGluPheAsp380ArgLeuThrLysSer柳GinArgTrpValSer540MetLeuThrTyrPheAla285ThrProCysTyrThr365CysArgAlaLeuPro445ValPheValAsnGly525ThrArgLysValAspTyr270AspLysLysThrGly350ThrlieTyrAsnAla430ProGluThrAlaGlu510ArgCyslieTyrAsnGlu255GlyArgAlaPheMet335GlyAsnGlyAsnGly415GluAsnArgTyrlie495AlaArgValSerAsnCys240PheTyrPheArgThr320ThrSerLeuLysAla400GlyLeuProlieAsn480AlaArgValProSer560ArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuVaJSerPheArgTyrGlu565570575AspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeu580585590ArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArg595600605TyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyr610615620SerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelie625630635640AspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGlu645650655ValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThr660665670GluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplie675680685AspThrVallieHisAlaAspAla690695<210>2<211>2107<212〉隨〈213〉人工序列<220〉<221>CDS<222〉(1)…(2104)<223〉人工合成的全新基因片段，编码HSV病毒gB蛋白胞外区片段。<220〉<221>mis-feature<222>(2105)...(2107)<223>合成基因时增加的终止密码子。<2CCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCT60ProSerSerProGlyThrProGiyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyPro15101520GCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAG120AlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLys25303540AACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCC180AsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAla45505560GCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCT240AlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAla65707580AACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGC300AsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArg859095100AGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAG360ArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLys105110115120GAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGC420GluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSer125130135140CAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCT480GinValT卬PheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGiyliePheGluAspArgAlaPro145150155160GTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCMCGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCT540ValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaAAGLysATGMetCTGLeuATClieGGTGlyACTThrACCThrGTGValGTGValTCCSerTGCCysACTThrTACTyrCAGGinTACTyrGAGGluAAGLysGTGValGACAspACCSerAAGLysGCTAlaGACAspACTThrATClieCACHisCAGGinAGCSerGTGValCTGLeuTACTyrGAGGluTTCPheTACTyrGCTAlaTGGTrpGAGGluACCThrGGTGlyATClieCCTProCGCProCGCArgAAGLysAACAsnGAGGluGTGValGCTAlaAGAArgGACAspATGMetTTCPheAAGLysAAGLysCTGLeuAAGLysGTGGAGCGCATC165AACAsn185CCTPro205CCTPro225GTGVal245TACTyr265GCTAla285GCCAla305TGGTrp325CTGLeu345ACTThr365GACAsp385GTGVal405CTGLeu425CCTPro445AAGAACAsnGCCAlaAGCSerGACAspATGMetGACAspACTThrGTGValCGCArgACCThrGCTAlaGGCGlyAGCSerCCTProCTGLeuAACAsnAGAArgGCTAlaTCTSerAGGArgGCTAlaCCTProTCCSerAACAsnCGCArgCAGGinAACAsnAACAsnGAGGluGCCAlaGTGValCGCArgCCTProTTCPheCCTProAAGLysGAGGluCTGLeuGACAspCCTProACTThrCCTProACCThrGCTAlaGAGGluAGCSerTTCPheAAGLysACCThrCGCArgTACTyrACCThrGCCAlaCAGGinCTGLeuACGThrACTACCTCTAGC170ACTThr190ACTThr210GCCAla230GTGVal250TACTyr270CAGGin290ACTThr310CCTPro330GGCGly350GAGGlu370ATGMet390TACTyr410GCTAla430CCTPro450ATCGCTAlaCGCArgTTCPheTACTyrGGCGlyGTGValAGGArgAGCSerGGTGlyTACTyrGACAspTACTyrGAGGluCCTProTTCPheACCThrCACHisCCTProTACTyrGACAspAACAsnGTGValTCCSerCCTProCGCArgCAGLeuCTGLeuCCTProCACHisAGCSerAGGArgTACTyrAGAArgGGCGlyCTCLeuTGCCysTTCPheCTGLeuATClieGCCAlaTACTyrCCCProAGAArgAGAArgTACTyrGACAspGAAGluTTCPheCTCLeuACCThrAGGArgTCCSerTTCPheAACAsnGTGValGGTGlyGAGTTCGCCAGG175GACAsp195GGCGly215GGCGly235GAGGlu255GGTGly275TACTyr295ACCThr315ATGMet335TTCPhe355AGAArg375GCTAla395GGTGly415AGAArg435GCTAla455CTGGATAspTGGTrpACCThrTTCPheAGCSerGCTAlaACTThrACCThrTCCSerGTGValCGCArgGGTGlyGAGGluAGCSerCACHisCACHisACCThrGTGValCACHisCGCArgCCTProAAGLysTCTSerGACAspAGGArgTTCPheCACHisGCCAlaGAGGluACCThrGTGValCTGLeuACCThrGACAspAAGLysTGGTrpGACAspCTGLeuTACTyrCTGLeuCTGLeuAACAsnACCThrACTThrAACAsnGCCAlaGAGGluCTGLeuTTCPheCAGGinGCTAlaGGTGlyAACAsnATClieAGAArgGCTAlaCAGTTCACCTAC180GACAsp200GACAsp220TGCCys240ACTThr260CACHis■280ACCThr300ACCThr320GAGGlu340ATClie360GACAsp380GCTAla400GCCAla420GAGGlu440TCCSer柳AAC6006607207808409009601020108011401200126013201380l柳<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>权利要求1、一种化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白的胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段，即第1个氨基酸至第696个氨基酸，共696个氨基酸，在该基因片段的5’端增加了BamHI酶切位点及两个保护碱基GC，在3’端增加了终止密码子TGA和EcoRI酶切位点及两个保护碱基GC，化学合成的基因序列全长2107bp，序列如下GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCGACGCCTGAGAATTCGC2、权利要求l所述的化学合成HSVl病毒gB糖蛋白胞外区的基因片段，其特征在于采用基因工程技术表达该基因序列编码的HSVl病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下.-表达HSVl病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建用勘/zHI和I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的HSVl病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4DNA连接酶连接，使HSVl病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的^s/出I和￡coRI位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长934个氨基酸，该融合蛋白N端融合了载体上的238个氨基酸，C端包含HSVl病毒的gB糖蛋白内的第1个氨基酸至第696个氨基酸，全长氨基酸序列如下MetProMetlieLeuGlyTyrTrpAsplieArgGlyLeuAlaHisAlalieArgLeuLeuLeuGluTyrThrAspSerSerTyrGluGluLysLysTyrThrMetGlyGlyAlaProAspTyrAspArgSerGinTrpLeuAsnGluLysPheLysLeuGlyLeuAspPheProAsnLeuProTyrLeulieAspGlyAlaHisLyslieThrGinSerAsnAlalieLeuCysTyrlieAlaArgLysHisAsnLeuCysGlyGluThrGluGluGluLyslieArgValAsplieLeuGluAsnGinAlaMetAspValSerAsnGinLeuAlaArgValCysTyrSerProAspPheGluLysLeuLysProGluTyrLeuGluGluLeuProThrMetMetGinHisPheSerGinPheLeuGlyLysArgProTrpPheValGlyAspLyslieThrPheValAspPheLeuAlaTyrAspValLeuAspLeuHisArgliePheGluProAsnCysLeuAspAlaPheProAsnLeuLysAspPhelieSerArgPheGluGlyLeuGluLyslieSerAlaTyrMetLysSerSerArgPheLeuProLysProLeuTyrThrArgMetAlaValTrpGlyAsnLysProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHis3ArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyILysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProLysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMet丄euGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定将重组质粒转化大肠杆菌TG1，涂布含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，置37°C过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段,含HSVl病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约2107bp的基因片段，将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素IOOpg/mL的LB培养基内，37。C振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.51.0mmol/L,继续振荡培养诱导46h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为96kD的HSV病毒gB糖蛋白，表达量约为30%，而对照菌TGl无此蛋白带；表达HSV1病毒gB糖蛋白的纯化将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，裂解液为50mmol/LTris-HClpH8.0、10mmol/LEDTA、10mmol/LDTT,超声破菌10min，离心收集上清，上清溶液加己经平衡的GlutathioneS印harose4B凝胶3ml,室温结合60min，上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1XPBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50mmol/LTris-HCLpH8.0+10mmol/LGST，分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段。3、权利要求l所述的化学合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，其特征在于可利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。4、权利要求2或3所述方法制备的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段在制备HSV1病毒亚单位疫苗中的应用。全文摘要本发明化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出HSV1病毒gB糖蛋白内的强抗原表位，第1个氨基酸至第696个氨基酸，共696个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备HSV1病毒gB糖蛋白的强抗原表位片段。表达的HSV1病毒gB糖蛋白的强抗原表位片段可用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。文档编号C12N15/34GK101173290SQ20071013389公开日2008年5月7日申请日期2007年10月24日优先权日2007年10月24日发明者敏吕,菁戚,李越希,杨华凤,潘明洁,王正茂申请人:李越希