专利名称：人膜协同因子蛋白小基因pMCP的构建方法
技术领域：
本发明涉及病原生物学领域。
背景技术：
按照致病对象的不同可以把病原体分为三类，其中绝大多数病原体即感 染人类，也可以感染动物，是人畜共患病的病原体，如狂犬病毒、禽流感病
毒等；第二类是只感染动物的病原体，如新城疫病毒；第三类是只感染人类
的病原体，这类病原体种类不多，但却可能给人类带来极大的损害，如淋病
奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、麻疹病毒、人疱疹病毒-6、 HIV等，给人类社会带
来的损失可以说是众所周知。人类是这些病原体的唯一宿主，其致病机理和 防治策略均缺乏有效的动物模型，因而受到很大的限制。有的研究者采用细 胞模型或者组织培养模型研究人类特异性病原体与宿主细胞间的相互作用及 对细胞内基因表达的影响，这种研究显然缺乏整体环境，不能代表体内事件，
而且也只能得到某层面的信息；也有利用人类志愿者模型进行研究的报道， 但是应用的深度和广度受到伦理学的制约；也可利用药物处理动物，使其容 易感染所有病原体，其中也包括人类特异性病原体，这种动物本身免疫功能 低下，只适合疫苗的保护力研究，而且模型动物也不能传代，只能临时制备， 因而重复性受到影响。
目前制备转基因动物的技术成熟而有效，为制备人类疾病动物模型方面 提供了一种新的方法。转基因技术在动物原来遗传背景的基础上改变某种基 因的表达水平以建立人类疾病的动物模型，这种模型产生疾病的原因清楚(由 转入的外源基因引起)，模型动物的症状单一，接近于病人的症状。已经有神 经系统疾病、肿瘤、心血管疾病、皮肤病、传染病等多种领域的转基因动物 模型产生。如将癌基因c-myc置于小鼠乳腺肿瘤病毒(mMTV)基因启动子调
节下获得了转基因小鼠，这些小鼠在胸部、睾丸和淋巴组织等部位都可引起
肿瘤。又如将HBV DNA导入C57BL/6J小鼠，制备的转基因小鼠在肝复制 HBV，在血中释放病毒粒子，可作为HBV携带者的模型。
但是，目前许多人类特异性病原体感染性疾病的转基因动物模型仍然没 有开发成功。
人膜协同因子蛋白(Membrane CofactorProtein，MCP)是淋病奈瑟菌、 脑膜炎奈瑟菌、乙型链球菌、麻疹病毒、人疱疹病毒-6型等数种病原体的受 体，决定了这些病原体感染人类的宿主特异性。
发明内容
本发明目的在于发明一种MCP小基因pMCP的构建方法，通过该方法 获得MCP小基因pMCP，通过pMCP进一步建立转基因动物模型，即解决 病原体感染动物的侵入靶点的技术难题，从而实现病原体对动物模型的感染。
本发明技术方案是
首先以人血细胞基因组DNA为模板，采用PCR方法，克隆人膜协同因 子蛋白基因的启动子；以pSG5-MCP为模板扩增人膜协同因子蛋白cDNA; 然后采用重叠PCR方法将MCP启动子和cDNA拼接起来，用获得的DNA 片段替换出pcDNA3.1中的CMV启动子，构建成人膜协同因子蛋白小基因 pMCP。
用限制性内切酶消化上述方法构建的MCP小基因pMCP，凝胶电泳回收 其中的MCP基因片段，得到制备MCP转基因小鼠的基因构件，溶解于显微 注射稀释液，通过显微注射法制备转基因小鼠。用这些转基因小鼠研究以 MCP为受体的人类特异性病原体感染。
通过本发明方法建立的转基因小鼠可改变以往人类特异性病原体感染性 疾病研究中缺乏理想动物模型的局面，突破相应病原体感染致病机理、疫苗 评价、药物评价等方面的限制。
本发明中，克隆MCP基因的启动子时，以人的血细胞基因组DNA为模 板，扩增的上、下游引物序列为
5'-GCACGCGTGGTAACTGCCAGAAATTCTTTA-3'禾口
5'- GTACAGCAGCAACACCATGG画3'，上游引物5'端引入Mw I酶切位点。
克隆cDNA时，以pSG5-MCP为模板扩增MCP cDNA，扩增的上、下游
引物序列分别为
5'-GGAGAAATAACAGCGTCTTCC -3邻
5'-CGGGTACCGCAATATTAG CTAAGCCACAGT-3'，下游引物5'端引 入Xp"I酶切位点。
图1为本发明的构建示意图。
具体实施例方式
本发明的构建过程如图l所示，分为以下步骤
1、受体MCP小基因的构建
(1) 利用PCR技术，以人血细胞基因组DNA为模板扩增MCP的启动
子
扩增的上下游引物序列如下 5'-GCACGCGTGGTAACTGCCAGAAATTCTTTA-3'和5'-GTACAGCAGCAACACCATGG-3'，上游引物5'端引入Mw I酶切位点。
50jxlPCR扩增体系包括5(illOx缓冲液，2mmol/LMg2+， 200 pmol/L dNTPs， 200nmol/L正、反向引物，2吗人血细胞基因组DNA， 2.5ULATag DNA聚合酶。30次循环的PCR程序为94°C/50 s (第一次循环为5 min)， 57°C/40S， 72°C/2min (最后一次循环为10 min)。扩增产物用1%琼脂糖凝 胶进行电泳分析并回收纯化。
(2) 用PCR技术，以pSG5-MCP为模板扩增MCP cDNA: 上下游引物序列分别是5'-GGAGAAATAACAGCGTCTTCC -3'和
5'-CGGGTACCGCAATATTAG CTAAGCCACAGT-3'，下游引物5'端引入
K/^2 1酶切位点。50^1PCR反应体系包括5(!llOx缓冲液，2mmol/LMg2+， 200 pmol/L dNTPs， 200nmol/L正、反向引物，100 ng pSG5 DNA， 2.5ULATagDNA
聚合酶。30次循环的PCR程序为94°C/30 s (第一次循环为5 min)， 57°C/30 s， 72°C/2 min (最后一次循环为10 min)。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳 分析并回收纯化。
(3) 采用重叠PCR技术，把MCP启动子和cDNA拼接起来形成完整 的MCP小基因
第一步50 (il反应体系包括50 ng MCP启动子，50 ng MCP cDNA， 5 |il lOx缓冲液，2mmol/LMg2+， 200 pmol/L dNTPs， 2.5 U LATag DNA聚合酶。 IO次循环的PCR程序为94°C/30s (第一次循环为5 min)，65°C/l min，72°C/2 min (最后一次循环为10 min)。
第二步待上述反应结束之后，从中吸去2pl混合液，再分别加入MCP 启动子上游引物和MCP cDNA下游引物各200 nmol/L，然后进行25次循环 的PCR程序:94°C/30 s (第一次循环为5 min)， 58°C/30 s， 72°C/2.5 min (最 后一次循环为10min)。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。目的片段 回收纯化后用于克隆入pMD18-T载体。
(4) 用Mw I禾n Ap" I对pMD18-MCP进行双酶切，以Agarose Gel DNA Purification kit回收纯化其中的MCP基因片段，亚克隆入pcDNA3.1中M/w I 和I酶切位点之间，即用MCP基因片段替换掉pcDNA3.1中的CMV启 动子，得到MCP小基因pMCP，即真核表达载体pMCP。
2、显微注射法制备人膜协同因子蛋白转基因小鼠
此部分利用常规显微注射技术建立MCP转基因小鼠。重组载体pMCP 经Bg/ II和A^r I酶切线性化，用QIAquick Gel Extraction Kit凝胶回收其中 含MCP基因的目的片段，以约3 pg/ml的浓度溶解于DNA稀释液(10 mM Tris， O.lmMEDTA， pH7.5)中。取C57BL/6小鼠用8 IU/只剂量PMSG和 HCG进行超数排卵。受精卵取出后于M2培养液中进行显微注射。注射后的 受精卵转移到假孕母鼠的输卵管中。F0代小鼠出生后剪小鼠尾巴，提取基因
组DNA，用PCR初步筛选基因组中整合有目的基因的转基因小鼠，并用 Southern Blotting技术确认，然后用免疫组织化学方法检测目的基因在转基因 小鼠体内的表达。表达阳性F0代小鼠得到后繁殖传代，同样检测后代小鼠 中基因整合并表达的阳性小鼠，从而得到MCP转基因小鼠品系。
3、 转基因小鼠模型的应用
MCP转基因小鼠模型建立后可用于多种以MCP为受体病原体感染的研 究，包括淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、乙型链球菌、麻疹病毒、人疱疹病毒 -6型等。
4、 说明
1、 人膜协同因子蛋白启动子为已经发表的序列(GenBank收录号 S65879)。参考文献Cui WY, Hourcade D, Post T, et al. Characterization of the promoter region of the membrane cofactor protein gene of the human complement system and comparison to a membrane cofactor protein-like genetic element . J Immunol, 1993， 151(8): 4137-4146
2、 人膜协同因子蛋白cDNA为己经发表的序列(GenBank收录号 X59405)。参考文献Post TW, Liszewski MK, Adams EM, et al. Membrane cofactor protein of the complement system: alternative splicing of serine/threonine/proline-rich exons and cytoplasmic tails produces multiple isoforms that correlate with protein phenotype. J Exp Med， 1991, 174(1): 93-102
3、 pcDNA3.1真核表达载体为Invitrogene公司公开销售的产品。
<110>扬州大学
<120>人膜协同因子蛋白小基因pMCP的构建方法
<160>4
<210〉1 <211>30 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223〉根据人血细胞基因组DNA片段设计 <400>1
gcacgcgtgg taactgccag aaattcttta
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213〉人工序列
<220〉
<223>根据人血细胞基因组DNA片段设计 <400〉2
gtacagcagc aacaccatgg
<210>3 <211〉21 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据pSG5-MCP设计 <400>3
ggagaaataa cagcgtcttc c
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据pSG5-MCP设计 <400>4
cgggtaccgc aatattagct aagccacag
权利要求
1、人膜协同因子蛋白小基因pMCP的构建方法，其特征在于首先以人血细胞基因组DNA为模板，采用PCR方法，克隆人膜协同因子蛋白基因的启动子；以pSG5-MCP为模板扩增人膜协同因子蛋白cDNA；然后采用重叠PCR方法将MCP启动子和cDNA拼接起来，用获得的DNA片段替换出pcDNA3.1中的CMV启动子，构建成人膜协同因子蛋白小基因pMCP。
2、 根据权利要求1所述人膜协同因子蛋白小基因pMCP的构建方法， 其特征在于克隆人膜协同因子蛋白基因的启动子时，以人血细胞基因组DNA 为模板，扩增的上、下游引物序列为5'-GCACGCGTGGTAACTGCCAGAAATTCTTTA画3'和5'-GTACAGCAGCA ACACCATGG-3'，上游引物5'端引入M/w I酶切位点。
3、 根据权利要求1或2所述人膜协同因子蛋白小基因pMCP的构建方 法，其特征在于克隆人膜协同因子蛋白cDNA时，以pSG5-MCP为模板进 行扩增，扩增的上、下游引物序列分别为 5'-GGAGAAATAACAGCGTCTTCC -3，和5'-CGGGTACCGCAATATTA GCTAAGCCACAGT-3'，下游引物5'端引入KpnI酶切位点。
全文摘要
人膜协同因子蛋白小基因pMCP的构建方法，涉及病原生物学领域。首先以人血细胞基因组DNA为模板，采用PCR方法，克隆人膜协同因子蛋白基因的启动子；以pSG5-MCP为模板扩增人膜协同因子蛋白cDNA；然后采用重叠PCR方法将MCP启动子和cDNA拼接起来，用获得的DNA片段替换出pcDNA3.1中的CMV启动子，构建成人膜协同因子蛋白小基因pMCP。通过本发明方法建立的转基因小鼠可改变以往人类特异性病原体感染性疾病研究中缺乏理想动物模型的局面，突破相应病原体感染致病机理、疫苗评价、药物评价等方面的限制。
文档编号C12N15/12GK101173280SQ20071013380
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者季明春, 朱立天, 李国才, 潘兴元, 焦红梅, 王劲松, 王晓红, 龚卫娟 申请人:扬州大学