专利名称：一种简单高效地制备cik细胞的方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤过继免疫治疗中一种简单高效地制备CIK细胞的方法。
背景技术：
CK细胞是以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群。1989年Yun等研究人员以CD3单抗 扩增小鼠脾细胞得到了一个细胞群，命名为CD3激活的杀伤细胞(CD3-AK) ( Yun YS, Hargrove ME ,Ting CC. In vivo antitumor activity of anti-CD3-induced activated killer cells. Cancer Res，l 989,49(17):4770-4774.)。在此工作基础上，Schmidt-Wolf等(Schmidt-WolfIGH, Negdn RS, Kiem HP, et al. Use of a SCID Mouse /Human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. J Exp Med， 1991, 174-139.)以IFN-y, IL-2, CD3McAb, IL-1共培养人外周血单个核细胞，得到了一个有强大抗肿瘤活性的细胞群，即为 CIK细胞。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤谱广、杀伤活性高、对耐药肿瘤株依然敏感、对 正常骨髓造血前体细胞毒性小等许多优点。这些优点加速了CIK细胞在临床应用方面的研究， 目前在我国已批准进入了临床II期实验阶段。
在传统CIK细胞的培养过程中，IFN-y、 CD3McAb、 IL-2是必需的细胞因子。目前临床 使用的CIK细胞，其培养方法是由Schmidt-Wolf等所创(Schmidt-WolfIGH, Grimm B, Brandt K， et al. Propagation of large numbers of cells of a human mixed-lineage T-lymphoid/myeloid. Br J Haematol, 1995,卯512-517.)，遵循以下常规。(1)抽取足量患者自体的血液，分离其中的 外周血单个核细胞；(3)清洗沉淀细胞多用磷酸缓冲液；(2)用含有10%异源AB血清的 RPMI 1640完全培养基进行培养；(4)只单一用IFN-Y预先孵育24小时。
PHA作为有丝分裂原，是一种非特异性的多克隆激活剂，能使T淋巴细胞群所有克隆都 激活，促进细胞快速扩增。华东理工大学谭文松等提出用PHA和CD3McAb两种因子联合激 活脐血来源的单个核细胞，增强细胞的体外扩增能力，在细胞被激活后对这两种因子洗脱， 而后置于搅拌式生物反应器中培养获得CIK细胞(专利申请号200310109565.5，名称一 种CIK细胞的体外培养方法)。
BIOTARGET-1培养基是BIOLOGICAL INDUSTRIES专门为培养外周血淋巴细胞而开发 的一种新型的无血清培养基，其配方基于Abitorabi等发明的无血清培养基(美国专利申请号 20060073591;名称Cell culture media)。
现有的CIK细胞培养方法存在的不足
目前临床应用中，常规的CIK细胞培养方法为抽取患者外周血50 200ml，肝素抗凝， 经等量Ficoll分离液(比重1.077g/cm"密度梯度离心30分钟后，吸取单个核细胞层，用含10 xab血清的RPMI1640调至2Xl()6/ml，加入重组人IFN-y 1000U/ml，置于37°c 5%C02的 培养箱中培养24小时后，加CD3McAb 50ng/ml、重组人IL-2 300U/ml和IL-1 100U/mL继续培养2 3天，以后每2 3天更换新鲜培养液，调整细胞数为2X106/1！11，同时补加IL-2 300 U/ml，两周后分批收集细胞进行回输。
此方法中大量抽取患者的外周血会对患者的虚弱的身体造成应激，增加造血系统的负担， 一定程度上会影响治疗的效果。培养基中含有10%AB异源血清，其中的未知成份在各批次 间差别较大，会对细胞培养导致不可预料的结果，而且病原体微生物可能由血清导入，如果 用于临床会引起副作用。由于没有有丝分裂原PHA的预先刺激，细胞生长相对缓慢。
谭文松等的方法进行商业化推广还有一定的难度。其单个核细胞来源于脐血，脐血收集 的技术要求很高， 一般科室没有专门的人才。PHA和CD3McAb两种因子联合激活细胞后将 被洗脱，使得之后细胞的扩增效率会有所下降。此外，该方法所使用的几种细胞培养基中含 有10XAB异源血清，因此也存在血清中的未知成份或病原体微生物带来的不利影响
发明内容
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本发明的目的是使CIK细胞的培养简单高效化，易被医疗机构所掌握，满足临床研究和 治疗的需要。
本发明涉及的方法包括以下流程取0型健康献血者新采的全血经成分血分离后富含白 细胞的残液，经比重为1.077g/cmS的Ficoll液密度梯度离心(1500rpm 35 min)，取界面层的 外周血单个核细胞，生理盐水洗涤2次，悬浮于无血清的BIOTARGET-l培养基中，调整细 胞浓度为2X10Vml，加入PHA100ng/ml和IFN-Yl000U/ml，置于37°C 5%<302的培养箱中 培养24小时，加入CD3McAb 50ng/ml， IL-2 300U/ml，于相同条件下继续培养，视生长情况 进行传代培养和更换新鲜培养液，并且补加IL-2 300 U/ml，从第14天起每两天一次收集细胞， 整个周期约为30天。
本发明的培养所需的外周血单个核细胞，来源于血站O型健康献血者新采的全血经成分 血分离后富含白细胞的残液，所以材料容易获得。无血清的BIOTARGET-l培养基组分清晰， 避免因血清中未知的成份导致的不可预料的结果。采用生理盐水清洗沉淀细胞是为了避免使 用可能对机体有害的物质，如磷酸缓冲液。之所以在最初的24小时用PHA和IFN-y对细胞 进行刺激，是因为PHA作为有丝分裂原可以增加扩增效率，IFN-y是诱导细胞具有杀瘤毒性 所必需的。
附图可以更好的说明本发明的意义和效果，而不是对本发明的限定。 图1为培养0天、14天和28天的CIK细胞纯度分析。 图2为培养0天、14天和28天的CIK细胞的扩增倍数。
图3为培养14天时CIK细胞对人白血病细胞株(K562)、肺腺癌细胞株(SPCA-1)、宫颈癌 细胞株(HeLa)的杀伤活性。
具体实施方式
实施例1
从红十字血站购得单人份200ml全血经成分血分离后富含白细胞的残液，离心(500rpm 10min)，弃上清，沉淀细胞用生理盐水重悬浮，将悬浊液平铺于Ficoll液，密度梯度离心(1500 rpm 35 min)，吸取界面层的外周血单个核细胞，生理盐水洗涤2次，用无血清BI0TARGET-1 培养基调整细胞浓度为2X 106/ml，加入PHA 100ng/ml和IFN-y 1000U/ml，置于37°C 5%C02 的培养箱中培养24小时，加入CD3McAb50ng/ml， IL-2 300U/ml，相同条件下继续培养，每 2 3天观察细胞长势，根据细胞生长的密度进行传代培养或用含IL-2 300U/ml的新鲜培养液 稀释细胞后继续培养。
培养至第14天和第28天，用流式细胞仪分析细胞的抗原表型，鉴定出CIK细胞中主要 效应细胞——CD3+CD56+T细胞，纯度分别为42.38%和61.72%;而0天时外周血单个核细胞 中CIK细胞的纯度为1.81%。(见图l)
在第14天和第28天时，细胞的扩增倍数分别为140倍和720倍左右。(见图2) 在14天时将CIK细胞分别与人白血病细胞株(K562)、肺腺癌细胞株(SPCA-l)和宫颈癌 细胞株(HeLa)以10:1的效靶比混合，MTT法检测其杀瘤活性分别为74.2%、 71.7%和58.3%。 (见图3)。
权利要求
1. 一种简单高效地制备CIK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，外周血单个核细胞来源于血站O型健康献血 者新采的全血经成分血分离后的残液(该残液富含白细胞)。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，清洗沉淀细胞所用的溶液为医用生理盐水。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无血清培养基为不含各种血清的BIOTARGET-l培养基。
5. 根据权利要求1和权利要求4所述的方法，其特征在于，Ficoll液分离获得的外周血单个 核细胞先用含100ng/ml pha和1000U/ml IFN-y的无血清培养基稀释至2X 1()S个/ml后培养24小时左右。
6. 根据权利要求1和权利要求5所述的方法，其特征在于，培养体系在添加CD3McAb和IL-2之前无需对悬浮的细胞进行离心沉淀和清洗。
全文摘要
本发明公开了一种简单高效地制备CIK细胞的方法。本发明利用O型健康献血者成分血中的白细胞，在无血清悬浮培养条件下，用植物血凝素等多种因子刺激其增殖，经过培养和多次传代即可获得数量非常可观的CIK细胞。本发明的操作步骤简单，细胞扩增倍数高，体外杀瘤活力强，无主要组织相容性限制，可以作为CIK细胞培养的常规方法。
文档编号C12N5/08GK101418283SQ20071013383
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月23日 优先权日2007年10月23日
发明者周曙明, 范云峰 申请人:范云峰