专利名称：广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及微生物学领域。
背景技术：
绿色荧光蛋白(GFP)是一种理想的示踪标记，已经在生物技术、细胞生 物学、转基因动物、环境工程、微生物学等领域得到广泛的应用。但是，目 前要在特定宿主细胞表达外源蛋白(也包括GFP)，必须使用与宿主细胞相适 应表达载体。对于原核表达系统来说，大肠杆菌是广为使用的表达外源基因 的宿主菌，其原核表达载体中使用的启动子类型主要有基于lac操纵子的启动 子、T7噬菌体启动子、入噬菌体PL启动子、碱性磷酸酶phoA启动子等。含 这些启动子的载体表达外源蛋白时都需要满足特定的诱导条件，而且还需要 特定基因型大肠杆菌作为外源基因表达的宿主菌。诱导lac启动子需要cAMP 激活蛋白，即CAP，而在含葡萄糖的培养环境中CAP含量很低，外源基因不 能表达。也就是说含lac启动子载体必须在无葡萄糖培养时才能表达外源蛋 白，而且还需要补加IPTG诱导。但是IPTG价格昂贵，不能用于大量诱导。 用T7噬菌体启动子时，宿主菌细胞内必须能提供T7噬菌体基因1的产物， 即T7噬菌体RNA聚合酶，要么由感染性A噬菌体提供，要么由插入大肠杆 菌染色体的基因产生， 一般采用的溶源性细菌BL21 (DE3)，其中T7噬菌体 基因1是受控于IPTG诱导的lac UV5启动子。用入噬菌体PL启动子时，其 受控于温度敏感阻抑物clts857，宿主菌必须携带clts857基因，阻抑物clts857 在低温下启动表达，高温时不能。phoA启动子是碱性磷酸酶启动子，在过量 磷酸盐存在时被抑制，磷酸盐饥饿时被逐渐诱导，外源基因与编码phoA信号 肽序列融合，当蛋白分泌到细菌内外膜之间时被信号肽酶切割，因而适宜表 达分泌型蛋白。
因此，目前没有任何一种表达载体可在所有类型(包括野生型)的大肠 杆菌中都能进行外源基因的表达，更不用说能在多种宿主细菌中表达的广谱 型表达载体了。
发明内容
本发明目的是发明一种于普通生长条件下均可表达绿色荧光蛋白(GFP) 的广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体。
本发明技术方案是PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子，将 Amp启动子与绿色荧光蛋白结构基因连接，得到以其启动绿色荧光蛋白表达 的广谱型原核表达载体。
本发明利用能在细菌中广泛发挥作用的氨苄青霉素抗性基因(Amp)的 启动子构建了一种广谱型GFP表达载体，所构建的载体表达GFP不受细菌型 别和种类的限制，也不受细菌生长环境的限制，只要转化进细菌细胞，即可 发挥作用，表达GFP，因而大大扩展了应用领域。
本发明包括以下步骤
1) 以pcDNA3为模板通过PCR方法扩增Amp启动子，亚克隆进pGEMT 载体，然后用户^11和^附//1消化，凝胶电泳回收Amp启动子；设计Amp 启动子的序列上、下游引物时，在上游引物中引入尸w II酶切位点，下游引 物中引入Bam//1酶切位点；
2) 用尸vwn和^W2/ZI消化pEGFP质粒，回收载体框架；
3) 将步骤2)回收的载体框架与Amp启动子连接，得到广谱细菌宿主绿 色荧光蛋白表达载体pAEGFP。
pAEGFP转化入各种细菌菌株中，在可见光和紫外线激发条件下分别检 测相应菌株转化后GFP的表达。表达菌株提取质粒，用酶切和PCR方法检测 Amp启动子和GFP基因确实存在于菌株细胞中。用本质粒构建的工程菌进行 示踪研究。
另，本发明中，PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子的步骤包括:
1) 从含Amp启动子的质粒中用引物扩增出Amp启动子；
2) 将扩增的产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯化；3) 把纯化的Amp启动子与pGEMT载体在16"环境条件下连接2 h，取 出，置于-2(TC环境中；
4) 用一步法试剂制备大肠杆菌DH5a感受态细胞，并将上述连接产物转 化进感受态细胞，挑取长出的白色菌落扩培后小量制备质粒DNA， 1%琼脂 糖凝胶电泳分析，筛选出携带目的DNA片段的重组质粒，即Amp启动子。
以质粒pcDNA3作为模板扩增Amp启动子的上、下游引物序列为 CGp在GCTC5GACGTC AGGTGGC ACTTT ， CGG拳TCCACTC TTCCTTTTTCAATATTAT。
图1为本发明构建的广谱细菌宿主GFP表达载体的结构示意图。 图2为携带pAEGFP的大肠杆菌DH5 a菌落在紫外光激发下的图像。 图3为携带pAEGFP的大肠杆菌BL21菌落在紫外光激发下的图像。 图4为携带pAEGFP的伤寒杆菌无鞭毛株菌落在紫外光激发下的图像。 图5为携带pAEGFP的伤寒杆菌有鞭毛株菌落在紫外光激发下的图像。 图6为携带pAEGFP的大肠杆菌分离株菌落在紫外光激发下的图像。
具体实施例方式
1、 Amp启动子的扩增
根据Amp启动子序列设计引物，并分别于上下游引物中引入PvuII和 BamH I 酶切位点，上下游引物序列为 CGC!GClTGGACGTCAGGTGGCACTTT ， CGGGATC6aCTC
TTCCTTTTTCAATATTAT 。
小量提取质粒pcDNA3作为模板扩增Amp启动子，50 pl PCR扩增体系包 括5jxll0x缓冲液，2mmol/LMg2+， 200 pmol/L dNTPs， 200nmol/L正、反向 引物，lngpcDNA3， 2.5 U LA Tag DNA聚合酶。30次循环的PCR程序为 94°C/30 s(第一次循环为5 min)，55°C/30 s，72°C/20 s(最后一次循环为5 min)。 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯化。
参照TaKaRa公司的DNA Ligation Kit说明书把扩增的Amp启动子进行T 克隆，即与pGEMT载体连接，反应体系含pGEMT50ng、 Amp启动子10ng、Ligation buffer I 5 ul，其中Amp启动子与pGEMT摩尔比大于3:1。 16℃连接2 h，取出置于-20℃备用。用上海生工的一步法试剂制备大肠杆菌DH5a感受 态细胞，并将上述连接产物转化进感受态细胞，挑取长出的白色菌落扩培后 小量制备质粒DNA， 1。％琼脂糖凝胶电泳分析，筛选可能携带目的DNA片段 的重组质粒，用尸vm II和Bam/ZI进行酶切鉴定。
2、 广谱型GFP表达载体的构建
含Amp启动子的pGEM载体用PvwII和BanHI进行酶切。50ul酶切反 应体系含pGEM-Amp 10ug、10XH Buffer 5ul、Pvu II和BamHI各20 U，用 水补足到50ul， 37°C酶切4h后进行l^琼脂糖凝胶电泳，长波长紫外灯下 用刀片将含Amp启动子的凝胶条带切下，用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Purification kit进行回收纯化。
回收产物与经PvuII和BamHI消化后凝胶回收的pEGFP载体骨架区(大 片段)进行连接。即，用Amp启动子替换pEGFP载体中lac启动子。
连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞。长出的菌落扩培后提取质粒， 凝胶电泳分析是否含有重组载体pAGFP,并用Amp启动子的引物作PCR进 行进一步验证。
3、 广谱型GFP表达载体的应用
把pAGFP分别转化入大肠杆菌DH5 a 、大肠杆菌BL21、伤寒杆菌无鞭毛 株、伤寒杆菌有鞭毛株、分离株大肠杆菌后，分别获得携带pAEGFP的大肠 杆菌DH5a菌落、大肠杆菌BL21菌落、伤寒杆菌无鞭毛株、伤寒杆菌有鞭 毛株、分离株大肠杆菌菌落。
含pAGFP的各菌株在可见光下观察即可见到淡淡的蓝绿色荧光，在紫外 光激发下则发出很明亮的绿色荧光。如图2 6所示。
同样的上述5株菌株，用pEGFP载体转化后，在不诱导的条件下，均未 能观察到绿色荧光蛋白的表达。
总结本发明所构建的广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体，在普通生 长条件下均可表达绿色荧光蛋白(GFP)。
<110>扬州大学
<120>广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法
<160>2
<210>1 <211>26 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pcDNA3基因序列设计 <權>1
cgcagctgga cgtcaggtgg cacttt
<210>2 <211〉29 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pcDNA3基因序列设计 <400>2
cgggatccac tctccttttt caatattat
权利要求
1、广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法，其特征在于PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的启动子，将Amp启动子与绿色荧光蛋白结构基因连接，得到以其启动绿色荧光蛋白表达的广谱型原核表达载体。
2、 根据权利要求1所述广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方 法，其特征在于包括以下步骤1 )以pcDNA3为模板通过PCR方法扩增Amp启动子，亚克隆进pGEMT 载体，然后用PvulI和mT/I消化，凝胶电泳回收Amp启动子；设计Amp 启动子的序列上、下游引物时，在上游引物中引入Pvull酶切位点，下游引 物中引入Sam//1酶切位点；2) 用pvu II和BamHI消化pEGFP质粒，回收载体框架；3) 将步骤2)回收的载体框架与Amp启动子连接，得到广谱细菌宿主 绿色荧光蛋白表达载体pAEGFP。
3、 根据权利要求2所述广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方 法，其特征在于PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子的步骤包括1) 从含Amp启动子的质粒中用引物扩增出Amp启动子；2) 将扩增的产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯化；3) 把纯化的Amp启动子与pGEMT载体在16℃ 环境条件下连接2 h，取 出，置于-20℃ 环境中；4) 用一步法试剂制备大肠杆菌DH5 a感受态细胞，并将上述连接产物转 化进感受态细胞，挑取长出的白色菌落扩培后小量制备质粒DNA， 1%琼脂 糖凝胶电泳分析，筛选出携带目的DNA片段的重组质粒，即Amp启动子。
4、根据权利要求3所述广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法， 其特征在于以质粒pcDNA3作为模板扩增Amp启动子的上、下游引物序列 为CGCAGCTGGACGTCAGGTGGCACTTT， CGGGATCCACTC TTCCTTTTTCAATATTAT。
全文摘要
广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法，涉及微生物学领域。技术方案是PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子，将Amp启动子与绿色荧光蛋白结构基因连接，得到以其启动绿色荧光蛋白表达的广谱型原核表达载体。本发明利用能在细菌中广泛发挥作用的氨苄青霉素抗性基因(Amp)的启动子构建了一种广谱型GFP表达载体，所构建的载体表达GFP不受细菌型别和种类的限制，也不受细菌生长环境的限制，只要转化进细菌细胞，即可发挥作用，表达GFP，因而大大扩展了应用领域。
文档编号C12N15/70GK101173296SQ20071013380
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者季明春, 朱立天, 李国才, 潘兴元, 焦红梅, 王劲松, 王晓红, 龚卫娟 申请人:扬州大学