专利名称：丙型肝炎病毒rna依赖的rna聚合酶体外活性测定方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶体外活性测定方法及应用涉及的是一 种利用基因工程技术，制备可溶性的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP酶或 NS5B)蛋白，并制备磁性纳米颗粒。将RNA模板一端固定在磁性纳米颗粒上，加入96 孔反应板微孔内，再加入RNA依赖的RNA聚合酶蛋白等构成RNA复制体系,在磁性纳 米颗粒上复制的RNA双链，掺入标记了生物素。RNA复制后，用外磁场的磁铁将磁性 纳米颗粒吸附在微孔底部，反复洗涤吸附后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素 结合，吸附洗涤后，加入辣根过氧化物酶的底物显色。利用建立的方法，可从中药库 及化合物库内筛选新的RNA依赖的RNA聚合酶的活性抑制剂。本发明涉及基因工程技 术、纳米磁分离富集和RNA相关技术领域。
背景技术：
丙型肝炎呈世界性分布，各国丙型肝炎病毒(HCV)感染率为O. 1% 10%，平均为3%， 约l. 7 2亿人感染HCV。我国也是丙型肝炎高发地区之一，我国一般人群HCV感染率为 3.2%，约3800万人感染HCV。急性HCV感染者中大约有8(^的患者会成为慢性持续性感 染者，其中20%的患者经历20 30年后可进展为肝硬化，1% 5%患者可进展为肝细胞性 肝癌(HCC)。
虽然目前慢性丙型肝炎的抗病毒治疗进入第三阶段，主要应用聚乙二醇干扰素 (PEG-IFN)联合利巴韦林治疗方案,可使半数以上的患者取得持续性病毒应答，但是 对于聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)联合利巴韦林的治疗,还有一部分患者的疗效应答不 理想,这一部分患者的治疗是慢性丙型肝炎研究领域的一个难题。因为慢性丙型肝炎患 者可供选择的治疗药物种类非常有限，因此，探索新的治疗药物是当务之急。可以预期， 丙型肝炎非结构3区、非结构5B区(HCVNS3、 NS5B)蛋白酶等特异靶点抑制剂的临床 应用，将进入到慢性丙型肝炎抗病毒治疗的第四个阶段,必将进一步提高持续性病毒 应答。
丙型肝炎病毒(HCV)是一条长约9.6kb的正链RNA,包括5'非编码区(5' -UTR)、 开放读码框架(ORF)以及3'非编码区(3' -UTR) 。 ORF翻译产生一条多肽链,它随后 被加工成至少10种不同的蛋白质，其中包括l种壳(核心)蛋白，2种包膜蛋白(E1和E2) 和5种非结构蛋白(NS2 ,NS3 ，NS4 , NS5A和NS5B)。其中NS5B蛋白是一种RNA依赖的 RNA多聚酶(RDRP),它是HCV复制的关键酶。
重组HCV NS5B聚合酶蛋白具有模板引物依赖性，能在体外用HCV 3'端的相同核 苷酸作为复制引物，起始HCV RNA负链的合成。这一研究成果为建立细胞外复制模型 奠定了基础。分子水平高通量HCV聚合酶模型，与整体动物和组织器官的筛选相比较， 分子水平的HCV聚合酶药物筛选模型具有材料用量少，药物作用机制比较明确，可实 现大规模的筛选等特点。理论上讲，阻断上述病毒复制周期的NSSB聚合酶，可抑制病 毒复制。
开展以丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶(HCV RDRP酶)为靶位的抗病毒药物的筛 选，首先要进行RNA依赖的RNA聚合酶活性的测定。因此，RNA依赖的RNA聚合酶活性的 测定的新方法和新模型的建立正日益受到重视。目前，国外对该酶活性的体外测定方 法进行了研究，并用于酶抑制剂的筛选。但是建立的活性测定方法复杂、不实用，主 要使用同位素标记技术。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供一种丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶 (RDRP酶或NS5B蛋白)体外测定方法及应用，是利用基因工程技术，制备可溶性的 丙型肝炎病毒NS5B蛋白，并制备磁性纳米颗粒。将RNA模板一端固定在磁性纳米颗 粒上，加入96孔反应板微孔内，再加入RNA引物、NS5B蛋白、核糖核酸(NTP)、生 物素标记的11位尿苷三磷酸(Biotin-ll-UTP)等构成RNA复制体系，在磁性纳米颗 粒上复制的RNA双链，掺入标记了生物素。RNA复制后，用外磁场磁铁将磁性纳米颗 粒吸附在微孔底部，反复洗涤吸附后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素结合， 吸附洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)的底物显色。加入NS5B蛋白酶抑制剂，可 抑制RNA的复制，阻断显色。利用建立的方法，从中药库及化合物库内筛选新的NS5B 蛋白酶活性抑制剂。本发明涉及基因工程技术、纳米磁分离富集和RNA相关技术领 域。
丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶体外活性测定方法及应用是采取以下方案实 现的 1. NS5B片段的PCR (聚合酶链反应)扩增 利用PCR技术扩增C端截短21个氨基酸的HCV NS5B基因片断(HCV NS5B-C21)。 2.表达HCV NS5B-C21蛋白片段重组质粒的构建
提取质粒pET28a(+)，用^s历H I和i7w I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片 段，溶于去离子水内。同样用Sa/* I和J力o I双酶切PCR扩增的NS5B-C21蛋白基因
片段，电泳回收后，溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连 接，使NS5B蛋白基因片段插入到载体pET28a(+)内的^g』I和i7w I位点之间，与 载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。 3.重组质粒和表达融合蛋白工程菌的筛选与鉴定
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60ug/ml)LB平板，置 37°C过夜。次日随机挑取转化菌落和一个对照菌，对照菌为质粒pET28a转化菌，诱 导表达的目的蛋白，收集菌体进行十二垸基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 检测，重组子表达相对分子量约为65 kD的HCV NS5B-C21蛋白，而对照菌BL21(DE3) 无此蛋白带。
将筛选出的阳性克隆表达菌提取质粒进行PCR扩增鉴定和酶切鉴定，鉴定正确的 质粒进行测序，测序结果完全正确。
4. 表达的NS5B-C21蛋白的纯化
1) 表达NS5B蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，冰浴超声破菌， 离心收集上清，弃沉淀。收集的上清液用于下一步的亲和纯化。
2) 镍琼脂糖凝胶(Ni-S印harase 6 Fast Flow)亲和层析法纯化 将镍琼脂糖凝胶(Ni-S印harase6FastFlow)亲和层析柱连接至常压层析系统，
先用平衡液冲洗平衡，细菌超声裂解上清液加镍琼脂糖凝胶(Ni-S印harase 6 Fast Flow)室温结合，上柱后收集穿过峰。用结合缓冲液洗涤柱子，接着用分别含100raM、 200 mM、 300 mM、 500 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，十二烷基硫酸钠一聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白。
5. 纯化的NS5B蛋白用作抗原检测HCV抗体
将纯化的HCV NS5B蛋白用50 mmol/L的碳酸盐pH9. 6倍比稀释后包被酶联板，
间接酶联免疫法检测已知的抗丙肝病人阳性血清及正常人血清，NS5B-C21蛋白能与 丙肝病人阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明NS5B-C21蛋白有较好抗原性和 特异性。
6. 磁性纳米复合颗粒修饰
首先，液相载体可采用磁性纳米颗粒Si02/(P画A/Fe304) (二氧化硅/(聚甲基丙 烯酸甲脂/四氧化三铁))，将之加入乙醇/水的比例为199/1混合溶液中，为了更好地 分散该颗粒，需将该溶液进一步超声。然后，将氨基硅烷化试剂(APTS)滴加到以上 混合溶液，并在室温下搅拌。最后，利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介 质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗。
在修饰完APTS之后，将以上颗粒加入到含3。/。戊二醛的PB溶液中，并在37'C下 搅拌3小时。该过程中通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上 醛基官能团。反应结束后，利用外加磁场将颗粒从反应介质中分离出，并用PB溶液 反复清洗产物。
所述的液相载体材料包括磁性纳米颗粒、玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、 硝酸纤维膜或尼龙膜。
所述的液相载体表面以具有双活性基团的长链有机化合物进行修饰，常用的具有 双活性基团的长链有机化合物试剂有戊二醛、三羟甲基氨基硅垸、N,N-二乙氧基氨 基丙基三乙氧基硅烷、多聚赖氨酸，可采用其中的一种或其中的两种的组合。
7. 丙型肝炎RNA依赖的RNA聚合酶(HCV RdRp酶)活性测定方法的建立 化学合成RNA模板，并在其5'端进行氨基(-NH2)修饰。合成两种RNA模板，
一个为RdRp酶活性测定通用的poly(A)，长度为20个A，该序列为5' NH2—-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-—3';另一个为HCV RNA的3'端的一段特异序列，该 序列为5' NH2-—CTTGGCGTAATCATGGTCAT---3'。将RNA模板修饰固定在核壳结构 复合磁性纳米颗粒上并加入磁分离微孔反应板微孔内，再加入引物、纯化的RdRp酶， 核糖核酸(NTP)，生物素标记的ll位尿苷三磷酸(Bio-11-UTP)等，构成RNA复制 反应体系。通过掺入生物素标记单体，利用NS5B蛋白的RNA依赖的RNA聚合酶的活 性，使另一条RNA链得到延伸，在外磁场下分离除去非特异性吸附片段，再与酶标记 的亲和素结合，洗涤后，向微孔内加入底物显色剂显色。同时用磁铁吸附后将显色液 转移到96孔酶联板内，用酶联仪测定各孔的吸光值(A450值)。
8.从中药样品库和小分子化合物库内筛选新的NS5B蛋白酶活性抑制剂
用96孔或384孔微孔反应板，每个微孔内加入结合有Poly(A) RNA模板的纳米磁 性颗粒，每个微孔内都形成一个相同的NS5B蛋白酶活性测定体系，在向反应体系内 加入NS5B蛋白酶之前，先向各孔分别加入不同的待筛选抑制剂，待筛选抑制剂为中 药成分或大分子化合物或小分子化合物，同时设立已知NS5B蛋白酶活性特异性抑制 剂阳性对照孔。通过各孔的显色情况即可判定结果，同时用磁铁吸附后将显色液转移 到96孔酶联板内，用酶联仪测定各孔的吸光值(A450值)。
对筛选到的阳性抑制剂，更换RNA模板，用HCV RNA的3'端一段特异RNA作为 模板，再进行抑制试验。
一种丙型肝炎NS5B酶活性测定的方法在丙型肝炎以NS5B为靶位的抗病毒药物的 筛选中的应用，包括筛选大分子化合物库、小分子化合物库或中药库中的抑制剂。
本发明与现有技术相比具有的优点
建立的丙型肝炎病毒NS5B酶活性测定方法有如下优点
1本发明以纳米磁颗粒为反应介质，在微孔反应板内反应，使用生物素标记，以 是否显色判断反应结果，该方法简单、实用、无放射性，可以克服目前的该酶的活性 测定的方法复杂、不实用，主要使用放射性同位素标记技术等缺点。
2. 全长NS5B蛋白一般为包涵体的形式存在，本发明为提高NS5B蛋白的溶解性， 在构建NS5B表达载体时切除了其C端的21aa，结果在E. coli.中表达了高度可溶性 蛋白，避免了对酶活性有影响的变性一复性过程。
3. 本发明体外活性测定采用纳米磁颗粒不仅可以有效捕获生物大分子，而且可以 起到富集和放大检测信号的作用而实现生物大分子的超灵敏识别，正成为特征生物信 息高通量获取的一种重要工具。
4.利用实验室建立的抗病毒中药库筛选HCVNS5B抑制剂，体现了其特有的优越 性和创新性，作用靶点明确，同时又可以阐明中药的作用机理。所以建立NS5B蛋白酶 活性体外测定的安全、方便、适合蛋白酶抑制剂的筛选的新方法是十分必要的。
以下将结合附图对本发明作进一步说明-
图1是本发明1%的Agarose凝胶检测HCV NS5B-C21 PCR扩增产物电泳图。图1 中M表示Marker (TaKaRa DL2000); 1表示NS5B-C21 PCR扩增产物，即图内箭头标 示的位置。 . 图2是本发明表达NS5B-C21蛋白的重组质粒构建流程图。
图3是本发明筛选表达NS5B-C21蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。图3中标号 为1 8表示1 8号重组菌，2 6号重组子均表达相对分子量约为65000的融合蛋 白，即图内箭头标示的位置；M表示低分子量蛋白标准(Pharmacia); C表示对照菌 E. coli BL21 (DE3)。
图4是本发明1%的Agarose凝胶检测阳性重组子的PCR扩增产物和酶切鉴定产物 电泳图。图4中M表示Marker (TaKaRa DL2000); 1表示以阳性重组子为模板的 NS5B-C21 PCR产物；2表示阳性重组子酶切鉴定产物。
图5是本发明亲和层析法纯化NS5B-C21蛋白前后的SDS-PAGE分析结果。图5中 M表示低分子量蛋白标准(Pharmacia); 1表示NS5B-C21细菌裂解上清液；2表示 NS5B-C21穿过峰；3表示含lOOmM咪唑的洗脱液洗脱的目的蛋白；4表示含200mM咪 唑的洗脱液洗脱的目的蛋白；5表示含300mM咪唑的洗脱液洗脱的目的蛋白；6表示 含500mM咪唑的洗脱液洗脱的目的蛋白。
图6是本发明HCV NS5B RdRp酶活性测定方法示意图。
图7是本发明丙型肝炎NS5B酶抑制剂的筛选示意图。图中1表示磁分离微孔反 应板；2表示磁铁板；3为深灰色孔，表示NS5B酶未被抑制；4为灰色孔，表示NS5B 酶被抑制。
具体实施例方式
本发明实施方式的详细说明
丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定 利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21，即C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的基因片断， 将基因片段克隆至质粒pET28a(+)内的/ /力o1位点，将重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)，筛选获得了高效表达NS5B的工程菌，表达的NS5B蛋白约占菌体蛋白总 量的20%左右。IPTG诱导表达，亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE电泳进 行鉴定。 材料和方法
1. 质粒和菌株大肠杆菌BL21 (DE3) 、HCV全长cDNA质粒、原核表达载体pET-28a (+) 均由本室保存。
2. 试剂和仪器高保真DNA聚合酶(Pyrobest DNA Polymerase),脱氧核糖核
酸(dNTP) ， BamHl, Xho I ,质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒为TaKaRa公司产品。异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、 TAE电泳缓冲液、 SDS-PAGE蛋白电泳试剂等由配制(配方参考《精编分子生物学实验指南》)。PCR扩增 仪；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；琼脂糖凝胶电泳装置；蛋白电泳装置 (Bio-Rad公司)；脱色摇床(江苏兴化市分析仪器厂)。
3. 引物设计及合成根据HCV cDNA全长质粒DNA序列，并按构建融合蛋白 6His-pET-28a(+)-NS5B-C-21表达载体的要求，设计一对引物。目的基因为C端截短 21个氨基酸的NS5B(NS5B-C21)。引物设计如下
HCVNS5B-C21P1: 5' -GCGGATCCTCGATGTCCTACACATGGAC-3',
HCVNS5B-C21P2: 5' -CGCTCGAGTTAGCGGGGTCGGGCACGAGAC-3';
上游引物5'加入BamHI酶切位点，下游引物5'加入Xho I酶切位点，按设计由
TaKaRa公司合成。
4. HCVNS5B-C21片段的PCR扩增PCR扩增体系H20:38ul， 2. 5mmol/L dNTP 4ul， 10 Xpyrobest buffer: 5ul，引物Pl和P2各lul， HCV质粒:0. 5ul, Pyrobest ■ Taq 酶0.5ul ; PCR扩增条件:94'C预变性4 min,94。C 30s, 57°C 45s， 72°C 2min, 共30个循环，72'C末次延伸7min。 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
5. HCVNS5B-C21表达载体及重组表达型工程菌的构建将获得的NS5B片段用BamH 1、XhoI双酶酶切，鉴定正确后回收NS5B-C21片段，连接到pET-28a(+)载体上，转 化到表达细菌E.coli BL21(DE3)，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆转化菌。
6. 表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定随机挑选8个转化子接种至含3mlLB培养 基(含卡那霉素50ug/ml)的试管内，37。C振荡培养3h，加IPTG至终浓度lmraol/L， 继续振荡培养诱导3h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测。
7. HCVNS5B-C21表达形式的鉴定用LB液体培养基培养重组工程菌，37'C振摇 扩增转化细菌,测定A值,待A 600nm"0. 4 0. 6时，加入异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷
(IPTG)至终浓度l隱ol/L进行诱导，24。C继续振摇4 5h后，将诱导表达融合蛋白 的600ml工程菌离心，离心条件为转速为5000g每分钟、离心时间20min、温度4。C, 收集菌体重悬于30ml的PB细菌裂解液配比为50隱ol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液(PB) +lmmol/L 二硫苏糖醇(dithiothreitol) +10%甘油(glycerol) +1%表面活性剂
(triton) +20mmol/L咪唑(imidazole) + NaCl (氯化钠)300mmol/L)+ sodium
deoxycholate (脱氧胆酸钠)0. 2mg/ml + lysozyme (、溶菌酶)0. 05mg/ml + PMSF (苯甲基磺酰氟化物)1iMiol/L，冰浴超声破菌，离心条件为转速为5000g每分钟、 离心时间20分钟、温度4'C，收集上清和沉淀包涵体。
8. HCVNS5B-C21蛋白纯化上清溶液加已经平衡的50%Ni-S印harase 6 Fast Flow 凝胶2ml室温结合60min，上样，收集穿透液。用十倍的柱体积的结合缓冲液，该缓 冲液的配比为咪唑2Ommol/L，磷酸盐缓冲液20mmol/L，氯化钠0. 5mol/L， pH7. 4， 洗涤柱子，接着用3ml分别含100、 200、 300、 500 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液， 该缓冲液的配比为磷酸盐缓冲液20mmol/L，氯化钠0. 5mol/L, pH7. 4，洗脱目的蛋白。
9. 酶联免疫吸附测定(ELISA)试验采用间接ELISA检测丙肝病人血清。基本 步骤为用50mmol/L碳酸盐溶液，pH9. 6，稀释NS5B蛋白包被酶联板，每孔100nl,4 。C过夜。次日用封闭液，配比为10腿ol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4, 10%山羊血清，20 %小牛血清，0. 5%酪蛋白(casein) ， 0. 05%硫硫汞，5%蔗糖，封闭，每孔130u 1, 37 。C lh(或4。C过夜)。将待测的丙肝病人阴、阳性血清，用样本稀释液，配比为10mmol/L 磷酸盐缓冲液、pH7.4, 10%山羊血清，20%小牛血清，0. 5°/。 casein， 0. 05%硫硫汞， 0.5mmol/L NaCl， 1:20稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100yl， 37°C 反应30min，用PBST液(10画1/L磷酸盐缓冲液、pH7. 4, 0. 5%吐温_20)洗5遍后， 加1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG，每孔100pl,37。C反应30min，磷 酸盐缓冲液一0.2%土温(PBST)洗5遍，加底物三甲氧基苯甲酸酯(TMB)溶液100ii 1,37'C避光显色10 min，加50nl 4N硫酸混匀终止反应，用酶联仪测定A450值。 结果
1. 目的基因的PCR扩增目的基因扩增片段大小为1710bp，与预期结果相符(见 图1)。
2. pET28a(+)-NS5B质粒构建将目的基因克隆到pET28a(+)载体内，使目的基 因与载体上的6xHis基因融合，翻译阅读框架一致，表达一个融合蛋白，6xHis位于 融合蛋白的N端(见质粒构建流程图2)。
3. 表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定第2、 3、 4、 5、 6号5个转化子表达相对 分子量约为65kD的HCVNS5B-C21蛋白，而1、 7、8号3个转化子无此蛋白带(见图3)。
4. 重组表达质粒pET-28a(+)-NS5B-C21的鉴定以重组表达质粒为模板进行PCR 扩增，能扩增出大小分别约为1710bp的片段。用BamH I 、 Xho I双酶酶切，重组质粒
酶切产物在约1710bp、 5360bp处出现条带，与预期大小相符(见图4)。
5. 重组蛋白的表达及表达形式的鉴定重组菌经诱导明显表达出6His-NS5B-C21 融合蛋白，表达产物6His- NS5B-C21表达产物主要以可溶性形式存在。结果表明，C 端截短21个氨基酸的HCV NS5B蛋白表达成功(见图5)。
6. ELISA试验将纯化的NS5B蛋白与已知不同浓度的牛血清白蛋白共同电泳、 显色后比较，确定纯化的NS5B蛋白浓度约为1. 5rag / ml。用50mmol/L碳酸盐溶液 (p服6) 1:200、 1:400、 1:800、 1:1600倍比稀释后包被酶联板，检测已知l份丙肝 病人阳性血清和l份丙肝病人阴性血清。结果显示，与阳性血清反，不与阴性血清反 应，A450值分别为1.242、 0.708、 0.622、 0.520。说明NS5B蛋白有较好的抗原性和
特异性。
丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶活性体外测定方法及应用 材料和方法 1. 磁性纳米颗粒的修饰首先，将12. 3 mg Si02/(PMMA/Fe304)纳米颗粒加入2. 5ml 乙醇/水(199/l)混合溶液中，为了更好地分散Fe304颗粒，需将该溶液进一步超声30 分钟。然后，将50ul APTS (氨基硅烷化试剂)滴加到以上混合溶液，并在室温下磁 力搅拌7小时。利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出，并用乙 醇溶液(95%乙醇)对其清洗5次。在修饰完APTS之后，将以上颗粒加入到1230ul
(1200ul PB,30ul 25%戊二醛)含5%戊二醛的PB溶液(摩尔浓度为0. 01 mol/L)中， 并在37'C下磁力搅拌3小时。该过程中通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性 颗粒表面修饰上醛基官能团。反应结束后，利用外加磁场将颗粒从反应介质中分离出， 并用PB溶液反复清洗产物，并保存与PB溶液中。
2. 丙型肝炎NS5B酶活性测定新方法的建立
1) 取少量(0. 4mg/管)磁性纳米复合颗粒于PCR管中，用2XSSC洗涤四遍， 加入2XSSC45ul，加入1000 ug/ml 5' NH2，ly(A) 5ul，终浓度为100 ug/ml，同 时加入RNAsin 0.5ul， 37。C摇床2h，使RNA模板5，端氨基与颗粒表面的醛基结合， RNA模板固定在颗粒表面，同时做两管，其中一管正常反应， 一管为对照，对照为下 面的4步中(1) NS5B-C21替换为DEPC处理水。
2) 用1XRNA buffer (20rnM Tris - HC1， pH 7. 5, 20mM KC1， 4mM MgC12, 1 mM EDTA， lmM dithiothreitol)在磁架上洗涤洗涤四遍，依次加入如下反应体系。
反应体系(50ul体系)终浓度初浓度加入量
(1) NS5B-C2115ug/ml15ug/ml5ul
(2) 0ligo(U6) or 0ligo(dT6) 25 ug/ml250 ug/ml5ul
(3) 10X bufferIX buffer10X buffer5ul
(4) dithiothreitollraM10 mM5ul
(5) BSA(小牛血清)0.lmg/mllmg/ml5ul
(6) RNAsin(2500U)0. 5U/ul40U/ul25隐63ul)
(RNA酶抑制剂)
(7) DEPC水24.37ul
反应条件20°C 20min，放置离心机。
4)延伸加入500uM Bio-ll-UTP lul孵育30min 3(TC水浴，终浓度为10 uM。
5) 用2XSSC洗涤四遍，5%BSA封闭，37'C摇床lh。
6) 0. 5M sodium phosphate buffer (pH 7. 0)洗涤四遍。
7) Avidin-Peroxidase l:1000ul (1XPBS稀释)100ul、 37。C摇床30tnin。
8) 0. 5M sodium phosphate buffer (pH 7.0)洗涤四遍。
9) 显色反应TMB避光显色(50ul 10min，室温)。
10) 加50 y 1 4N硫酸混匀终止反应，。
11) 用酶联仪测定A450值。
3.丙型肝炎NS5B酶抑制剂的筛选 利用上步建立的HCV NS5B RdRp酶活性测定新方法筛选抑制剂。将不同的待测抑 制剂分别加入到96孔微孔板各孔中，每种待测抑制剂设2孔，并设2孔已知的阳性 抑制剂噻嗪化物(benzo-1， 2， 4-thiadiazine dervatives)对照空。每孔加入HCV NS5B 蛋白酶。再加入反应缓冲液、Bio-UTP、 NTP、 RNA引物，最后加入结合有RNA模板的 磁性纳米复合颗粒。混匀后3(TC孵育30分钟。反复洗涤吸附后，加辣根过氧化物酶 标记的亲和素，37'C孵育30分钟，反复洗涤吸附后，加入服P的底物TMB进行显色 反应。通过阻断显色反应筛选可抑制RdRp酶活性的抑制剂。 结果
丙型肝炎NS5B酶活性阴性对照和阳性对照的A450值分别为0. 003和0. 930， 说明C端截短21氨基酸的HCV NS5B蛋白有很好的活性。
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA酶聚合酶活性测定的方法，其特征在于(1).NS5B片段的PCR扩增利用PCR技术扩增C端截短21个氨基酸的HCV NS5B基因片断；(2).表达HCV NS5B-C21蛋白片段重组质粒的构建提取质粒pET28a(+)，用Bam HI和XhoI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，同样用BamH I和XhoI双酶切PCR扩增的NS5B-C21蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内；取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使NS5B蛋白基因片段插入到载体pET28a(+)内的BamH I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白；(3).重组质粒和表达融合蛋白工程菌的筛选与鉴定将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素浓度为60μg/ml的LB平板，置37℃过夜；次日随机挑取转化菌落和一个对照菌，对照菌为质粒pET28a转化菌，诱导表达的目的蛋白，收集菌体进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，重组子表达相对分子量约为65 kD的HCV NS5B-C21蛋白，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；将筛选出的阳性克隆表达菌提取质粒进行PCR扩增鉴定和酶切鉴定，鉴定正确的质粒进行测序，测序结果完全正确；(4).表达的NS5B-C21蛋白的纯化1)表达NS5B蛋白工程菌的超声裂解将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，冰浴超声破菌，离心收集上清，弃沉淀，收集的上清液用于下一步的亲和纯化；2)镍琼脂糖凝胶亲和层析法纯化将镍琼脂糖凝胶亲和层析柱连接至常压层析系统，先用平衡液冲洗平衡，细菌超声裂解上清液加镍琼脂糖凝胶凝胶室温结合，上柱后收集穿过峰。用结合缓冲液洗涤柱子，接着用分别含100mM、200mM、300mM、500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白；(5).纯化的NS5B蛋白用作抗原检测HCV抗体将纯化的HCV NS5B蛋白用50 mmol/L的碳酸盐pH9.6倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗丙肝病人阳性血清及正常人血清，NS5B-C21蛋白能与丙肝病人阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明NS5B-C21蛋白有较好抗原性和特异性；(6).磁性纳米复合颗粒修饰首先，液相载体可采用磁性纳米颗粒，将之加入乙醇/水的比例为199/1混合溶液中，为了更好地分散该颗粒，需将该溶液进一步超声；然后，将氨基硅烷化试剂滴加到以上混合溶液，并在室温下搅拌；最后，利用外加磁场将氨基硅烷化试剂修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗；在修饰完之后，将以上颗粒加入到含3％戊二醛的PB溶液中，并在37℃下搅拌3小时；该过程中通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团；反应结束后，利用外加磁场将颗粒从反应介质中分离出，并用PB溶液反复清洗产物；(7).丙型肝炎RNA依赖的RNA聚合酶活性测定方法的建立化学合成RNA模板，并在其5’端进行氨基修饰，合成两种RNA模板，一个为RdRp酶活性测定通用的poly(A)，长度为20个A，该序列为5′NH2---AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA---3′；另一个为HCV RNA的3′端的一段特异序列，该序列为5′NH2---CTTGGCGTAATCATGGTCAT---3′；将RNA模板修饰固定在核壳结构复合磁性纳米颗粒上并加入磁分离微孔反应板微孔内，再加入引物、纯化的RdRp酶，核糖核酸，生物素标记的11位尿苷三磷酸，构成RNA复制反应体系；通过掺入生物素标记单体，利用NS5B蛋白的RNA依赖的RNA聚合酶的活性，使另一条RNA链得到延伸，在外磁场下分离除去非特异性吸附片段，再与酶标记的亲和素结合，洗涤后，向微孔内加入底物显色剂显色；同时用磁铁吸附后将显色液转移到96孔酶联板内，用酶联仪测定各孔的A450吸光值；(8).从中药样品库和小分子化合物库内筛选新的NS5B蛋白酶活性抑制剂用96孔或384孔微孔反应板，每个微孔内加入结合有Poly(A)RNA模板的纳米磁性颗粒，每个微孔内都形成一个相同的NS5B蛋白酶活性测定体系，在向反应体系内加入NS5B蛋白酶之前，先向各孔分别加入不同的待筛选抑制剂，同时设立已知NS5B蛋白酶活性特异性抑制剂阳性对照孔，通过各孔的显色情况即可判定结果，同时用磁铁吸附后将显色液转移到96孔酶联板内，用酶联仪测定各孔的A450吸光值；对筛选到的阳性抑制剂，更换RNA模板，用HCV RNA的3’端一段特异RNA作为模板，再进行抑制试验。
2. 根据权利要求1所述的一种丙型肝炎NS5B酶活性测定的方法，其特征在于液相载 体材料包括磁性纳米颗粒、玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜或尼龙膜。
3. 根据权利要求1所述的一种丙型肝炎NS5B酶活性测定的方法，其特征在于液相 载体表面以具有双活性基团的长链有机化合物进行修饰，具有双活性基团的长链有机化合物试剂有戊二醛、三羟甲基氨基硅垸、N,N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅垸、多聚赖 氨酸，采用其中的一种或其中的两种的组合。
4. 根据权利要求1所述的一种丙型肝炎NS5B酶活性测定的方法，其特征在于待筛 选抑制剂为中药成分或大分子化合物或小分子化合物。
5. 权利要求1所述的一种丙型肝炎NS5B酶活性测定的方法在丙型肝炎以NS5B为靶 位的抗病毒药物的筛选中的应用，包括筛选大分子化合物库、小分子化合物库或中药库 中的抑制剂。
全文摘要
本发明丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶体外活性测定方法及应用涉及的是建立丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶(NS5B蛋白)活性体外测定的安全、实用的方法、应用涉及基因工程技术、纳米磁分离富集和RNA相关技术领域。本发明利用基因工程技术表达纯化可溶性的NS5B蛋白，并制备磁性纳米颗粒。将RNA模板一端固定在磁性纳米颗粒上，加入96孔反应板微孔内，再加入NS5B蛋白等构成RNA复制体系，在磁性纳米颗粒上复制的RNA双链，掺入标记了生物素。RNA复制后，用外磁场磁铁将磁性纳米颗粒吸附在微孔底部，反复洗涤吸附后与辣根过氧化物酶标记的亲和素结合，吸附洗涤后，加入辣根过氧化物酶的底物显色。利用建立的方法，可从中药库及化合物库内筛选新的NS5B蛋白酶活性抑制剂。
文档编号C12Q1/70GK101168781SQ200710133300
公开日2008年4月30日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者敏 吕, 菁 戚, 李越希, 杨华凤, 潘明洁, 王正茂 申请人:李越希