专利名称：Hsp65重组蛋白质的制备及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域，涉及一种重组蛋白质和所述重组蛋白质的药学用 途，更具体地说，是涉及一种治疗和预防黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤的重 组蛋白质。 技术背景卡介苗(BCG)是将牛型结核杆菌经长年数次连续在人工培养基上移植传代 而得到的活疫苗，Hsp65(Heat shock protein 65kD)是来自于卡介苗的热休克 蛋白，是卡介苗的主要抗原之一，国际基因库登录号是M17705。卡介苗作为一种生物反应调节剂，早在60年代即被用于恶性肿瘤的治疗。 BCG膀胱内灌注已被公认为治疗浅表性膀胱癌的首选疗法，可有效地消灭原位 癌、术后残癌，有预防复发作用。此外，其对于恶性黑色素瘤，直肠癌，乳腺 癌，肝癌等均有一定地治疗效果，其抗肿瘤作用主要会引起局部较强的免疫反 应。BCG成分复杂，除发挥抗肿瘤作用外，还可引起一系列毒副作用。同时， 随着BCG在治疗肿瘤方面的广泛应用，其所引起的副作用也开始为人们所关注， 不适当的BCG治疗可能产生对宿主有害的封闭性抗体，肿瘤细胞得以庇护免遭 破坏，这种免疫活性的抑制与BCG的菌株及肿瘤的种类有关，通过分析2602例 BCG膀胱内灌注的副作用与并发症，结果发现约90%患者有膀胱刺激症状，50 %的患者出现血尿，25%的患者有低热、感冒样症状，少数患者(<5%)出现 肉芽肿性前列腺炎、BCG性肺炎或肝炎、关节炎、脓毒血症、附睾炎、皮疹、 输尿管梗塞、膀胱挛縮、肾脓肿以及白细胞减少。BCG的毒副作用一定程度上 限制了它的临床应用。各种生物有机体，从大肠杆菌、酵母、果蝇到植物细胞、 哺乳动物细胞，在受到周围环境不利或有害因素影响时，会产生一系列为适应环境的改变而作出快速短暂的细胞代谢调节，此期间细胞内一些正常基因的表 达受到抑制，而一些特殊基因则被激活并表达，实质上是细胞对外界做出的一 种自身保护性反应。这一现象称为热休克反应，这组特殊基因就是热休克基因，所产生的蛋白就是热休克蛋白(HSPs)。热休克蛋白家族是一个高度保守的家族， 根据其分子量大小和氨基酸序列同源性的不同，可以分为HSP110、 HSP90、 HSP70、 HSP65、 HSP60等。人热休克蛋白60 (rHSP60)和结核分枝杆菌热 休克蛋白65 (mHsp65)具有高于55%的同源性。研究表明许多种类的肿瘤能够 过量表达、分泌热休克蛋白60(HSP60)。这与肿瘤的发生、发展以及转移特性有 一定关系，临床上，HSP60可做为早期肿瘤的诊断指标，因此，HSP60有可能成 为肿瘤免疫治疗的一个靶标，但内源性的HSP60免疫原性差。 发明内容本发明的目的是公开一种源于牛结核分枝杆菌(i^cWa"en7腿/;oWy7e) 热休克蛋白的重组蛋白质Hsp65的用途。本发明另一个目的是提供生产该重组蛋白质HSP65的方法。 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 一种源于牛结核分枝杆菌的 热休克蛋白Hsp65，其国际基因库登录号是M17705的重组蛋白质Hsp65在制备 用于抗肿瘤的药物中的用途和制备方法，制备方法包括有卡介苗基因组DNA的 提取步骤，Hsp65基因的获取步骤，构建重组质粒以及相应的重组基因工程菌步 骤，Hsp65重组蛋白获取步骤。本发明的目的还可以通过以下技术解决措施来进一步实现 一种源于牛结核 分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65在制备用于抗黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺 癌、肺癌的药物中的用途，其有益效果体现在重组蛋白质HSP65作为卡介苗(BCG)的重要抗原，对各种肿瘤疾病有着明显的治疗效果也是比较安全有效的抗肿瘤蛋白质。作为本发明的一个具体实施方式
，将生理盐水与纯化的该抗肿瘤蛋白 质经皮下给药分别注射两组肿瘤模型动物，观察发现注射该肿瘤蛋白质的实验 组动物较注射生理盐水的实验组动物而言，动物体内肿瘤内部及周围新生血管 减少，瘤体积和瘤重均有减少，肿瘤细胞的转移得到明显抑制。在医学上，该 疫苗可用于制备预防和治疗黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤 的药物。本发明关于重组蛋白质HSP65的制备方法，在Hsp65基因的获取步骤中， 聚合酶链式反应体系为100 pmol Hl， 100 pmol H2, 2 pg BCG基因组DNA， 2 pl Dntp (10 mM)， 5 jal 10xPFU buffer以及5单位的PFU DNA聚合酶，总体系为 50nl，聚合酶链式反应采用热启动，在94 "C变性10min后再加入PFUDNA聚 合酶，具体条件是94 。C 10 min; 94 。C 60 s， 62 。C 60 s， 72 。C 3 min，循环 数30; 72°C10min;构建重组质粒以及相应的重组基因工程菌步骤中，表达载 体质粒为pET-28a质粒，并采用碱裂法抽提，然后用双酶切法得到pET-28a质 粒，将pET-28a质粒与Hsp65的扩增序列在大肠杆菌中表达出可溶性融合蛋白， 获得重组基因工程菌A co"BL21/pET-28a-Hsp65;重组Hsp65蛋白获取步骤中， 将重组基因工程菌A co力'BL21/pET-28a-Hsp65经发酵-离心沉淀-离子交换柱 层析纯化得到重组蛋白质Hsp65，其中发酵的温度是36-38°C， P朋.8-7.2;沉 淀采用盐析法，用硫酸铵分级沉淀；阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化,获得Hsp65 重组蛋白，经SDS-PAGE电泳检测，达到电泳纯。作为本发明的一个具体实施 方式，该抗肿瘤蛋白质的基因序列来源于卡介苗，其国际基因库登录号是 M17705。通过PCR法克隆出卡介苗热休克蛋白65 (Hsp65)的全序列，并将其插 入高效的表达载体pET-28a中，转化大肠杆菌BL21，获得Hsp65的重组基因工 程菌，简称Aco"'BL21/pET-28a-Hsp65。经过简单的诱导表达及分离纯化，可以方便的获得大量该抗肿瘤蛋白质Hsp65。 其技术路线详述如下1. 卡介苗(BCG)基因组DNA的提取 操作步骤参考《精编分子生物学实验指南》2. Hsp65基因的获得根据已知的Hsp65的基因序列，借助计算机设计两条寡核苷酸引物，以BCG 的基因组DNA为模板，通过PCR法获得Hsp65的全序列，并在该序列的5，端引 入了Afcol识别位点，在3'端引入了历77flni识别位点。3. 构建重组质粒pET28a-Hsp65及相应的重组基因工程菌 将Hsp65序列经7Vfco1，历'y dn双酶切后插入同样经Wcol， A'77oni切割的pET-28a载体质粒中，组成重组质粒pET28a-Hsp65，重组质粒转化大肠杆菌 BL21，获得重组基因工程菌。4. 工程菌发酵及重组Hsp65蛋白的获得以LB为基础培养基，玉米浆培养基为发酵培养基，发酵参数如下温度 36-38°C， pH6.8-7.2。发酵后离心收集工程菌，反复冻融裂解菌体，离心获得 上清可溶性蛋白，硫酸铵分级沉淀，35%-40%硫酸铵沉淀中含有较纯目的融合 蛋白，沉淀重新溶解后经离子交换柱层析纯化，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， Hsp65蛋白的纯度达到电泳纯。本发明的有益效果为重组蛋白质HSP65作为卡介苗(BCG)的重要抗原，对 各种肿瘤疾病有着明显的治疗效果，毒副作用小，是比较安全有效的抗肿瘤蛋 白质。
图1 质粒pET28a-Hsp65结构2 SDS-PAGE电泳显示Hsp65的诱导表达。图3 SDS-PAGE电泳显示Hsp65的融合表达和纯化。图4 Hsp65对肿瘤生血管的抑制作用。图5 Hsp65对小鼠黑色素瘤的预防和治疗作用，各免疫组小鼠体内肿瘤的大小。图6 Hsp65抑制小鼠黑色素瘤细胞转移的作用。图7 Hsp65的广谱抗肿瘤作用。图例口H22;國EMT-6， B16-fl0图8 Hsp65-X的抗肿瘤作用。图例QRM-1;0 Lewis具体实施方式
以下通过附图及实施例对本发明做进一步说明一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65，其国际基因库登录号是 M17705的重组蛋白质Hsp65在制备用于抗肿瘤的药物中的用途和制备方法， 有关重组蛋白质Hsp65的制备方法包括了卡介苗基因组DNA的提取步骤， Hsp65基因的获取步骤，构建重组质粒以及相应的重组基因工程菌步骤和 Hsp65重组蛋白获取步骤。在Hsp65基因的获取步骤中，通过聚合酶链式反应获得Hsp65的扩增序列，引物采用等摩尔比混合，Pl、 P2为引物的核苷酸序列。Pl: 5' TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG TAC G 3'其中5'引入AboI酶切点位，P2: 5' TTC CGA AGC TTA GAA ATC CAT GCC ACC CAT G 3'其中3'引入HindIII酶切点位。在Hsp65基因的获取步骤中，聚合酶链式反应体系为100 pmol Hl, 100 pmol H2， 2 )ig BCG基因组DNA， 2 |il Dntp (10 mM), 5 |il 10xPFU buffer以及5单位的PFUDNA聚合酶，总体系为50pl，聚合酶链式反应采用热启 动，在94 'C变性10min后再加入PFUDNA聚合酶，具体条件是94 °C 10 min; 94 。C 60 s， 62 。C 60 s， 72 。C 3 min，循环数30; 72 。C 10 min 。在构建重组质粒以及相应的重组基因工程菌步骤中，选用pET-28a质 粒作为表达载体质粒，并采用碱裂法抽提，然后用双酶切法得到pET-28a 质粒，将pET-28a质粒与Hsp65的扩增序列在大肠杆菌中表达出可溶性融 合蛋白，获得重组基因工程菌￡ c^j' BL21/pET-28a-Hsp65。在重组Hsp65蛋白获取歩骤中，将重组基因工程菌 BL21/pET-28a-Hsp65经发酵-离心沉淀-离子交换柱层析纯化得到重组蛋白 质Hsp65，其中发酵的温度是36-38。C， PH6.8-7.2;沉淀采用盐析法，用硫 酸铵分级沉淀；阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，获得Hsp65重组蛋白， 经SDS-PAGE电泳检测，达到电泳纯。材料(1) 菌株和质粒宿主菌^sr力eric力is co力'BL21 (DE3)是基因工程常用工具菌种，在与基 因工程研究有关的实验室一般都有保存。 质粒pET28a购自Novagen公司。卡介苗由上海生物制品公司生产，该制品中含有牛结核分枝杆菌(2) 酶和试剂分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格 (Promega )公司产品，PCR回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。(3) 培养基LB培养基，配方见参考文献Sambrook J， Fristsh E F， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书 馆都有收藏。玉米浆培养基含有玉米浆25 g/L，牛肉浸膏15 g/L，味精IO g/L。 (4)Cellouse-DEAEDE-52为Whatman公司产品。 方法基因组DNA提取、质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、 连接和转化大肠杆菌在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见 Sambrook J， Fristsh E F， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989， pp.16-340。重组蛋白表达量的测定参见Sambrook J， Fristsh E F， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，方法进行。 实施例1 pET28a-Hsp65重组基因工程菌的构建l.卡介苗(BCG)基因组DNA的提取具体操作步骤参考《精编分子生物学实验指南》。(1) 取50 mg医用的BCG，用PBS (磷酸缓冲液)洗涤3次。(2) 加入250 ulTE (硫酯酶)(pH8.0)，重新悬浮，然后再加入150 ul10%SDS (十二烷基硫酸钠)，混匀，37。C在摇床上摇动lh (120rpm)。(3) 在-20 。C和室温下反复冻融2次。(4) 加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000rpm， 5 min。(5) 取上清，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，10000 rpm， 5 min。(6) 加入0.6倍异丙醇，轻轻混合，可看到细丝状的DNA絮状物。(7) 2000rpm， 2 min。(8) 用450u 1 70%乙醇洗涤。(9) 2000 rpm， 2 min。(10) 弃上清，沉淀物于超净工作台中稍稍吹干，然后溶于50"1 TE中。(11) 取5ul 0.8 % Agarose电泳检测，在上样孔上方有一亮带，表明已 经成功抽提到BCG基因组DNA。2. Hsp65基因的获得根据已知的Hsp65的基因序列，借助计算机设计两条寡核苷酸引物P1和P2， 由上海博亚生物技术有限公司合成。 两条引物核苷酸序列如下P1: 5 ，TTCGCCATGGCCAAGACAATTGCGTAC G 3,; P2: 5 ， TTCCGAAGCTTAGAAATCCATGCCACCCAT G 3'引物Pl引入了 Afcol酶切位点，引物P2均引入了 HindIII酶切位点。 以寡核苷酸片段P1和P2按一定比例(等摩尔量)混合作为模板，BCG基因 组DNA作为模板，进行PCR扩增获得Hsp65基因片断。PCR反应体系为lOOpmolHl, 100pmolH2，2 ngBCG基因组DNA， 2^1 Dntp (三磷酸脱氧核苷)(10 mM) ， 5 pl 10xPFU buffer以及5单位的PFU DNA 聚合酶，总体系为50pl。PCR采用热启动，在94 。C变性10 min后再加入PFUDNA 聚合酶，具体条件为94 °C 10 min; 94 °C 60 s， 62 °C 60 s， 72 °C 3 min，循 环数30; 72 °C 10min。3. 重组质粒pET28a-Hsp65的构建及相应的重组基因工程菌的构建 将扩增纯化后Hsp65的片段，用Tfeol、 HindIII进行双酶切，酶切后用PCR产物纯化试剂盒回收酶切产物。采用碱裂解法对pET28a进行抽提，抽提得到的质粒也用和HindIII 进行双酶切。酶切反应结束后用PCR产物纯化试剂盒回收酶切产物。将上述酶切回收后得到的Hsp65 DNA片段和pET28a质粒片段进行连接。连 接产物转化大肠杆菌^sc力erj'c力j'a coh' BL21 (DE3)，筛选含Hsp65融合蛋白基 因的重组质粒，称pET28a-Hsp65，见附图1。通过PCR验证，挑选正确的重组 质粒。将该质粒委托上海博亚生物技术有限公司进行核酸的序列分析，进一步验证 Hsp65融合蛋白基因及其读码框的正确性。 实施例2 Hsp65基因在大肠杆菌中的表达从pET28a-Hsp65平板上挑取单菌落接种含有50 ti g / ml卡那霉素 LB液体培养基，于37'C恒温振荡培养过夜，按1%比例转接种入新鲜的 玉米浆液体培养基(50ug / ml卡那霉素)中，37°C培养4小时后，加 入终浓度为0. 5mmo1 / L的a -乳糖诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶， 继续培养从而表达融合蛋白Hsp65。诱导后4小时取少量菌液，离心回收 菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了Hsp65蛋白的表达，目 的蛋白占细菌总蛋白的30%左右，结果见附图2，图中l.标准分子量蛋 白；2-5.载荷pET28a-Hsp65质粒的大肠杆菌BL21在乳糖诱导4、 6、 8、 IO小时后的全蛋白表达；6.载荷pET28a-Hsp65质粒的大肠杆菌BL21在 乳糖诱导前的全蛋白表达；7.载荷pET28a质粒的大肠杆菌BL21在乳糖 诱导前的全蛋白表达。 实施例3重组蛋白Hsp65的分离纯化诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(PH8. 0，50mM磷酸盐缓冲液，0.02 %溶菌酶)中，37°C搅拌30分钟，加入DNase (脱氧核糖核酸酶)将DNA消化至溶液不粘稠为止，离心回收上清，用硫 酸胺分级沉淀，目的蛋白主要在35%—40%硫酸胺沉淀中。将沉淀的融合蛋 白重新溶解在离子交换缓冲液(20mM Tris-HC1， pH8.0)中，透析脱盐，离心 后取上清进行阴离子交换柱层析，DEAE纤维素(二乙基氨乙基纤维素)DE-52 柱(2.6 x 40 cm )，用离子交换缓冲液(10mM Tris-HC1， pH8.0)/ NaCl梯 度洗脱，分段收集进行SDS -PAGE电泳检测，Hsp65在140-170mM NaCl的 洗脱峰中，用SDS-PAGE电泳检查制备样品的纯度，结果见附图3，图中1.载 荷pET28a-Hsp65质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；2.载荷 pET28a-Hsp65质粒的大肠杆菌BL21 (乳糖诱导后)的裂解后沉淀蛋白； 3. 0 20%硫酸铵沉淀的蛋白；4.标准分子量蛋白；5. 20 35%硫酸铵沉淀 的蛋白；6. 35 40%硫酸铵沉淀的蛋白；7.纯化的重组蛋白Hsp65。 实施例4抗肿瘤蛋白质的药效学研究 1. Hsp65对肿瘤生血管的抑制作用用无菌的生理盐水将Hsp65稀释至终浓度为lyg/ul。取4-5周龄 C57BL/6J雄性小鼠，设Hsp65皮下给药组和生理盐水阴性对照组，每组各8 只。另取4-5周龄BALB/c雌性小鼠，设Hsp65皮下给药组和生理盐水阴性 对照组，每组各8只。给药蛋白与弗氏佐剂等比例混匀后皮下注射小鼠，第 一次用弗氏完全佐剂，之后用弗氏不完全佐剂。给药时，皮下注射 100 u 1 (0. 5 ii g/u 1于生理盐水)的Hsp65蛋白。生理盐水组注射相同量的生 理盐水。以后每隔2周加强免疫一次，C57BL/6J小鼠共进行了五次加强免疫； BALB/c小鼠共进行了 3次加强免疫。最后一次免疫后第8天，于各组 C57BL/6J小鼠腹部皮内接种50ul (2"()S个/ml)B16-F10小鼠黑色素瘤细胞，于各组BALB/c小鼠腹部皮内接种50ul (2*108个/171|) EMT-6小鼠乳腺癌细胞， 观察记录肿瘤生长情况。于肿瘤细胞接种后第14天，将全部动物眼球取血后 处死，小心剥取小鼠带肿瘤皮肤，在显微镜下观察肿瘤内部及周围新生血管 的增生情况，见附图4，图中A.B16-F10生理盐水组；B. B16-F10 Hsp65组； C.EMT-6生理盐水组；D. EMT-6 Hsp65组。可以看出，较生理盐水阴性对照 组而言，Hsp65给药组小鼠的肿瘤周围及内部新生血管的增生得到明显抑 制。
2. Hsp65对小鼠黑色素瘤的预防和治疗作用 用无菌的生理盐水将Hsp65稀释至终浓度为lng/til。取4-5周龄 C57BL/6J雄性小鼠，设Hsp65皮下给药组和生理盐水阴性对照组，每组各10 只。给药蛋白与弗氏佐剂等比例混匀后皮下注射小鼠，第一次用弗氏完全佐剂， 之后用弗氏不完全佐剂。给药时，皮下注射100 " 1 (0. 5 u g/u 1于生理盐7J0的 Hsp65蛋白。生理盐水组注射相同量的生理盐水。以后每隔2周加强免疫一次， 共进行6次加强免疫。最后一次免疫后第8天，于各组小鼠右侧胸前皮下接种 0. lml(107个/mL)B16-F10小鼠黑色素瘤细胞，观察记录肿瘤生长情况。于肿瘤 细胞接种后第14天，将全部动物眼球取血后处死，剥取肿瘤组织，称重，比较 各组肿瘤的大小。每组肿瘤大小见附图5.A。可以看出，较生理盐水阴性对照组 而言，Hsp65皮下给药组的肿瘤的生长得到了明显抑制，抑瘤率为72.91%。
取8-10周龄C57BL/6J雄性小鼠，设Hsp65皮下给药组和生理盐水阴性对 照组，每组各10只，于各组小鼠右侧胸前皮下接种0. lml(107个/mL)B16-F10 小鼠黑色素瘤细胞。接种肿瘤细胞后第二天给药用无菌的生理盐水将Hsp65 稀释至终浓度为lyg/nl，取50ul与弗氏完全佐剂等体积混匀，皮下注射 lOOul，生理盐水组注射相同量的生理盐水。接种肿瘤细胞后第八天，第二次给药用无菌的生理盐水将H印65稀释至终浓度为lUg/iil，取50ul与弗氏不完 全佐剂等体积混匀，皮下注射100ul，生理盐水组注射相同量的生理盐水。肿瘤 细胞接种后第14天，将全部动物眼球取血后处死，剥取肿瘤组织，称重，比较 各组肿瘤的大小。每组肿瘤大小见附图5，图中A.生理盐水阴性对照组；B. Hsp65 皮下给药组；C. Hsp65_ AII6皮下给药组。根据B可以看出，较生理盐水阴性 对照组而言，Hsp65皮下给药组的肿瘤的生长得到了明显抑制，抑瘤率为 52. 03%。
4. Hsp65抑制小鼠黑色素瘤细胞转移的作用
用无菌的生理盐水将Hsp65稀释至终浓度为1 u g/u 1。取4-5周龄C57BL/6J 雄性小鼠，设Hsp65皮下给药组和生理盐水阴性对照组，每组各10只。给药蛋 白与弗氏佐剂等比例混匀后皮下注射小鼠，第一次用弗氏完全佐剂，之后用弗 氏不完全佐剂。给药时，皮下注射100ta(0.5ug/ul于生理盐水)的Hsp65蛋 白。生理盐水组注射相同量的生理盐水。以后每隔2周加强免疫一次，共进行6 次加强免疫。最后一次免疫后第8天，于各组小鼠右侧尾静脉注射 0. 2ml(L 25W05个/mL)B16-F10小鼠黑色素瘤细胞。于肿瘤细胞接种后第24天， 将全部动物眼球取血后处死，观察肿瘤细胞在肺部的转移情况，见附图6，图中 A.生理盐水阴性对照组；B.Hsp65皮下给药组。可以看出，较生理盐水阴性对照 组而言，Hsp65皮下给药组肿瘤细胞的转移得到了明显抑制。
5. Hsp65的广谱抗肿瘤作用
方法基本同Hsp65对小鼠黑色素瘤的预防作用。不同之处在于给药次数 减少，第一次免疫Hsp65蛋白后，均只加强免疫三次；肿瘤细胞及相应的宿主 不同，共有乳腺癌(EMT-6) (BALB/c)、肝癌(H22) (BALB/c)。 Hsp65蛋白对 各模型鼠的抗肿瘤效果可见附图7。
6. Hsp65-X的抗肿瘤作用
通过基因工程的手段在在Hsp65蛋白的C端引入一 段由18个氨基酸组成的 随机片断。考察该蛋白对前列腺癌(RM-1),肺癌(Lewis)的抑制作用。方法 基本同上文中Hsp65对EMT-6、 H22的预防作用。但只加强免疫两次，且宿主均 为C57BL/6J雄性小鼠。Hsp65-X对各模型鼠的抗肿瘤效果可见附图8。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效 变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1.一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65，其国际基因库登录号是M17705的重组蛋白质Hsp65在制备用于抗肿瘤的药物中的用途。
2. 根据权利要求1所述的一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65的 用途，其特征在于所述的蛋白质Hsp65在制备用于抗黑色素瘤、乳腺癌、 肝癌、前列腺癌、肺癌的药物中的用途。
3. 根据权利要求1所述的一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65的 制备方法，它包括有卡介苗基因组DNA的提取步骤，Hsp65基因的获取步骤， 构建重组质粒以及相应的重组基因工程菌步骤，Hsp65重组蛋白获取步骤， 其特征在于在所述的Hsp65基因的获取步骤中，是通过聚合酶链式反应获得Hsp65 的扩增序列，引物采用等摩尔比混合，引物的核苷酸序列是 Pl: 5， TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG TAC G 3，其中5'引入tVcoI醇切点位， P2: 5， TTC CGA AGC TTA GAA ATC CAT GCC ACC CAT G 3，其中3'引入HindIII酶切点位。
4. 根据权利要求3所述的一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65 的制备方法，其特征在于在Hsp65基因的获取步骤中，聚合酶链式反应 体系为100 pmol Hl, 100 pmol H2, 2 pg BCG基因组DNA， 2 pl Dntp (10 mM) , 5 pl 10xPFU buffer以及5单位的PFU DNA聚合酶，总体系为50jxl， 聚合酶链式反应采用热启动，在94 。C变性10 min后再加入PFUDNA聚合 酶，具体条件是94 。C 10 min; 94 。C 60 s， 62 。C 60 s， 72 。C 3 min，循 环数30; 72 °C 10 min 。
5.根据权利要求3所述的一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65的制备方法，其特征在于在构建重组质粒以及相应的重组基因工程菌步骤中，表达载体质粒为pET-28a质粒，并采用碱裂法抽提，然后用双酶切 法得到pET-28a质粒，将pET-28a质粒与Hsp65的扩增序列在大肠杆菌中 表达出可溶性融合蛋白，获得重组基因工程菌E coh'BL21/pET-28a-Hsp65。 6. 根据权利要求3所述的一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白Hsp65 的制备方法，其特征在于在重组Hsp65蛋白获取步骤中，将重组基因工 程菌￡ co7i BL21/pET-28a-Hsp65经发酵-离心沉淀-离子交换柱层析纯化 得到重组蛋白质Hsp65，其中发酵的温度是36-38°C, PH6.8-7.2;沉淀采 用盐析法，用硫酸铵分级沉淀；阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，获得Hsp65 重组蛋白，经SDS-PAGE电泳检测，达到电泳纯。
全文摘要
本发明提供一种具有抗肿瘤作用的、源于牛结核分枝杆菌(Mycobacteriiumbovine)热休克蛋白65(国际基因库登录号是M17705)的重组蛋白Hsp65。该蛋白质作用于机体后能显著抑制肿瘤内部及其周围新生血管的形成，有效抑制肿瘤细胞的转移，且具有预防和治疗肿瘤形成的作用。在医学领域中，该抗肿瘤蛋白质可用于预防和治疗黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤。重组蛋白Hsp65的制备方法是一个包括卡介苗基因组DNA的提取、Hsp65基因的获取、构建重组质粒以及相应的重组基因工程菌，最后得到Hsp65基因的过程。
文档编号C12N15/31GK101254301SQ200710133868
公开日2008年9月3日 申请日期2007年10月24日 优先权日2007年10月24日
发明者刘景晶, 洁 吴, 吴国君, 曹荣月, 明 林, 豪 范, 谢燕飞, 勇 鲁 申请人:中国药科大学