在转基因动物中产生仅有重链之抗体的制作方法

专利名称：：在转基因动物中产生仅有重链之抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于在转基因非人类哺乳动物中产生应答抗原攻击的、多样的亲和力成熟的功能性仅有重链之抗体(heavychain-onlyantibody,即仅有重链的抗体)谱(repertoire)的改进方法及其应用。本发明也涉及产生来自多个基因座的多样的类型特异性仅有重链之抗体镨。特别是，本发明涉及用于产生人抗原特异性的、高亲和力的任何类型或类型组合的仅有重链之抗体以及分离并表达功能完整的VH抗原结合区的方法。也描述了使用本发明的方法所产生的仅有重链之抗体。在以下说明书中，所有氨基酸残基的位置编号按照Kabat等，[1]设计的编号系统来给出。
背景技术：
：戎#抗体的结构为本领域所熟知。大多数天然抗体是包含两条重链和两条轻链的四聚体。重链通过位于每条重链约中间位置的铰链区之间的二硫键彼此连接。轻链在铰链区的N末端与每条重链连接。每条轻链一般通过接近铰链区的二硫键与各自的重链连接。当抗体分子正确地折叠时，每条链折叠成通过更具线性的多肽序列连接的许多不同的球形结构域。例如，轻链折叠成可变区(vo和恒定区(Cl)。重链具有单个可变区VH、第一恒定功能区(Ch1)、铰链区和2或3个另外的恒定功能区。重链恒定功能区与铰链区一起形成众所周知的抗体重链的所谓恒定区(constantregion)。重链可变区(Vh)与轻链可变区(VO的相互作用导致形成抗原'结合区(Fv)。重链与轻链的相互作用通过重链的CH1区与轻链的Ck或CX区来促进。一般来说，Vh和VL两者对于抗原结合是必需的，尽管业已表明重链二聚体和氨基末端片段在没有轻链的情况下保留活性[2]。在重链(VH)和轻链(Vt)两者的可变区内，某些短多肽区段表现出异常的变异性。这些区段称为超变区或互补性决定区(CDR)。间插区段称为构架区(FR)。在每个Vh和VL区中，有三个CDR(CDR1-CDR3)。在哺乳动物中，有5种类型的抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，在人中存在4种IgG亚型和2种IgA亚型。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>抗体类别在它们的生理功能方面不同。例如，IgG在成熟的免疫应答中起主要作用。IgM参与补体固定和凝集作用。IgA是分泌物(眼泪、唾液、初乳、粘液)中抗体的主要类型，因此在局部免疫中起作用。天然抗体的效应子功能(effectorfimction)由重链的恒定区来提供。IgA可以在含有粘液的部位中(例如在消化道、呼吸道或泌尿生殖道中)发现，并防止由病原体引起的粘膜建群。IgD主要作为B细胞上的抗原受体起作用。IgE与变应原结合并触发肥大细胞释放组胺(变态反应的根本机理)，而且也提供对抗蠕虫的保护作用。1gG(以其四聚体形式)提供大多数的抗侵袭性病原体的基于抗体的免疫。IgM在B细胞的表面表达，也以具有非常强亲和力的分泌形式表达，以在B细胞介导的免疫的早期(即在有足够的IgG清除病原体之前)清除病原体。正常的人B细胞在14号染色体上含有单个重链基因座，由此基因座通过重排产生编码重链的基因。在小鼠中，重链基因座位于12号染色体。正常重链基因座包含数目众多的V基因片段、许多D基因片段和许多J基因片段。Vh区的大部分由V基因片段编码，但每个VH区的C末端由D基因片段和J基因片段编码。在B细胞中VDJ重排，接着亲和力成熟，这为每个VH区提供了其抗原结合特异性。正常H2L2四聚体的序列分析表明，多样性主要由VDJ.重排与体细胞超变联合引起[3]。在人类基因组中存在超过50个人V基因片段，而其中仅39个是功能性的。现在可以从应答抗原攻击的转基因小鼠中获得全人抗体(H2L2)。此转基因小鼠包含单个人重链基因座和分开的轻链基因座。相应的小鼠重链和轻链基因座缺失或被阻抑，致使仅有人抗体而无鼠抗体产生([4-10])。随着新分子生物学技术出现，可以在人类B细胞增生性疾病(重链病)和鼠类模型系统中鉴定出仅有重链之抗体存在(缺乏轻链)。在分子水平上对重链病的分析表明基因組水平的突变和缺失可能引起重链CH1结构域的不当表达，从而导致缺乏与轻链结合能力的仅有重链之抗体的表达[ll,12]。业已表明，由于自然基因突变，骆驼科动物(camelid)产生功能性的IgG2和IgG3仅有重链的二聚体，其由于缺乏介导与轻链结合的CH1区而不能与轻链结合[13]。骆驼科动物仅有重链之抗体的特征是骆驼科动物VH区的特殊亚組，其提供了相对于人VH区和正常的骆驼科动物VH区而言提高了的可溶性。在此特殊亚组中的所述骆驼科动物VH区通常称为VHH区。也已经表明，诸如罝鱼的物种产生可能与哺乳动物T细胞受体或抗体轻链有关的仅重链样(heavychain-only-like)结合蛋白家族[14]。为产生骆駝科动物仅有重链之抗体，骆駝科动物胚系中的重链基因座包含编码某些或全部可能的重链恒定区的基因片段。在成熟期间，经重排的VHHDJ结合区被剪接到编码铰链区的基因片段的5，末端，以提供编码因缺乏CH1区而不能与轻链结合的重链的重排基因。骆驼科动物VHH区在第37、44、45和47位上含有许多特征性氨基酸[49]。据认为，这些保守氨基酸对于赋予仅有重链之抗体可溶性是重要的。仅某些骆驼科动物VH区是可溶性特征增强的Vhh区。它们只限于VH亚家族(subfamily),因此仅能对范围有限的抗原产生生产性应答。仅重链单抗可以通过标准克隆技术从骆驼科动物脾的B细胞中回收，或者通过噬菌体展示技术或其他展示技术从B细胞mRNA中获得[18]。获自骆驼科动物的仅有重链之抗体具有高亲和力。仅有重链之抗体的编码mRNA的序列分析表明，多样性主要由VmDJ重排与体细胞高度突变联合引起[49],在产生正常四聚体抗体时也观察到这一点。天然骆驼科动物VH区和天然人VH区的重要的共同特征是每个区作为单体结合，最佳的可溶性和结合亲和力并不依赖于与VL区二聚化。最近已经开发出用于在转基因非人类哺乳动物中产生仅有重链之抗体的方法(参见WO02/085945和WO02/085944)。通过抗原攻击，可以从转基因非人类哺乳动物(优选小鼠)中产生可能将是任何类型的(IgM、IgG、IgD、IgA或IgE)及获自任何哺乳动物的功能性^又有重链之抗体。这些初步研究依靠使用两种美洲驼(llama)V基因片)殳，并且受到抗体应答谱有限的限制。Janssens等[15]开发了用于在转基因小鼠中衍生仅有重链之抗体的方法。这些仅有重链之抗体因为B细胞中的抗体成熟而具有高度结合亲和力，可以通过抗原攻击来衍生并用已建立的杂交瘤技术来选择，而且可以在没有轻链的情况下作为任何类型的抗体(例如IgG、IgA、IgM)或作为单独的VH结合区产生。这些仅有重链之抗体由胚系(即非重排的)构型(germlineconfiguration)中的抗体重链基因座衍生，含有与所有人D和J基因片段以及编码所有人恒定区的基因片段偶联的两种美洲駝VHH(3型)基因片段。这些编码每个恒定区的基因片段缺失CH1区，以防止与轻链结合。此外，所述基因座在3，末端含有抗体LCR,以保证在B谱系细胞中高水平地表达。此基因座通过受精卵的显微注射导入到小鼠中。产生基于抗体的制品通过基因工程产生基于抗体的制品(尤其是产生基于人抗体或人源化抗体的制品)已经导致新型药物、新型诊断剂和新型试剂的产生，以及带来新型产业、就业和创造财富的机会(参见www.drugresearcher.com,www.leaddiscovery.co.uk)。基于4兀体的制品通常获自天然四聚体抗体。有许多与基于抗体的制品生产相关的专利和申请。这些专利和申请涉及相关的获得途径(例如从转基因小鼠获得)、生产途径和产品特异性物质。这些基于抗体的制品从完整的四聚体抗体到抗体区段再到单链Fv(scFv)分子变化多样。在21世纪推出的新药当中，基于抗体的制品将占有高比例。单并且其在治疗癌症方面取得了令人难忘的进展。基于抗体的制品也-故开发用于治疗心血管疾病和传染病。大多数已推出市场的基于抗体的制品可识别并结合在目标配体(例如TNFcc)上的单一、明确的表位。最近，高亲和性VH区已经从展示文库中的随机化人VH区中筛选出来，或者从经抗原攻击的骆驼科动物自然产生的仅有重链之抗体中获得，或者从制备自骆驼科动物的VH区文库中获得。这些高亲和性VH区已被掺入到基于抗体的制品中。这些VH区(也称为Vm区)表现出与典型的Vh区不同的許多差別，尤其是确保在没有轻链的情况下可溶性和稳定性增强的许多突变。在这些变化中，最为突出的就是在第45位存在带电荷的氨基酸[16]。许多研究小组已经致力于由天然四聚体抗体衍生的仅有重链之抗体。Jaton等[2及当中引用的其他参考文献]描述了从经亲和纯化、已表征充分的兔抗体中分离出减少了的重链组分，随后使各个重链复性。此复性重链的免疫学特征表明，无轻链的单独重链同型二聚体能够与抗原结合。LaterWard等[18]明确地证明当克隆的鼠VH区作为可溶性蛋白单体在大肠杆菌表达体系中表达时，其保留以高亲和力与抗原结合的能力。Ward等[18]描述了Vh区的分禹和表;[正；并且陈述了与典型单克隆抗体的生产比较此方法的潜在商业优势(参见最后一段)。他们也认识到，从与轻链正常结合的重链中分离出来的VH区缺乏天然四聚体抗体的可溶性。因此，Ward等[18]使用了术语"粘性的，，来形容这些分子，并且提出此"粘性"可以通过设计可溶性更强的VH区来解决。使用随机化法和借助噬菌体展示的位点定向法的组合，VH溶解性的提高随后已得以实现。例如，Davies和Riechmann[17]和其他人(参见WO92/01047)加入了来自骆驼科动物仅有重链之抗体的VH区的一些特征，并结合噬菌体展示，以提高可溶性而同时维持结合特异性。关于获自噬菌体文库的分离的人VH区的独立研究证明了VH区的抗原特异性结合，但这些VH区被证实可溶性低。此外，有人提出，对展示在噬菌体阵列上的具有特异性结合特征的人VH区的选择，可以形成工程抗体的构造单元[18]。人vh区可以经过工程改造以提高可溶性特征[19，20],或可溶性可能通过体内的自然选择来获得[21]。然而，当Vh結合域已从噬菌体文库中获得时，无论应用何种亲和力提高策略(包括例如亲和力热点随机化)，其对于抗原所固有的亲和力仍在微摩尔浓度至納摩尔浓度之间的范围[22]。用噬菌体展示技术或可选择的展示技术所产生的人VH区或骆驼科动物VH区由于体细胞突变和由D和J基因片段在正常抗体结合位点的CDR3区的重组所提供的额外的多样性，缺乏改良特征的优点。一些骆驼科动物VH(v冊)区在表现出相对于人Vh而言有益于可溶性的同时，可能在人体内证实有抗原性；此外，它们也有骆驼科动物VH必须通过免疫骆驼科动物或通过噬菌体展示技术来产生的缺点。噬菌体来源的人VH区需经艰辛才得以使用，因为它们需要多轮的淘选及随后的诱变以实现高亲和力结合特征。骆驼科动物VHH区当从噬菌体展示文库或类似展示文库中分离时需要同样烦瑣的程序，或者需要免疫大型动物(也产生经典抗体的美洲驼或骆驼)，而这些动物不是按照传统杂交瘤技术所能处理的。此外，骆驼科动物结合域可能证实有抗原性，因此需要人源化。经过抗原攻击，在转基因非人类哺乳动物中产生仅有重链之抗体(参见WO02/085945和WO02/085944)克服了许多这些问题。然而，在本领域中仍有需要使仅有重链之抗体的多样性和体内B细胞应答最大化，尤其是需要产生功能性的经典特异性人仅有重链之抗体谱和保留了最大抗原结合潜能的功能性VH仅有重链的结合域(VHheavychain-onlybindingdomain),以用于各种临床应用、工业应用和研究应用。本发明本发明人已经意想不到地克服了现有技术的限制，并且表明有重链之抗体的仅重链基因座的数量，可以大大增加抗体应答语(repertoire)。本发明基于以下发现当转基因非人类哺乳动物具有多个仅重链基因座时，这些基因座受到等位基因排斥。因此，仅有一个基因座被随机选出并成功重组，导致产生仅有重链之抗体。因此，可以将多个VH重链基因座用于同一个转基因非人类哺乳动物中，以使抗体谱和可获自哺乳动物的多样性最大化。当受到抗原攻击时，所述转基因非人类哺乳动物"选择"包含最适合应答特定抗原攻击的V基因片段的基因座，从而排斥余下的基因座。用本发明方法产生的仅有重链之抗体表现出高结合亲和力，这是因为所述转基因非人类哺乳动物能够从在通常没有扩大的CDR3环存在下可以发生V、D和J基因片段重排和体细胞突变的一系列基因座中进行"选择"。观察到基本上正常的B细胞成熟，并且在分离的血浆中存在高水平的仅有重链之抗体(前体条件是CH1区已经从重组基因座中存在的所有抗体类型中清除)。B细胞成熟和经装配的二聚体(例如IgG)或多聚体(例如IgM)分泌并不依赖于轻链基因的存在与表达。因此，本发明的第一个方面，提供了用于在转基因非人类哺乳动物中产生VH仅有重链之抗体的方法，所述方法包括以下步骤在所述哺乳动物中提供超过一个异源VH重链基因座，以及从所述基因座中的至少一个表达仅有重链之抗体，其中每个VH重链基因座包含一个或更多个V基因片段、一个或更多个D基因片段、一个或更多个J基因片段、和在表达时不包括CH1区的编码重链恒定区的基因片段。优选每个VH重链基因座包含一个或多个V基因片段，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50或60个V基因片段，所述V基因片段可以获自任何脊推动物物种。在一个实施方案中，每个基因座可以包含仅一个V基因片段。在此实施方案的一个可选方案中，每个V基因片段与所有其他V基因片段不同。在第二个可选方案中，每个V基因与其他所有v基因片段相同。在此第二个可选方案中，每个基因座中的其余基因片段可以与所有其他基因座的余下基因片段相同或不同。因此，可以想象，所述非人类哺乳动物动物可以含有多个拷贝的单一VH重链基因座。其优点是，优化将发生的B细胞中生产性重排的机会，从而允许产生有用的仅有重链之抗体。如果所述非人类哺乳动物含有许多不同的VH重链基因座，这将进一步优化获得具有所需特异性的仅有重链之抗体的机会。在另一个实施方案中，每个基因座包含多个V基因片段。在此实施方案中，在任何一个基因座中的所述V基因片段可以都获自同一物种的生物体，例如所有V基因片段可以来源于人。可供选择的是，任一个基因座的某些V基因片段来自人，而其它则来自骆驼科动物或来自鲨鱼。优选v基因片段来源于人。术语"V基因片段，，包括来源于脊推动物(包括骆驼科动物和人)的任何天然存在的V基因片段。当核酸表达时，所述v基因片段必须能够与D基因片段、J基因片段以及编码重链恒定区(效应区)的基因片段(其可以包含除CH1外显子以外的若干外显子)重组产生VH仅有重链之抗体(VHheavychain-onlyantibody)。V基因片段在其范围内也包括编码同系物、衍生物或者和蛋白片段的任何基因序列，所述基因序列能够与D基因片段、J基因片段及编码重链恒定区的基因片段(包含一个或更多个外显子，但不包含CH1外显子)重组产生本文中所定义的仅有重链之抗体。V基因片段可以例如来源于T细胞受体基因座或免疫球蛋白轻链基因座。优选本发明的多个重链因基座包含在所述多个基因座中分布的所述39个功能性人V基因片段及其经工程改造溶解性提高的变体中的任何数目的片段和变体或其任何组合。这些基因片段可以位于任何数目的基因座上，例如包含8个V基因片段的4个基因座加包含7个V基因片段的1个基因座；包含4个V基因片段的7个基因座加包含3个V基因片段的1个基因座；或者各自包含一个V基因片段的39个基因座。人V基因分成7个家族，即Vh1至Vh7,在每个家族中的单个基因被编号。每种基因的使用频率取决于特定免疫应答的各种不同要求。例如，当对细菌性抗原进行应答时，与VH5家族的基因相比，可以优先使用VH3家族的基因。因此，在本发明的进一步优选V基因片段组被分组成转基因非人类哺乳动物的不同品系。V基因片段可以根据家族来分组，或者根据各自功能来分组。例如，如果Vh3家族的V基因表现出可用于产生对抗细菌性抗原的免疫应答，那么这些V基因可以用于产生转基因非人类哺乳动物，所述哺乳动物尤其可用于产生对抗细菌性抗原的仅有重链之抗体。可供选择的是，如果表明来自VH3家族和VH5家族的若干单个基因可用于产生对抗细菌性抗原的免疫应答，那么这些基因可以集合在一起，用于产生转基因非人类哺乳动物，所述哺乳动物尤其可用于产生对抗细菌性抗原的仅有重链之抗体。在本发明的上下文中，术语"异源的"指的是文中所述的核苷酸序列或基因座，其对于它所在动物来说并非是内源的。在本发明的上下中，"VH重链基因座"指的是与编码重链效应区(每个效应区都缺乏CH1区)的一个或更多个基因片段可操作地连接(operationallylink)、包含以下基因片段的最小微基因座(micro-locus):一个或更多个V基因片段、一个或更多个D基因片段以及一个或更多个J基因片段。优选抗体谱变异性的主要来源是经过V、D和J基因片段的选择及经过V-D和D-J的接合而形成的CDR3区。本发明的优点在于通过在同一转基因非人类哺乳动物中使用多个VH重链基因座，可以使在重排的Vh基因序列中所荻得的抗体谱和抗体多样性最大化。Janssens等，2006[15]已经表明，上文所述的转基因基因座在重排和等位基因排斥方面表现得如正常免疫球蛋白基因座一样。这揭示了以下可能性在同一动物中(不同染色体上)有多个基因座，通过利用等位基因排斥使可能的Vh重組的数目最大化。每个转基因基因座可能含有1个至超过40个VH区。等位基因排斥过程随机地选择所述基因座之一来开始重组，如果第一个重组是非生产性的，则接着轮到下一个基因座，以此类推，直到生产性重组从所述基因座之一中产生，这一过程保证了实际上在重组基因座中存在的所有VH区将成为总体重组过程的一部分。Janssens等,[15]也已经意外地发现，当同一个转基因非人类动物中的多个重链基因座串联位于同一染色体上时，生产性重排和抗体表达可以由多个重链基因座发生。在这种情况下，随后的杂交瘤克隆是多克隆的。技术人员将会认识到这是增加抗体多样性的另一机制。因此，本发明的另一方面，提供了本文所述的方法，其中转基因非人类哺乳动物中的至少两个或更多个VH重链基因座在同一染色体中以串联的形式存在，于是生产性重排和抗体表达可以由两个或更多个基因座同时发生。优选许多重链基因座将首先分别地被引入到转基因非人类哺乳动物中，从而产生具有单个重链基因座的转基因非人类哺乳动物。然后使这些杂交，产生具有多个重链基因座的后代，以使Vh区的数目最大化，从而导致多样性最大化。也可以通过新一轮的转基因来加入基因座。可以将新的基因座注射到获自已经含有一个或更多个异源VH重链基因座的非人类哺乳动物的卵中。新的异源VH重链基因座的稳定整合将导致可利用的VH区增多并因此导致多样性增多。用另外的异源VH重链基因座稳定转染来源于包含异源VH重链基因座的非人类转基因哺乳动物的ES细胞，提供了增加非人类哺乳动物(例如小鼠)中的多样性的又一途径，其中ES细胞技术可通过胚胎融合和胚泡注射而用于基因转移。优选每个不同的重链基因座在转基因非人类哺乳动物的基因组中以单拷贝存在。此外，多个V、D和J基因片段的使用提供了抗体谱和可获得的多样性进一步增加。当使用最小基因座(微基因座)时，达到了随后的体细胞突变，而无需Vt和Lc(轻链)抗体基因座。在本发明的上下文中，术语"D基因片段"和"J基因片段，，包括天然存在的D和J基因片段序列。优选所述D和J基因片段来源于与来源于V基因片段所来自的相同脊推动物。例如，如果V基因片段来源于人，那么当需要增溶或工程改造时，D和J基因片段也优选来源于人。可供选择的是，V基因片段可以来源于例如骆驼科动物，而D和J基因片段则来自人，或反之亦然。术语D基因片段和J基因片段在其范围内也包括衍生物、同源物及其片段，只要产生的区段可以与本文所述的重链抗体基因座的余下组分重组产生本文所述的仅有重链之抗体。D和J基因片段可以来源于天然存在的来源，或者它们可以用本领域技术人员熟悉的方法和本文所述的方法来合成。所述V、D和J基因片段能够重组并优选经历体细胞突变。所述D和J基因片段优选来源于单个脊堆动物物种。这可以是4壬^f可脊一,动物物种，^f旦优选人。优选每个vh重链基因座包含1-40(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30或40)个或更多个D基因片段。所述D基因片段可以来源于任何脊推动物物种，但最优选所述D基因片段是人D基因片段(通常是25个功能性D基因片段)。优选每个vh重链基因座包含1-20(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20)个或更多个J基因片段。所述J基因片段可以来源于任何脊推动物物种，但最优选所述J基因片段是人J基因片段(通常是6(六)个功能性J基因片段)。每个vh重链基因座可以含有相同的D和J基因片段。可供选择的是，每个vh重链基因座可以含有不同组合的D和J基因片段。例如，如果每个VH重链基因座仅含有一个V基因片段，并且该区段在每个基因座中都相同，那么在每个基因座中使用不同组合的D和J基因片段以进一步使获得生产性重排的可能性最大化则是有利的。然而，如果每个VH重链基因座含有一个或更多个V基因片段，那么在每个基因座中使用相同组合的D和J基因片段是有利的。优选所述VH重链基因座包含一个或更多个V基因片段、25个功能性人D基因片段以及6个人J基因片段。编码重链恒定区的每个基因片段可以包含C3、Cym、C卜Cs或CaN2类型的一个或更多个重链恒定区外显子，前提条件是所述重链恒定区基因片段不表达CH1区。重链恒定区基因片段根据优选的类型或所需抗体类型的混合物来选择。任选的是，所述异源重链基因座缺乏Cp和缺乏C5。因此，每个vh重链基因座可以包含编码在体内"I是供效应功能(例如IgG、IgM、IgA、IgE或IgD或它们的同种型)的至少一个重链恒定区的基因片段，其中每个恒定区不包括CH1区。每个基因座可以含有仅一个编码一个特定恒定区的基因片段。如果需要某种效应功能，这将是有利的。可供选择的是，每个基因座可以包含超过一个的基因片段，每个基因片段编码不同的恒定区。如果不需要特定的效应功能，这将是有利的，因为这将允许多种类型的仅有重链之抗体产生。每个基因座可以含有相同的恒定区编码基因片段，或每个基因座可以具有不同的或不同组合的恒定区编码基因片段。在操作上，重链恒定区由天然存在的或工程改造的基因片段来编码，所述基因片段能够在B细胞中与V基因片段、D基因片段和J基因片段重组。在每种仅有重链之抗体中，表达出无CH1区的恒定区，因此可以产生仅有重链之抗体。可以使CH1外显子缺失，从而使上文所述的仅VH重链抗体的恒定区不含功能性的CH1区。当对多价结合复合物进行工程改造时，根据所需的功能性包括类型特异性的重链恒定区则提供了体内效应功能的治疗益处。各个效应区的工程改造也可以导致功能性的添加或缺失[23]。因此，包括IgA恒定区功能性将提供提升的对抗病原体的粘膜功能[24]，同时IgGl恒定区功能性的存在则提供增强的体内血清稳定性。重链CH2和CH3恒定区结构域的存在为如天然抗体中见到的稳定的二聚体形成提供了基础，并且为翻译后糖基化提供识别位点。CH2和CH3的存在也使得在双特异性和多价复合物用作试剂或诊断剂时能够识别第二抗体。例如，已知IgM抗体在激活巨噬细胞和激活补体途径中起着重要的作用。由于IgM结合位点非常接近，它对于包括病毒在内的病原体具有高度亲和力。然而，也已知IgM难以在快速免疫测定技术中应用，而IgG则可以方^(更地应用在这些技术中。对于这些应用，选择优选的抗体(即IgG还是IgM)将有所帮助。缺乏CH1的全部或部分的异型重链q基因座的表达将任选地产生某种或全部IgG同型，取决于异源IgG基因座中存在的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同型。可供选择的是，所述重链可以包含Cs基因。所产生的IgE分子也可以用于治疗。可供选择的是，可以获得所选择的抗体混合物。例如，当所述重链恒定区包含Ca和C(i基因时，可以获得IgA和IgM。优选所述重链恒定区来源于人，尤其是当仅有重链之抗体用于人类治疗应用的时候。如果仅有重链之抗体将用于兽医用途，那么所述重链恒定区优选来源于将待施行兽医治疗于其上或于其中的目标生物体、脊推动物或哺乳动物。当表达时，每个重链恒定区缺少CH1区。优选CH1外显子缺失。任选地，Cp和C5恒定区可以被突变、缺失或取代。例如，具有功能性CH1区的IgM的存在抑制B细胞成熟，因此限制在同一基因座中的仅重链IgG(缺CHl)的生产性表达。文中所定义的"重链恒定区外显子("CH外显子")"包括天然存在的脊推动物(但尤其是哺乳动物)的Qi外显子的序列。这在类型特异性的形式上会有所变化。例如，IgG和IgA天然地缺少CH4结构域。术语"CH外显子"在其范围内也包括衍生物、同源物和其片段，只要当CH外显子作为重链恒定区的组分时，它能够形成功能性的仅有重链之抗体。任选地，当存在CH4或其它功能性结构域时，可以在转基因内将它们工程改造或使它们缺失，前提是上述过程不会抑制细胞内分泌过程、B细胞成熟或所得抗体的结合活性。假如工程改造不会影响防止细胞表面装配的分泌途径和随后的B细胞成熟，那么可以对重链效应分子进行工程改造以除去功能性结构域，例如CH4结构域。可以将另外的特征工程改造到基因座中，例如以增强糖基化作用或添加功能。因此，根据所需的抗体类型，设计异源重链基因座，以产生优选的仅有重链之抗体的类型或混合物以及基本上正常的B细胞成熟。骆驼科动物V、D和J基因片段和骆驼科动物效应区的使用将产生具有骆驼科动物抗体所特有的特征的骆驼科动物抗体，例如扩大的CDR3环。人V、D和J基因片段的使用将产生缺少扩大的CDR3环的人仅有重链之抗体。本发明的上下文中，"Vh区"指的是当与上文所述的D基因片段和J基因片段重组时V基因片段的表达产物。优选所述VH区因为VDJ重组和体细胞突变而导致与抗原结合的能力提高。这不依赖于是否存在骆驼科动物所特有的扩大的CDR3环。所述Vw区能够作为单体与抗原结合。通过除去CHl外显子，当VH区作为可溶性仅有重链之抗体复合物的一部分表达时，其与Vl区结合的任何可能性已被排除(参见[25])。单独的VH区也可以与各种蛋白结构域(例如毒素、酶和显^f象剂)一起经过工程改造，以产生用于定向治疗和诊断用途的融合蛋白。所述VH区的编码基因可以获自天然存在的来源，或者可以使用本领域技术人熟悉的方法来合成它们。通过选择或工程改造编码具有所需特性的序列的V、D和/或J基因片段，可以改变或提高VH区的性质。如上文所指出的，39个功能性人VH区中的某些可能不适于产生仅有重链之抗体。在现有技术中，已经开展了若干研究以试图改进各种抗体的特性[2629]。有关具体的VH区特征，Dolk等，[30]使用噬菌体展示技术来产生在去头屑洗发水相关的严苛条件下表现出稳定性增强的仅有重链之抗体。所述转基因非人类哺乳动物优选是啮齿动物，例如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。尤其优选小鼠。可选的哺乳动物例如山羊、绵羊、猫、狗或其它动物也可以使用。优选所述哺乳动物是小鼠。优选单独使用已建立的卵母细胞注射技术来产生转基因非人类哺乳动物。ES细胞技术或克隆如果已经建立，则也可以使用。有利的是，当按照本发明的方法表达仅有重链之抗体时，所述哺乳动物的内源抗体重链和任选的轻链的基因座已缺失或被沉默。在本发明的上述方面中描述的产生仅有重链之抗体的方法在产生用于人的治疗用途的抗体方面可能尤其有用，因为在通常情况导致激发针对所施用抗体的免疫应答。按照本发明所产生的抗体优于现有技术的抗体，因为它们基本上是单一的或已知类型的，并且优选是人源的。因为在体内的VDJ重排与亲和力成熟相结合，所以抗体具有高亲和力。因此，本发明又一方面提供了包含上文所述的超过一个的异源VH重链基因座的转基因非人类哺乳动物。优选所述转基因非人类哺乳动物可以经过工程改造而致使产生含轻链抗体的能力下降。并且用于例如制备用于产生文中所述的仅有重链之抗体的杂交瘤。此外或可供选择的是，使用本领域技术人员所熟悉的重組DNA技术，可以将核酸序列从这些转基因非人类哺乳动物中分离出来并且用于产生仅重链VH区抗体或其双特异性/双功能复合物。此外或可供选择的是，抗原特异性仅有重链之抗体可以通过免疫本文所述的转基因非人类动物来产生。因此，本发明也提供了一种方法，所述方法通过用抗原免疫上文所述的转基因非人类动物来产生仅有重链之抗体。使用本领域技术人员已知的已完善制定的方法，可以分离、表征并生产抗体及其片段。这些抗体在PCT7GB2005/00292描述的方法中尤其有用。现在仅通过实施例在以下详细说明中描述本发明，所述说明指的是以下附图。附1:用于产生转基因小鼠的DNA片段的图示。美洲驼Vhh外显子中的两个与人重链多样性(D)基因片段和连接(J)基因片段连接，然后连接Cji、CS、CY2和CY3人恒定区基因和人重链Ig3，LCR。对人Cy2和Cy3的修饰是使来自构建体MGA和GA的Cy2和Cy3中的外显子完全缺失、或也使来自构建体MAGA的Cji中的CH1外显子完全缺失。方向相同的两个LoxP位点(红色)的存在使得能够在Cre介导的重组时除去Cp和CS基因。Frt位点(绿色)的存在使得能够通过Flp介导的重排从多拷贝转基因排列中产生单拷贝转基因小鼠。图2:图A:以不同器官中B220/CD19阳性细胞占总细胞的百分比来表示的B淋巴细胞的流式细胞术分析表格。图B:BM中wt(野生型)、pMT、MGA/]uMT、MAGA^MT和GAMT小鼠的B细胞群的流式细胞术分析。根据前向与侧向散射和B220表面表达来对淋巴样细胞进行门控(gate)，并绘制出人IgM或IgG的图。数据以散点图来显示。对于MGApMT小鼠，对B220+部分(fmction)进行门控并分析细胞内的(ic)人Ign和yH链的表达情况，表达情况(红线)作为直方覆盖图(histogramoverlay)来展示，用来自|iMT小鼠的B220+细胞的本底染色(黑线)作为对照。显示了阳性细胞的百分比。图C:MAGA或GA转基因的表达拯救了前BCR和BCR的功能。来自pMT小鼠(祖B细胞(pro-Bcells))的总CD19+部分中的指示标记、来自野生型小鼠的CD19+表面IgM-部分(祖B细胞/前B细胞(pre-Bcells))和的CD19+表面IgM+部分(B细胞)中的指示标记、来自MA-GA|iMT小鼠(B细胞)的CD19+表面人IgM+部分中的指示标记、以及来自GApMT小鼠(B细胞)的CD19+表面人IgG+部分中的指示标记的表达概况。ic-Igk-月包内IgkL链。流式细月包术^:据以直方图来出示。出示的数据代表每个组别中已检验的3-8只动物。图D:^f吏用VHH1和VHH2特异性探针并结合人Cy2引物从BMcDNA获得的PCR产物的序列比对，显示出VDJ重排。序列来自GA。绿色表示序列同一性。图3:图A-E:5个拷贝的人GA基因座的DNAFISH。图A:来自携带5个完整拷贝(l-5)的GA基因座的GA系1转基因小鼠肺细胞的伸展的染色质丝，GA基因座侧翼为含有LCR(红色)的半个基因座与携带VHH至J区(绿色)的半个基因座。图B:来源于GA系1B细胞的杂交瘤(G20)的伸展的染色质丝FISH，其中1个拷贝已发生重排(白色箭头)。图C:含LCR探针(红色)的杂交瘤Tl的非伸展DNAFISH。图D:与C一样，在VHH与D之间含有探针(绿色)。图E为图C和图E的重叠。注意到T1具有4个重排体，这可根据与红色信号无损失相比损失4个绿色信号看出来。图F:GA转基因小鼠中保持等位基因排斥。鼠表面或胞内(ic)pH链和来自所示小鼠的总BMCD19+细胞部分上的转基因人IgG的流式细胞术分析。数据以散点图来表示，并且给出了所指象限内的细胞百分比。出示的数据代表每个组别中的已检验的4只小鼠。图4:wt、pMT、GA、MAGA和MGA小鼠脾中的B细胞群分析。出示的数据代表每个组别中的已检验的4-8只小鼠。图A:上图相对于B220的对小鼠IgM、人IgG、人IgM染色的脾细胞FACS数据。下图脾中B细胞群的流式细胞术分析。基于前向与侧向散射和B220的表面表达对淋巴样细胞进行门控，所指示的Ig(上面部分)或CD21/CD23概况以散点的形式展示，并给出了在所示门控中的细胞百分比。低CD21低CD23:未成熟B细胞；CD21+CD23+:滤泡型B细胞(follicularBcell);高CD21低CD23:边缘区B细胞。图B:wt、pMT、GA/|iMT、MAGAMT和MGAMT小鼠脾的组织学。免疫组织化学分析；对于B细胞用抗B220(蓝色)来染色5pm冰冻切片，对于树突细胞用抗CDllc/N418(褐色)来染色5pm冰冻切片。箭头指示MGA脾中小簇B细胞的位置。图C:使用VHH1和VHH2特异性引物并结合人Cy2引物从淋巴集结cDNA获得的PCR产物的序列比对，显示转基因基因座在CDR1和CDR2区中经历超变。序列来自CH1缺失的转基因基因座。图D:上图脾细胞FACS数据，用抗CD19和抗B220染色。左下图通过与FlpeR转基因系配种进行体内Flp重组的图示，以及得自5拷贝GA系1的单拷贝重组体的脾细胞FACS数据。右下图通过MGA系与CAGCre转基因系配种进行体内Cre重组的图示以及关于重组体脾细胞的支持性FACS扫描数据，显示出如在直接产生原始GA系中所见到的B细胞拯救。图5:DNA印迹，表明在GAMT(图A)以及MAGA/pMT(图B)转基因系中不存在k轻链重排。用HindIII消化来自wt小鼠和2只G厶转基因小鼠或4只MAGA转基因小鼠的肝DNA(L)和B细胞DNA(B)，并用"P放射性标记的jk探针和碳酸酐酶II(CAII)探针探测。用与4kb条带杂交的CAII探针作为加样对照。将肝DNA电泳以表明k胚系构型(2.8Kb条带)。根据2.8kb片段的亮度降低(与肝的相比剩余30%的信号)所示，仅wtB细胞表现出k基因座重排。图6:|iMT背景下的6个不同GA系(A、B)、4个不同MAGA系(C)和2个不同MGA系(E-G)的G蛋白(ProtG)或伴刀豆蛋白(concavalin)纯化的血清样品，在非还原(A)和还原(B-G)条件下电泳。转基因人IgG(图B、F)和IgM(图C、D)的大小与缺失CH1且不存在轻链的大小一致。小鼠k轻链大小正常(G)。用人血清作为阳性对照。图D:在还原条件下，在混合在人IgM对照中之后MAGA血清的Superose6大小分级。每个部分经在还原条件下凝胶电泳来分析。从Superose6柱收集的部分从左(高MW)至右(低MW)排列。对照是单独的人血清(左边第一道)和在混合在人IgM对照血清中之前的小鼠血清(MAGA血清泳道)，显示了大小标记。图7:图A:对破伤风类毒素、HSP70、rtTA和人TNRt特异性的单克隆抗体cDNA的序列。顶部的序列是胚系VHH2序列。在序列上面标明CDR1、2和3以及4史链区。不同的同种型和类型以右边的不同颜色来指示。所用的J区在右边表明。图B:使用不同仅有重链之抗体(杂交瘤、血清和sdAb)的蛋白质印迹的实例。左图分别以1/100和1/250稀释的抗rtTA血清和杂交瘤培养基。中图分别以1/200和1/100稀释的来自wt和GA小鼠的抗DKTP血清。右图针对含百日咳博德特氏菌(及i^Ww^^)抗原(DKTP)或不含此抗原(DTP,因为我们不能购买到纯化的百日咳博德特氏菌抗原)的疫苗的抗百日咳百日咳博德特氏菌sdAb。图C和D:用标记质粒另外转染的Tet-on细胞系之一的免疫染色，所述细胞系通过在细胞质中表达标记蛋白而对rtTA的存在产生应答5,。图C显示了表达rtTA的细胞核(绿色)。图D显示多西环素诱导的标记蛋白在细胞质中应答rtTA的表达(红色)，和利用DAPI对所述细胞进行的核染色(蓝色)。图E:抗rtTA抗体的BiaCore分析的实例。显示了亲和力。图8:图A:含骆驼科动物样剪接突变的Ig基因座的示意图。通过将G+1剪接位点更改成A+1而首先使2个人IgG恒定区(Oy2和CY3)突变，这样被认为会导致在记为Gy2-S和Gy3-S的^^驼科动物IgGHCAbss中的CH1外显子跳跃。该基因座含有两个美洲駝VHH区、所有的人D和JH区、人C)i、C5、Cy2、Cy3以及LCR(也可参见正文)。这些基因座被引入到iiMT转基因小鼠中，并用以分析人基因座的表达。图B:对来自GS小鼠的骨髓(BM)人IgGcDNA进行测序，其表明两个VHH与不同的人D和J区段重组并与Cy2恒定区一起转录。然而，除了被剪接掉的最后16bp之外CH1外显子仍然存在。尽管仍在研究进展之中，但据报道CH1外显子中的同样的隐蔽剪接位点在白血病患者中出现，因为内含子1的第4位中存在A-G转换[31]。MGS或GS系中无一能拯救)iMT小鼠中的B细胞发育(未出示)。虽然小鼠B细胞转录/翻译机制可以加工重排的单峰骆驼(dromedary)VHH^2a[34,90],但是我们的数据表明，除了G-A突变以外还有其他特征对于CH1外显子跳跃是重要的。图9:如实施例3和4中描述的将人VH区克隆到不同基因座上的图示。图10和11:含有多个Vh基因片段、整个D区、整个JH区、C丫2、Cy3和Cx区以及3，LCR的重链基因座的实例。图12:出示了核型图，其中一个基因座整合到1号染色体上，一个基因座在8号染色体上。实施例实施例1仅有重链之抗体基因座在小鼠中功能完整并对等位基因排斥敏感如前文所述的，Janssens等[15]已开发了用于在转基因小鼠中获得仅有重链之抗体的方法。对于本文所述的方法和实验的进一步细节，本领域技术人员应该参考Janssens等[15],该文献在此引作参考。1才法构建体使用标准的方法从羊驼(Z^maG/awa)的外周血细胞中制备基因组粘粒文库。选择了两个不同的胚系VHH，这基于它们的序列可读.框无终止密码子且在根据Lefranc编号[32]的第42、50和52位存在亲水性氨基酸密码子，以及在第49位中一个胚系VHH含有亲水性氨基酸而另一个胚系VHH不含有亲水性氨基酸。一个胚系VHH与IGHV1S1(登录号AF305944)相同，而另一个胚系VHH与IGHV1S3(登录号AF305946)具有94%的同一性。从人基因组Pac文库RPCI-11(BACPACRecourceCenter，USA)中选出两个克隆含有人重链D和J区、Cn和CS的克隆1065N8以及含有C基因的克隆1115N15。使用来自不同的人基因組文库(IncyteGenomics,CA,USA)的Bac克隆11771作为CY2基因和Ig重链LCR的来源[33]。使用标准的方法将Cy3和Cy2基因分别亚克隆到pFastBac(Invitrogen)中。通过同源重组使CH1外显子单点突变(G至A)[34]或完全缺失[35]。类似地，将frt和loxP位点引入到Cp转换区之前，将第二个loxP位点置于Oy2转换区之前，从而产生MGS或MGA。为了获得GS或GA构建体，将MGS或MGA载体(图l)转化到16294Cre大肠杆菌菌林44中，通过cre介导的重组产生GS或GA基因座，其中所述MGS或MGA载体含有两个美洲驼VHH基因、后随的人D和J重链区、Cp、C5、经修饰的人C丫2和Cy3基因以及LCR(图1)。通过同源重组使C^CH1区缺失，由MGA中获得MAGA。产生转基因小鼠、配种及基因分型从载体序列中纯化220Kb的MGS、MGA或MAGA片段、150Kb的GS或GA片段(图1),并以2ng/)ul浓度将它们注射到受精后的FVBXB16/jiMT-A卵的前核中。通过用5，和3'探针对尾DNA进行DNA印迹分析，检查转基因基因座的完整性和拷贝数。将转基因的pMT+Z-建立者作为pMTV-背景下的系进行配种。通过使用以下引物的PCR(94。C变性45秒，60。C退火30秒，72。C延伸1分40秒，30个循环)来进行基因分型Asp5，IgMfW:5，-GCGGGTACCGAATGGTGGCAGGGATGGCTC誦3，(SEQIDNO:l)，对于HLL-MD联合Asp3，IgG2rv:5，-CGCGGTACCCTGCGGTGTGGGACAGAGCTG-3'(SEQIDNO:2)或者对于MGS联合Asp3，IgMrv:5，-CGCGGTACCACGGCCACGGCCACGCTGCTCGATTC-3，(SEQIDNO:3);和对于|_iMT基因型MIGMEMBINTRON1:fw:5，-CCAGTCAATACTACTCGCTAAGATTC-3，(SEQIDNO:4)联合MIGMEMBEX0N1rv:5'-CAGTGGTCCACAGTTTCTCAAAGC画3'(SEQIDNO:5)。RT陽PCR4吏用UltraspecRNA分离系统(BiotecxLaboratories,Houston)来分离总RNA。使用反转录酶(SuperscriptII,Lifetechnology)和oligo(dT)引物来合成cDNA。使用以下引物进行PCR:LVHHfV:5，-AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG-3，(SEQIDNO:6)联合HINGEIgG2rv:5'CACTCGACACAACATTTGCGCTC-3，(SEQIDNO:7)或hlgMCH2rv:CACTTTGGGAGGCAGCTCAGC-3，(SEQIDNO:8)。扩增以94。C变性45秒、60。C退火30秒和72。C延伸1分，30个循环来进行。将PCR产物克隆到pGEMT简易载体(pGEMTeasyvector,Promega)中并使用T7或SP6引物进行测序。流式细胞术分析如先前所描述的45，从淋巴器官中制备悬浮于PBS的单一细胞悬液。在4'C下将约lxl(^的细胞与抗体在96孔板内的PBS/0.5。/。牛血清白蛋白(BSA)中孵育30分钟。将细胞在PBS/0.5%BSA中洗涤2次。对于每个样品，使用FACScan分析仪(BectonDickinson,Sunnyvale,CA)对3乂104个事件计分。使用CellQuest版本1.0计算机软件对FACS数据进行分析。在BectonDickinsonFACSCalibur上进行4色分析(four-coloranalysis)。所4吏用的大部分抗体已经有描述[36];FITC缀合人抗IgG和人批IgM从Sigma(Zwijndrecht，NL)购买。Ig基因重排分析从wt小鼠、MAGA和GA转基因小鼠的脾和肝中制备单一的细胞悬液。根据制造商说明书，在Automacs分离器上使用MACSCD45(B220)微珠(MiltenyiBiotec，Germany)阳性选择B细胞至~卯％的纯度[37]。用HindIII消化基因组DNA并将其吸印在Hybond尼龙滤膜上。使滤膜与32P放射性标记的Jk探针(通过从跨Jk1和Jk5区的基因组cDNA进行PCR扩增来获得)和32P放射性标记的碳酸酐酶II(CAII)探针杂交。电泳肝DNA以显示k胚系构型(2.8Kb条带)的信号。用与4kb条带杂交的CAII探针作为加样对照。使滤膜在Tyfoon9200(AmerschamBiosciences)上扫描。胚系Jk条帶的亮度4吏用ImageQuant5.2软件来定量，对应加样对照的亮度来标准化，并以对照肝DNA(为100%)的百分比来表示。用在来自杂交瘤的基因组cDNA上以扩增不同重排事件的PCR引物如下IGHJ1R:5'-CCAGTGCTGGAAGTATTCAGC画3，(SEQIDNO:9)，IGHJ2R:5,-CAGAGATCGAAGTACCAGTAG-3，(SEQIDNO:10),，IGHJ3R:5，-GGCCCCAGAYATCAAAAGCAT-3，(SEQIDNO:11)，，IGHJ4R:5，-GGCCCCAGTAGTCAAAGTAGT-3，(SEQIDNO:12)，，IGHJ5R:5'-CCCAGGRGTCGAACCAGTTGT-3，(SEQIDNO:13),,IGHJ6R:5-CCAGAACGTCCATRYMGTAGTA-3,(SEQIDNO:14)，DNAFISH分析制备目标DNA:如Heiskanen[38]所描述的，使单克隆杂交瘤细胞在DMEM/10%FCS中培养并包埋在琼脂糖中。收集来自GA转基因系1小鼠的肺并制备单一的细胞悬液。用蛋白酶K和RNA酶H处理包埋的细胞。使用微波炉和另一个载玻片的边缘，在poly-L-lysine载玻片(Sigma)上制备机械延长的DNA。探针将DNA片段纯化以检测GA转基因的重排和非重排拷贝。2.3kBSpel片段和3.6kBSpeI-BssHII片段用于与位于VHH和D之间的区域杂交，5.9kBBamHI-Spel片段或含有IgH3'LCR的低拷贝Bluescript质粒(16kB)用来检测LCR。这些探针使用生物素-11-dUTP(Roche)或洋地黄毒苷-11-dUTP(Roche)通过切口平移来标记。在用移液器将探针转移到载玻片上之前，先使它们在90°C5分钟、冰上3分钟、37°C45分钟进行变性。在原位杂交中杂交混合物含有50%甲酰胺、2xSSC、鲑精DNA(200ng/pl)、5xDenhardt，s、1mMEDTA和50mM磷酸钠，pH7.0。通过用移液器将25pl混合物转移到载玻片上并盖上24x32-mm盖玻片来进行探针杂交。将载玻片放在80。C加热板上2分钟使探针和目标序列变性。在增湿室中使探针在37。C下杂交过夜(增湿剂为50%曱酰胺、2xSSC)。如[39]中所描述的进行杂交后洗涤。半抗原标记纟笨针的免疫测用羊抗洋地黄毒苷(1:500，Sigma)、荧光素缀合兔抗羊(1:500，Sigma)和荧光素缀合山羊抗兔(1:500，Boehringer)来检测洋地黄毒香探针。用德克萨斯红缀合的抗生物素蛋白(1:500,Sigma)和生物素缀合的山羊抗抗生物素蛋白(1:500,Boehringer)来检测生物素4果针。此步骤重复两次。所有孵育和洗涤都根据48所描述的来进行。染色以后，使载玻片在系列梯度的乙醇(70、90和100%)中脱水5分钟，每步均在室温下进行。将细胞或DNA包埋在25pl抗褪色包埋剂Vectashield(VectorLaboratories)中。用100x物镜的LeicaDMRBE焚光显微镜进行显现。免疫和产生杂交瘤用5-20]ug抗原与Specol佐剂(IDDLO，Lelystadt,NL)或用预先配好的DKTP疫苗，在第0、14、28、42天皮下免疫8周龄小鼠，并在第50天腹膜内免疫免疫8周龄小鼠。在第0、14和45天取血。使用ClonalCellTMHY试剂盒(StemCellTechnologies,Canada)按照生产商说明书，在第56天使脾细胞与Sp2-0-Ag14骨髓瘤细胞系(由R.Haperen惠赠)融合。DKTP疫苗得自NetherlandsVaccineInstitute(B她oven,NL)。sdAB文库构建与筛选{吏用UltraspecRNA分离系统(BiotecxLaboratoriesInc，Houston,Texas,USA)，从经DKTP免疫的单拷贝GA小鼠和经TNFa免疫的MAGA小鼠的脾中分离总RNA。使用oligo(dT)引物制备cDNA。编码VHHDJ片段的DNA通过使用以下特异性引物的PCR来进行扩增vhlbackSfiI引物[40-42]联合MgG2hingrev引物(5，-AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3，(SEQIDNO:15》或者CH2huIgMrev引物(5，-TGGGACGAAGACGGCCGCTTTGGGAGGCAGCTCGGCAAT國3'(SEQIDNO:16))。将所扩增的VHHDJ(~400bp)用SfiI/NotI消化，凝胶純化并克隆到经SfiI/Notl消化的噬菌粒pHEN来源的载体上。转化到TGI电感受态细胞(StratageneLaJolla,USA)中，产生人单域抗体文库(singledomainantibodylibrary)。采用在吸附于塑料(包被未稀释疫苗的immunotube)上的DKTP疫苗抗原或经纯化的人TNFa(BiosourceInternational,USA)上淘选，来进行2轮选择。免疫细胞化学和蛋白质印迹使经过对rtTA存在应答的标记质粒转染的tet-on细胞系的细胞在载玻片上生长。经过24小时的多西环素诱导之后，将细胞在4%低聚曱醛/PBS中固定并在0.5%Triton-X-100/PBS中透化处理.。抗rtTA的HCAb以1:50的稀释液使用，随后通过山羊抗人IgGFITC染色(Sigma1:500稀释)。如先前描述的51来检测标记蛋白。使用山羊抗人IgG-HRP(Sigma,1/2500稀释)、人IgM-HRP(Sigma,1/2500稀释)按照标准方法探测蛋白质印迹。Superose6凝胶过滤使用AKTAFPLC装置(AmershamBiosciences,PiscatawayNJ)和用KC1/20mMHEPES-KOHpH7.9/lmMMgCl2/0.5mMEGTA/20%甘油平衡的Superose610/30柱，进行MAGA小鼠血清和人对照血清的大小分级分离。使用100pl/分钟流速，收集500nl的各流分(fraction),用100%三氯乙酸沉淀，并通过SDS-PAGE(在还原条件下)和随后的蛋白质免疫印迹分析进行分析。BIAcore测量实验在BIAcore3000表面等离振子共振生物传感器(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)上进行。使用由制造商提供的标准NHS-EDC试剂盒，将纯化后的蛋白固定在CM5传感芯片上至3000个共振单元(RU,随意结合应答单元)的水平。让抗体在10mMHepes,pH7.4,150mMNaCl，2mMEDTA，0.005%Tween20中，以40(ig/ml的恒定流速流经固定化的抗原。记录处于平衡的应答，并使用生产商的BIA评价软件利用曲线拟合获得平衡解离常数。潜果骆驼科动物样CH1剪接突变不足以在人重链基因座中发生外显子跳跃。尚未清楚在骆驼科动物中产生HCAb(IgG2和IgG3)是否涉及IgM+中间体的步骤。因此，我们首先产生两个nMT背景下[43]的杂交人基因座，一个基因座(MGS)具有人Cp、CS、Cy2和Oy3恒定区，而一个仅具有人Cy2和Cy3(图1)。首先将C丫诱变，使之含有骆驼科动物CH1剪接突变5。产生了MGS，这是因为已经表明，因ji链基因缺失跨膜区而几乎完全缺乏B细胞的nMT动物确实具有少量的B细胞群，在没有膜IgM的情况下产生功能性的IgG、IgA和IgE[44-46]，这提示(某些)B细胞在没有IgM表面表达的情况下发育。引入来源于美洲驼的2个VHH，而非使人VH区突变，以提高VH的可溶性[47,48]。骆駝科动物VHH区在第42、49、50和52位含有许多特征性的氨基酸[49]。第一个——VHH1含有所有这些VHH标志性氨基酸，仅为了检验可溶性的重要性作为此原理实验的证据；另一个一一VHH2缺乏这些关键的"可溶性"氨基酸之一，在第49位是Gln(Q)而非Glu(E)。我们选择第49位而非第50位(Arg,述基因座也含有所有5个人重链D和J区、以及在基因座的3，末端的基因座控制区(LCR)(图8)。令人意想不到的是，该剪接突变并没有导致在转基因小鼠中正确的CH1外显子跳跃和人Ig表达缺乏(图8)。分析含有缺乏CH1区的人基因座的转基因小鼠为了克服CH1剪接问题，我们产生了3个新的构建体(图1)，所有构构建体都含有缺失了CH1的Cy2和Cf3,—个构建体(MGA)含有C)i和C5(MGA),—个构建体不含C)i和C5(GA)，一个构建体含有缺失了CH1的Cji区段(MAGA)。获得了iuMT背景下具有不同拷贝数(l-5个拷贝)的3个MGA、6个G厶和4个MAGA转基因小鼠系。B细胞发育在骨髓(BM)和脾中分析。具有不同拷贝数的小鼠显示出同样的结果。GA和MAGA的表达拯救了jiMT小鼠的B细胞发育MGA小鼠不能在|_iMT背景下拯救B细胞发育，而GA和MAGA构建体有效地拯救了B细胞发育。在不同淋巴样区室中，B220/CD19阳性细胞的务》救在30-100%之间，与拷贝数无关(图2A)。通过BM的流式细胞术使用B220对人IgM或人IgG染色证实了这一点(图2B)。MAGA小鼠在BM中含有人IgM生产细胞，所述细胞在野生型或luMT小鼠中不存在。因为这些细胞不含人IgG，所以它们没有恰当地经历类型转换。GA小鼠仅含有人IgG表达细胞。MGA小鼠含有非常少的(即使有的话)在细胞表面表达人IgG的B细胞，但有趣的是，有一部分B220细胞表达胞内IgM而非IgG(图2B)。与MAGA和GA小鼠相比(见下文)，MGA小鼠表达小鼠Ig轻链(图6G)。这些结果表明不同构建体中的Cp和Oy基因被表达，而且强烈地提示CH1的缺乏对于基于VHH的抗体的细胞表面表达至关重要。在B细胞于BM中发育期间人HCAbIgG和IgM功能性地取代鼠(前)BCR在由大周期发育进程到小的静息前B细胞期间，特定细胞表面标记的表达以前BCR依赖性形式被减量调节[36]。用FACS分析各种标记的表达情况，以研究人HCAb功能性地取代前BCR的能力。祖B细胞表达高水平的胞质SLC、IL-7R和CD43，它们在前BCR表达时被减量调控，并且不会出现在成熟B细胞中(图2C，比较了来自iliMT小鼠的祖B细胞、wt小鼠的表面IgM-祖B细胞/前B细胞部分以及wt小鼠的表面IgM+B细胞部分)。来自MAGA/pMT或GA/pMT小鼠的人Ig+B细胞具有低水平的SLC和IL-7R，这表明在SLC和IL-7R的减量调节中人单链IgG和IgM受体功能性地取代了鼠前BCR。对于CD43而言，这种情况似乎仅出现在G八小鼠中，但MAGA中CD43表达的持续可能与在这些小鼠中B-lB细胞分化增多的发现有关。同样地，正如在正常的前BCR信号转导中一样，CD2和MHCII类的表达被诱导。在前B细胞时期被短暂诱导的IL-2R/CD25的水平在成熟的MAGA或GA/pMTB细胞上非常低，并且与成熟的wtB细胞的水平相当(图2C)。此外，在成熟的MAGA或GA/pMTB细胞中检测不出icIgK的表达(图2C),并且在经过5天的IL-7+培养后撤走IL-7时在体外BM培养物中也未诱导icIgK的表达(未出示)。最后，在MAGA或GA转基因小鼠中的人HCAb表达型B细胞群部分地构成了在BM中产生的细胞(高HAS和高AA4.1/CD93)，并部分地构成已在外周中成熟且再循环的细胞(HAS低和CD93低)，与在常规小鼠中的发现相当。这些结果共同表明就发育调节标记的表达而言，在B细胞发育期间，人HCAbIgG和IgM功能性地取代了鼠(前)BCR。IgL链未被诱导(参见下文)。BMRNA的cDNA分析结果表明两个VHH区段都被用于VDJ重组、没有CH1以及重要的是，在CDR3区中有丰富的多样性(图2D)。多个重排和等位基因排斥在免疫之后，尤其是免疫5拷贝GA系1之后，从MAGA和GA系中制备出很多抹杂交瘤(参见下文)。序列分析表明，在多拷贝GA基因座中可发生不止一种重排。在所分析的5林不同的5拷贝杂交瘤中，一抹(G20)重排了一个拷贝，其符合读框；2抹杂交瘤(T7和T12)具有2个重排体，每抹杂交瘤中的2个重排体中有1个不符合读框；一抹杂交瘤(T3)具有2个符合读框的重排体(J2和J4);而一林杂交瘤(T1)4个重排体，2个重排体符合读框(J2和J4)。Tl和T3表达2种生产性mRNA，对分泌型抗体的质i普分析准确匹配了cDNA,证实了所述mRNA(未出示)。我们使用检测每个拷贝的LCR探针和仅检测非重排拷贝的位于VHH与D区段之间的探针，也对两抹不同的杂交瘤G20(1个重排体)和T1(4个重排体)进行了DNA拉伸纤维FISH和标准DNAFISH(图3A-E)。对照肺细胞显示了5个完整的拷贝加上在每个末端的半个转基因(图3A)，与DNA印迹图谱一致(未出示)，而杂交瘤的确显示出分别在G20和Tl中的1个和4个重排的拷贝(图3B、C-E)。因此，多个拷贝可以在相同的等位基因上成功地重排。我们随后查询与正常的鼠基因座相比HCAb基因座是否具有任何优点(缺点)，以及是否存在基因座的等位基因排斥。分析wt背景下的GA系1转基因小鼠的B220/CD19阳性BM细胞的人IgG和鼠IgM的表达。4艮明显，GAB细胞要么表达小鼠Ig，要么表达人Ig(图3F)，显示出等位基因排斥。GA、MAGA和MGA转基因小鼠中的脾细胞为了确定所述转基因对|iMT小鼠中的B细胞分化的影响，我们通过流式细胞术、使用CD21/CD23概况，检验了脾B细胞亚群的大小(图4A)。在GA小鼠中，低CD21低CD23的未成熟B淋巴细胞群在正常的范围内，而人单链IgG表达型细胞既能分化成滤泡(FO;CD21+CD23+)B细胞，又能分化成边缘区(MZ;高CD21低CD23)B细胞。在MAGA小鼠中，未成熟B细胞部分增多，这表明HCAbIgM表达型细胞向FO和MZ8B细胞的分化稍微受损。在这些脾中，CD23的表达减少与CD43和CD5的表面表达水平提升相伴随，这表明了分化成B-1B细胞谱系。在MGA转基因小鼠中存在的少量人IgM表达型B细胞(也表达小鼠轻链，参见图6),显示出与MAGA转基因小鼠中的FO/MZ分布相类似的FO/MZ分布。MAGA和GA(而非MGA)小鼠具有正常的脾构造，显示出T细胞分别聚集在动脉周淋巴细胞层(PALS)中，被在白髓外边界存在的含有滤泡和边缘区的富含B细胞区域所包围(图4B)。在T细胞依赖性抗体应答期间，它们也在次级淋巴组织的B细胞滤泡中形成生发中心，与wt相当(未出示)。这些是记忆形成和由体细胞超变引起的基于亲和力选择的场所。在GA小鼠中，在这些生发中心中检测到人IgG阳性细胞。我们通过分析来自淋巴集结中存在的B细胞的cDNA，证实了人IgG基因的超变(图4C)。使用了VHH1与VHH2两者。综上所述，这些结果表明，在GA和MAGA转基因小鼠中，迁移自BM的未成熟B细胞具有在脾中分化成FOB细胞和MZB细胞两者、并且在抗原攻击之后经历体细胞超变的能力。单拷贝基因座有效拯救以及CH1的缺乏是必需的GA系1小鼠(图2A)含有5个拷贝的G厶基因座，因此有可能所述有效拯救与基因座的拷贝数有关。然而，通过与FlpeR系23配种进行Flp重组而由5拷贝GA系1获得的单拷贝转基因系，以类似的程度拯救了B细胞发育(图4D、图2A)。通过Cre重组(与cre表达型系育种)使Qa和C5区从非拯救型单拷贝系MGA(系3)中缺失来产生单拷贝GA种系，证实了单拷贝的该基因座对于拯救已足够，并证实具有CH1区的C)a恒定区的存在是抑制性的(图4D)。如其他GA系一样，先前的非拯救型基因座现在赋予同样的B细胞发育9。因此，拷贝数并不影响拯救，而CH1在C|i区的存在抑制了B细胞拯救(也参见下文)。在MAGA和GA转基因小鼠中小鼠Ig轻链基因座不重排通过血清的DNA印迹(未出示，但参见图2C和6A)或通过FACS，在MAGA和GA小鼠中没有检测到鼠Ig轻链蛋白，这表明鼠轻链基因没发生重排。这通过DNA印迹分析比较来自分选后的脾B220+细胞部分的DNA中与肝细胞的DNA中的Igk基因座胚系信号亮度而得以证实(图5A和B)，这表明小鼠轻链不发生重排，仍然处于胚系构型。相反，在MGAMT小鼠中的少量人Ig表达型细胞中检测到轻链(参见图6G)。因此，人HCAb在BM中的早期B细胞发育中的表达不能提供导致轻链重排的信号。在这方面，所述HCAb模拟BCR而非前BCR，这可能与它们在没有CH1的情况下不能与拟轻链(pseudo-lightchain)结合有关[61]。GA/jiMT和MAGA/pMT小鼠的血清分析在MAGA血清中存在人IgM,而在MAGA和GA小鼠血清中都存在人IgG。在未免疫的成年动物中，人IgM(〈50]ig/ml)和人IgG(200-1000pg/ml)存在的水平比得上正常小鼠或携带正常人IgH基因座的转基因小鼠中的水平[65]。所有六只GA小鼠血清的凝胶电泳显示了在非还原条件下MW为70kD而在还原条件下MW为35kD的HCAbIgG,这与缺乏轻链且每条重链都缺乏CH1外显子的重链二聚体一致(图6A、B)。MAGA小鼠的血清含有多聚的仅有重链的人IgM。在还原条件下(图6C)，所有4个系都含有IgM链，其MW为人对照IgM减去CH1后的MW。所述血清也在非还原条件下被大小分级(图6D水平部分)，其后再于还原条件下通过凝胶电泳对每一片段部分进行分析(图6D,垂直泳道)。当与人血清五聚体900kDIgM对照比较时，所述转基因IgM于600kD分级分离，这与其也为多聚体并缺乏轻链和CH1相一致。因此，MAGA小鼠产生HCAb多聚的IgM和二聚的IgG,而GA在血清中产生二聚的IgG。MGA小鼠的血清分析在MGAMT系的外周和脾中几乎无B220阳性细胞(<野生型B220阳性细胞的1%)，而且在脾中仅偶有少量B细胞群集可以看到(图4B)。仅在纯化以后才在血清中4企测到少量人IgM和IgG(图6E、F)。在还原条件下，在这些小鼠中的人IgM大小正常，然而循环人IgG较短(表观MW约35kD，与缺失CH1—致)。有趣的是，也可以检测到小鼠k轻链，推测与人IgM有关(图6G)。人IgM和IgG低于定量ELISA测定的检测水平，然而我们测试了MGAMT小鼠是否能够对免疫产生应答。用人肺瘤坏死因子-a(TOT-a)免疫小鼠，wt小鼠产生了强烈的TNF-a特异性抗体应答，而在所使用的两只MGA系3小鼠中，通过ELISA或DNA印迹分析不能检测到抗原特异性人IgG(未出示)。免疫MAGA和GA小鼠导致抗原特异性Ab产生用大肠杆菌hsp70、DKTP(白喉类毒素、百日咳博德特氏菌的全细胞溶解产物、破伤风类毒素和灭活的脊髓灰质炎病毒1、2和3型)和rtTA来免疫GA/|liMT小鼠[50],而MAGA小鼠用人TNFa免疫。使用杂交瘤或使用单域Ab(sdAb)通过噬菌体展示文库，从ELISA阳性血清小鼠中分离出各个完整的抗体。经抗体RNA的RTPCR之后，对ahsp70、破伤风类毒素和rtTA的特异性单克隆测序(图7A)。这表明产生了IgG2抗体(8个中的7个)和IgG3抗体(8个中的1个)两者(sdAb分离自IgG2文库)。使用了不同的D和J区。来自11HCAb的VHH是超变的，尽管频率不高。三种hTNFa-特异性抗体(一抹阳性IgM杂交瘤，图6a-hTNFa编号1和两种sdAba-hTNPa编号2和3)都在CDR2区具有不同的超变。当对全部14种抗体的序列进行比较时，结果证明尽管使用了所有J区，但是如在人中一样，JH4的使用频率最高。令人意想不到的是，所有抗体都含有美洲驼VHH2(在第49位具有谷氨酰胺而非典型的谷氨酸[51])。最后，很明显CDR3区提供了大部分的多样性27。长度在10-20个氨基酸之间不等(平均13.6个氨基酸)，这与通常在美洲驼和人中看到的非常类似[52,53]。我们随后检验了作为杂交瘤上清液和sdAb的细菌周质部分的这些HCAb在常规测定中是否具有功能性(图7)。所有抗体在ELISA中皆呈阳性，并且所有抗体在蛋白质印迹上的抗原检测中皆呈阳性(例如a-DKTP和a-rtTA血清与杂交瘤培养基与a-百日咳博德特氏菌sdAb,图7B)。我们也使用转染了rtTA表达质粒的细胞系，以免疫细胞化学检验了a-rtTAIgG(图7C、D)。rtTAHC-IgG给出了非常清晰且特异性高的核染色。许多抗体的亲和力都高，尽管某些抗体(特别是sdAb)的亲和力低很多。例如，在免疫细胞化学中使用的a-rtTA抗体(图7C、D)在BiaCore上测定为大约3nM(图7E)。潜论在此，我们报道了能拯救B细胞发育的修饰型HCAb基因座在jxMT小鼠中表达，导致功能性HCAb产生。这些小鼠可以被免疫以产生抗原特异性HCAb。如在駱驼科动物中一样，CH1的移除对于HCAb分泌至关重要，但在3'CHl/内含子边界的单个骆驼科动物(综述30)剪接突变仍不足以消除CH1,因此至少在人基因座中还需要此单点突变以外的措施。含CH1以及VHH的IgM阻断B细胞发育，这可能由IgM表面分子在前BCR背景下的无效装配所致。相反，表达HCD样人n蛋白的小鼠在SCID背景下不依赖人5而发育出正常的CD43前B细胞[54]。截短的C)a蛋白在不与L轻链结合的情况下在B细胞表面表达，据认为通过自我聚集模拟前BCR信号[55]。通常，BiP通过与随后参与链间接触的Ig链疏水表面结合，作为蛋白伴侣协助(chapei'on)抗体分子折叠与装配31。在VHH的FR2中存在亲水性氨基酸很可能防止BiP与VHH结合，所述VHH不需要任何(替代)轻链以变得可溶。同时，CH1提供了与BiP的相互作用(这被认为将重链保留在ER中)，直到装配(由轻链代替BiP)完成。在前B细胞受体的水平上，我们的结果表明，当含有CH1区的p重链与VHH连接时，转基因p重链与Vpre蛋白(作为替代轻链(SLC)中与人5蛋白非共价締合的部分)的配对将不能够发生。因此，MGS和MGA转基因小鼠中的人IgM将在这一点上类似于不完全的前BCR样复合物，所述复合物已知不足以发出扩增和发育进展的信号[56,57]。这可以解释为什么BM中仅30%的B220阳性细胞具有胞内IgM(图2B)。在这些小鼠的脾中存在少量成熟B细胞，可以通过最近描述的新型受体复合物来解释，所述新型受体复合物含p重链但缺乏任何SLC或常规的轻链[58]。当Cy2和3中不存在CH1并且IgM从基因座中移除时，B细胞发育得以拯救，这表明IgG可以功能性地取代IgM。随祖B细胞阶段前进而表达的IgGl受体能够代替IgM支持成熟CD21+B细胞在Rag2-A小鼠在中发育[59]。最近有人也表明，预先重排的骆驼科动物IgG2a可以在^MT(和CA-Z-)背景的2只转基因小鼠中的1只中部分地拯救B细胞发育13。在我们的研究中，在全部IO个独立的转基因小鼠系中，缺少CH1的IgM或IgG拯救了B细胞发育。此外，我们没有观察到轻链重排，推断进一步的B细胞分化并不需要轻链表达。本研究获得的结果与Zou等[60]的结果的不同，可以通过因为在我们的构建体中加入LCR而导致重链基因座的表达水平(和发出的信号)来解释。我们的结果证实缺乏CH1[61]或缺乏VH及CH1[62]的截短型n重链蛋白不能与SLC结合并且不能激活k基因重排。5拷贝GA系1(以及其他多拷贝系)拯救了B细胞发育，其程度与与在基因组中相同位点整合的单拷贝系相同。有趣的是，在多拷贝的转基因基因座中发生一种或多种重排(图3)。来源于两种单一脾细胞的杂交瘤之中有两林产生了两种生产性HCAb转录物和蛋白。此结果证实了在相同B细胞中表达两种抗体是无毒性的[63]。然而，这一预测37不能被我们的结果证实，我们在抗原攻击后获得的5抹杂交瘤中发现2抹双抗体表达型细胞。因为BM细胞在细胞表面表达小鼠Ig或人Ig,所以(多拷贝)基因座在野生型小鼠中受到等位基因排斥。没有明显的细胞群在细胞表面表达这两者(图3F，顶图)。可能最有趣的是小鼠人Ig表达型细胞相对于人Ig表达型细胞的数量。在wt/5拷贝GA小鼠中，有3个可能的等位基可进行重排含1个Ig基因座的2个小鼠等位基因与含5个人HCAb基因座的1个等位基因。如果是随机选择，则人等位基因将以3次中仅1次的几率被选中。如果计数基因座的数量，那么人基因座将首先在7个细胞中的5个细胞中重排。然而，内源性小鼠HCAb和转基因人HCAb的表达几乎相等(44/38,图3F底图)。尽管这些数字忽略了来自随机使用V区的可能偏差以及在转基因基因座上的可能的位置效应，但是它们强烈地表明，第一个选择是等位基因的随机选择，接着是每个等位基因中多个基因的可能的重排。这与我们频繁观察到GA基因座发生多个重排的事实一致。一般来说，生产性重排对重组减量调节，以防止其他等位基因重排。然而，在转基因等位基因上的多个拷贝出现在相同的开放基因座(openlocus)上，并似乎能够在RAG减量调节之前被重组。这有可能是因为多个重排同时发生，或者如果牵涉到空间成分(spatialcomponent)("区室")，那么重组尽管在RAG被减量调节之前会关闭，但仍会有足够的时间使基因座中的另一个基因重排。仅当在wt小鼠中重排不是生产性(无信号发出且RAG继续停留)时，才会有足够的时间使第二个基因座被激活、取代第一个基因座并被重排。在相同染色体上含多个基因座的其他物种具有更多表达两种Ab的细胞这一观察结果[64]支持按照此论点。重要的是，这些实验表明，HCAb基因座可以成功地在小鼠中表达。抗原攻击导致不同类型的高亲和力抗原特异性人HCAb产生，所述不同类型取决于基因座的组成。这些抗体的表达水平与正常小鼠或其他"正常"人IgH转基因小鼠的水平相当[65]。我们的实验仅用了2种可变区，却成功分离出针对我们所试验的几乎所有完全不相关蛋白的具有多样特异性的高亲和力抗体，这i正明了由CDR3产生的多样性的有效性和高效性[66]。因此，与使用噬菌体展示从噬菌粒文库中产生人单链抗体片段39相比，进行V(D)J重组和体内选择提供了更关键的优势。杂交瘤可以容易地产生，这重要的是允许直接克隆并表达全人HCAb或sdAb片段，而无需噬菌体展示和进一步的筛选。因此，这些小鼠揭示了制备用于临床或其他用途的人HCAb的全新的可能性，尤其是根据以下证据4:HCAb可以识别对于常规抗体而言几乎无抗原性的表位，例如酶的活性位点。数量有限的可变区可以解释为什么不是所有抗体都被识别；为什么脊髓灰质炎和白喉的蛋白不能在GA小鼠中引起应答，而在wt对照小鼠中却可以引起应答。令人意想不到的是，所有这些抗体都具有美洲驼VHH2区。此区在第49位不包括保守的氨基酸[67]，与具有该保守氨基酸的VHH1相反，其可溶性应当更高。然而，我们预期，在该基因座中添加更多的可变区可能导致抗体谱甚至更广。当优选在单个等位基因上避免多拷贝的基因座时，可能有利的是产生含有多个各自包含单拷贝不同VH区的等位基因的小鼠以增加多样性。在这些新的基因座之中，一个可以^f吏用正常存在的(人)VH区或经工程改造以提高可溶性18和轻链配对的VH区。总而言之，我们已证明可能是任何类型的抗原特异性高亲和力HCAb都可以在小鼠中产生。此技术将允许产生应答抗原攻击的任何类型的全人HCAb或其片段，以在人体中用作治疗剂或诊断剂。通过使用不同的脊推动物基因座，我们的技术也允许产生来自任何脊推动物的高亲和力成熟抗体，以用作试剂、诊断剂或用于治疗动物。Janssens等(2006)已经表明，转基因VH基因座适当地重组而产生由转基因编码的仅有重链之抗体，而且这样的基因座在内源(小鼠)重链免疫球蛋白基因座的存在下对等位基因排斥敏感。为了表明用于产生仅有重链之抗体的VH转基因基因座的数量可以通过利用等位基因排斥的方法来增加，使2只含有不同的仅有重链的基因座的小鼠杂交，产生含有上述2个基因座的后代。一只小鼠含有MGA基因座(IgM和IgG基因座，Janssens等，2006),而另一只含有GA基因座(仅有IgG基因座，Janssens等，2006),两只小鼠都有iaMT背景。通过标准方法，由双转基因后代的b细胞获得杂交瘤，并在培养物中培养。通过PCR和DNA印迹，分析所产生的许多单个单克隆细胞系，其表明含有经生产性重排的MGA基因座的细胞系含有未重排的或非生产性重排的GA基因座。相反，含有经生产性重排的GA基因座的细胞系含有未重排的或非生产性重排的MGA基因座。因此，可用的VH区的总数可用在所述重组方法中。实施例3和4本发明第一方面的优选方案中，使用在前面实施例中描述和本领域已知的方法(Janssens等2006)，通过将人VH区(或其变体)克隆到多个经修饰的人基因座上，增加功能性人VH区的全部数量，其中所述经修饰的人基因座含有完整的Dh区、完整的Jh区以及Qi、Cy2、Oy3和Ca区与3'LCR的组合。可以4吏用在不同的基因座上的多个相同VH区或不同的基因座上的不同Vh区，来实施此方法。不同的基因座可以含有相同的重链区或不同的重链区。实施例3涉及在基因座上含有相同Vh区的基因座，所述基因座具有重链区的不同组合，实施例4涉及具有相同重链恒定区但具有不同Vh区的2个基因座。显然，在2个实施例中都可以添加额外的基因座。实施例3使用对所述可能的39个功能性人VH区(可供选择的是，可以使用或添加人VL区、TCRV区或者通过右边获得的所有这些的变体)中的每个所选Vh特弄性的引物，通过PCR扩增人基因组DNA来分离人VH区。将人VH区成组地克隆到在以上实施例中描述的基因座上(图9)，即包含人Dh加上Jh(或其他D和J区)和Cfi、Cy2、Cy3(每个都缺乏CH1)加上3，LCR的基因座上。缺乏CHI的Coc区加上转化区将被分别克隆到GA基因座中(图10)。此GA基因座是原始基因座的变体，因为它不含lox位点并且通过标准同源重组才支术所述美洲驼vhh区，而留下单一PI-PspI位点(图10)。可以将功能性Vh区克隆到一起，每个基因座上有任意多个功能性VH.区。最初，以每组2个克隆基因开始，将17个功能性人VH区克隆到一组中。通过传统的方法(例如使用Xhol-Sall限制性消化/连接，Xhol和Sail相容位点的连接使这两个位点消除)，将第二组添加到这些初始构建体的每一个构建体中。在BAC载体中，将含有4、4、4、3和2个基因的組连接成17个基因的一组中。显然此方法可以通过合并含有其他数量基因的组来实行。以上方法可以在任何点上终止，以得到所需数量的Vh区，或以上方法可以延伸以得到更大凄文目的Vh区。将整个组(例如17个基因)克隆到所述修饰型GA基因座中的单一PI-PspI位点中。Ca区将克隆到此基因座的I-Ceul位点中，从而产生能够产生Iga和IgG的AAGA基因座(图10)。可供选择的是，可以将其他重链区克隆到其中。然后将这些最终的基因座导入如以上实施例中所述的个别的转基因小鼠中(优选具有缺陷型小鼠IgH基因座，例如pMT)。将这些个别的基因座用于产生个别的小鼠系，一个系将仅产生IgG,而一个系将产生IgA和/或IgG。随后将这些小鼠杂交，以在2个不同的基因座上使可用的VH区总数达到34个。使这些小鼠杂交至2种基因座纯合，将使68个VH区可用于重组。具有多个拷贝的整合基因座还会进一步增加此数目。通过标准方法，对由这些小鼠的B细胞制备的杂交瘤的分析将用于表明当出现生产性重排基因座时，由于等位基因排斥，经育种引入的其他基因座或者是非重排的，或者是是非生产性重排的。实施例4通过上文所述的同样方法，使与上文所述区相类似地分离的具有1个或更多个VH区(或通过诱变获得的其变体)的不同组克隆到两个不同的基因座上。这将产生两个不同的GA基因座(或其变体，例如增加Ca)。将这些基因座引入到不同的小鼠中，产生不同的转基因系(例如每个具有10VH区的2个基因座，图.11)。接着将这些小鼠杂交以获得双转基因小鼠，所述双转基因小鼠将具有可用于重组过程的所使用的所有Vh区。使这些小鼠杂交至2种基因座纯合，将使可用于重组的Vh区数目加倍(困121个基因座整合到1号染色体上和一个基因座整合在8号染色体上的核型图)。具有多拷贝的整合基因座还会进一步增加此数目。对由这些小鼠的B细胞制备的杂交瘤的分析将用于表明当出现生产性重排基因座时，由于等位基因重排，通过育种而被引入的其他基因座或者是非重排的，或者是非生产性重排的。以上方法可以在任何点上终止，以得到所需数量的Vh区。将所述D、JH和恒定区添加到这些VH区中。然后将这些最终的基因座导入如以上实施例中所述的个别转基因小鼠中(优选具有缺陷型小鼠IgH基因座)。可供选择的是，lox位点的安置允许消除个别恒定区，以产生仅含有C(a(IgM)、或仅含有Cy2和Cy3(IgG2和IgG3)、或仅含有Ca(IgA)或者它们的组合的不同基因座。这些不同的基因座用于产生不同的小鼠系，所述小鼠系将仅产生人IgM、或仅产生IgG、或仅产生IgA或者它们的组合。参考文献[I]Kabat，E.，Wu,T.T.,Perry,H,M.,Gottesman，K.S和Foeller,C.(1991)UnitedStatesPublicHealthServicesPublicationNo.91-3242,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD[2]Jaton等，(1968)Biochemistry,7，4185-4195[3]Xu和Davies,(2000)Immunity,13，37-45[4]JakobovitsA.Thelong-awaitedmagicbullets:therapeutichumanmonoclonalantibodiesfromtransgenicmice(期待已久的魔术弹来自转基因小鼠的治疗性人单克隆抗体).ExpertOpinInvestigDrugs.1998Apr;7(4):607-14.Links[5]DavisCG,JiaXC,FengX，Haak-FrendschoM.Productionofhumanantibodiesfromtransgenicmice(从转基因小鼠中产生人抗体).MethodsMolBiol.2004;248:191-200.[6]KellermannSA，GreenLL.Antibodydiscovery:theuseoftransgenicmicetogeneratehumanmonoclonalantibodiesfortherapeutics(利用转基因小鼠产生用于治疗的人单克隆抗体).CurrOpinBiotechnol.2002Dec;13(6):593-7.Links[7]EP1690935[8]US2005287630[9]WO9634096[10]WO9402602[II]Hendershot等，(1987)J.CellBiol"104，761-767;[12]Brandt等，(1984)Mol.Cell.Biol.,4,1270-1277[13]Hamers-Casterman等，(1993)Nature,363，446-448[14]Stanfield等，(2004)Science,305,1770-1773[15]RickJanssens,SylviaDekker，RudiW.Hendriks,GeorgePanayotou,AlexandravanRemoortere,JohnKong-aSan,FrankGrosveld和DubravkaDrabek，Generationofheavychainonlyantibodiesinmice(在小鼠中产生仅有重链之抗体)，Proc.NatlAcadUSA2006,10;103(41):15130-5.Epub2006Oct2.[16]deGenst等，DevCompImmunol.2006;30:187-98[17]Davies，J和RiechmannL.Biotechnology(1995)vol13，475-479AntibodyVHdomainsassmallrecognitionunits(作为小识另ll单元的抗体VH区)[18]Ward等，(1989)Nature,341，544-546[19]Davies和Riechmann,(1996)ProteinEng.,9(6)，531-537;[20]Lutz和Muylde腿ns,(1999)J.Immuno.Methods,231，25-38[21]Tanha等，(2001)J.Biol.Chem.，276,24774-24780[22]Yau等，(2005)J.Immunol.Methods,297,213-224[23]VanDijk和vanderWinkel,Curr.Opin.Chem.Biol"(2001)Aug5(4)，368-374[24]Leher等，(1999)Exp.Eye.Res"69,75-84[25]Sitia等，(1990)Cell,60，781-790[26]JespersL，SchonO，FammK,WinterG.(2004)Aggregation-resistantdomainantibodiesselectedonphagebyheatdenaturation(通过热变性在噬菌体上选择的抗群聚结构域抗体).NatBiotechnol.22(9):1161-5.[27]RavnP,DanielczykA,JensenKB,KristensenP，ChristensenPA,LarsenM，KarstenU,GoletzS.(2004)MultivalentscFvdisplayofphagemidrepertoiresfortheselectionofcarbohydrate-specificantibodiesanditsapplicationtotheThomsen-Friedenreichantigen(用于选择糖类特异性抗体的噬菌粒库的多价scFv展示以及其在Thomsen-Friedenreich抗原中的应用)JMolBiol.343(4):985-96.[28]JespersL,SchonO,JamesLC，VeprintsevD,WinterG.(2004)CrystalstructureofHEL4，asoluble,refoldablehumanV(H)singledomainwithagerm-linescaffold(HEL4的晶体结构，具有胚系支架的可重新折叠的可溶性人V(H)单一结构域).J.Mol.Biol.337(4):893-903.[29]DolkE，vanVlietG,PerezM,VriendG,DarbonH,FerratG,CambillauC，FrenkenLG,VerripsT.(2005)Inducedrefoldingofatemperaturedenaturedllamaheavy-chainantibodyfragmentbyitsantigen(温度变性的美洲驼仅有重链之抗体由其抗原诱导的重新折叠).Proteins.59(3):555画64.[30]DolkE,vanderVaartM,LutjeHulsikD,VriendG,deHaardH,SpinelliS,CambillauC，FrenkenL,VerripsT.(2005)Isolationofllamaantibodyfragmentsforpreventionofdandruffbyphagedisplayinshampoo(通过在洗发水中的噬菌体展示分离用于预防头屑的单峰骆駝抗体片段).ApplEnvironMicrobiol.71(l):442-50.[31]Zhao,Y.,Pan-Hammarstrom,Q.，Zhao,Z.,Wen,S.和Hammarstrom,L.SelectiveIgG2deficiencyduetoapointmutationcausingabnormalsplicingoftheCgamma2gene(由引起Oy2基因异常剪接的点突变所致的选择性IgG2不足).Intlmmunol17，95-101(2005).[32〗Lefranc,M.,Giudicelli，V.，Ginestoux,C.，Bodmer，J.，Muller,W.,Bontrop,R.,Lemaitre，M.，Malik,A.，Barbie,V.和D.Chaume.1999.IMGT，theinternationalImMunoGeneTicsdatabaseNucleicAcids.Res.127:209-212.[33]MillsF,HarindranathN,MitchellM和MaxE.EnhancercomplexeslocateddownstreamofhumanCalphagenes(4立于人Coc基因下游的增强子复合物).JExp,Med.186,845-58(1997)[34]Nguyen,V.K"Hamers,R"Wyns,L.禾口Muyl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