靶核酸序列电化学检测方法

专利名称：靶核酸序列电化学检测方法
靶核酸序列电化学检测方法
组件(collection)。
已知的方法借助电化学检测，已经为鉴定给定的生物样品中靶核酸序 列的存在与否提供了可能。
这些方法尤其为检测核酸中的靶序列，例如给定的病毒的部分基因型 (patrimoine g6n6tique)的相应序列提供了可能。
根据已知的技术， 一旦鉴定了该核苦酸序列，随即制备由含有所述序 列的寡核苷酸形成的探针，然后将这些探针连接到固相支持物上。探针包 含给定数目的、具有可氧化的核苷酸碱基的核苷酸。然后将给定的生物学 样品与接枝(graft)了所述探针的固相支持物相接触，使得在合适的条件下， 包含靶序列的核酸与探针杂交。随后使杂交的核酸与能够氧化探针中核苷 酸碱基的过渡金属络合物(complex)发生反应，然后通过对样品施加可变电 场，同时测量样品中传播的电流，来确定杂交的存在与否如果生物学样 品中含有包含所述靶序列的核酸，则会发生杂交。所述电流继而依赖于所 述能够被氧化的给定碱基的数目。事实上，当进行电位扫描(potential scan) 并同时记录样品中传播的电流时，取决于探针是否与包含靶序列的核酸杂 交，以电流表示的响应会有所不同。在任何情况下，发生杂交的探针的核 普酸碱基氧化的电流值高于与未杂交的核苷酸碱基的氧化相关的电流值。
具体地，可以参考文件US 2002/106 683，其中描述了 一种这样的4全测 方法。
然而，这样的方法实施起来相对复杂，因为需要特别制备寡核苷酸探 针以接枝到固相支持物上，此过程时间长而且费用高。
因此，这样一个问题被摆在了人们面前提供一种不仅易于操作而且 更加经济的方法。本发明旨在解决这个问题。
为了解决该问题，根据第一方面，本发明提出了一种电化学检测靶核 酸序列的方法，所述方法是属于这样的类型，根据该类型提供可含有至 少一种核酸分子的生物学样品，所述核酸可以含有给定的靶序列，将所述生物学样品与氧化剂混合，所述靶序列含有可以被所述氧化剂氧化的碱基；
提供可以与所述给定的耙序列偶联的互补装置(complementary means );向 所述样品施加电场，所述电场能够引起所述氧化剂与所述核芬酸碱基的反 应，并测量通过所述样品的电流以确定所述靶序列的存在；根据本发明， 所述互补装置包含适合于复制所述靶序列的可活化的扩增装置，所述扩增 装置包含至少这样的核苷酸，所述核苷酸属于包含所述核普酸碱基的类型， 其中所述类型的所述核苷酸能够在复制中被消耗从而构成复制的核酸 (replicated nucleic acids)，如果当所述扩增装置被活化时电流有所降低，则 确定所述给定的靶序列的存在。
因此，本发明的一个特点在于实施一种用于扩增核酸以及同时测量电 流的方法，该电流的测定证明或不证明在所述扩增期间扩增装置的元件之 一(具体地说，游离核苷酸之一)的消耗。这样，如果靶核酸序列与可活化的 扩增装置很好地对应，则该靶序列将在扩增过程中被复制，在该复制期间 用作底物的游离核苷酸(其浓度在开始时被确定)的数目将会减少。因此，如 果游离的核苷酸数目发生有利于掺入扩增中合成之核酸的核苷酸数目的降 低，则能够与氧化剂反应的、与游离核苷酸对应的核苷酸碱基的量将可能 越来越有限，结果电子转移将减少，最终所测得的电流将会减少。不过， 在下面的详述中，我们将更详细地说明以下几点氧化剂还可以氧化起初 存在的核酸中掺入的核苷酸的碱基，和通过复制而合成的核酸中掺入的核 香酸的碱基，但是另一方面，由此产生的电流弱于由游离核苷酸碱基氧化 而产生的电 流。
根据本发明的一个特别有利的实施方案，寻求在其上鉴定靶序列的核 酸是单链或双链的DNA或RNA分子。因此，可活化扩增装置包含适合于 杂交靶序列上游(hybridizing upstream of)的装置和实现所述序列复制的装 置。该复制所产生的核酸数目随时间呈指数增加，从而显示可氧化的核苷 酸碱基的游离核苷酸的数目也随时间呈指数降低，与此同时，能够很快地 发现到通过样品的电流的降低。
有利的是，游离核苷酸的含氮碱基是嘌呤核苷酸碱基，例如鸟嘌呤或 鸟噤呤的化学类似物(例如疏基鸟嘌呤或氧代鸟嘌呤(oxoguanine)型)，使用 的氧化剂是钌络合物。后者具有还原形式和氧化形式，后者不可逆地催化 鸟嘌呤的氧化。当对混合物施加电场时，由此产生的电流的测量值显著地依赖于具有鸟嘌呤的游离核苷酸的浓度，这是因为，尽管氧化剂也氧化掺 入复制产生的核酸中的核苷酸的鸟噤呤，游离核苷酸的氧化动力学以及扩 散系数比所述复制产生的核酸大得多。
此外，由于从所述靶序列的复制而产生的核酸数目依赖于时间，通过 样品的电流的降低也依赖于时间。因此，如果起始样品具有高浓度的核酸， 并且如果这些类型相同的核酸全都具有靶序列，核普酸的消耗将越发大。 因此，将会更快的发现测得的电流变化。相反，如果核酸浓度较低，观察 到电流的变化则需要较长的时间。因此，所述发明可以应用于对把序列的 定量测定。
因此，在实践中，将施加电场并测量由此产生的电流(例如在零时间点)， 然后定期地进行测量，以便记录电流在整个扩增过程中的降低。可选择地， 在经过一段确定的时间之后记录电流。
事实上，从因果关系上看，具有鸟。票呤残基的游离核苷酸的浓度在扩 增开始前为最大值，因而，能够通过样品的电流也为最大值。随后，将扩 增期间的或扩增后的电流测量结果，与在扩增过程中已实施的测量结果相 比较，可以评估出差异。如果在这些测量的过程中，观察到电流的显著降 低，这意味着具有鸟嘌呤残基的游离核苷酸已被消耗，由此可知样品中确 实存在具有靶序列的核酸。在详述部分中，将更详细地说明在作出靶序列 存在的结论之前，还要进行哪些进一步的验证工作。
此外，该电流是在预先设定的时间内施加对同 一扩增而言相对恒定的 电场之后测量的。这是因为，在施加电场的时刻与由此通过样品的电流处 于最大值的时刻之间，有一个瞬时期，在此期间样品中存在的离子化化学 物种的运动性将增加到最大。因此，为了提供最大的灵敏度，优选在电流 处于最大值时(即经过一段预先设定的时间后)对其加以测量，对此在下文将 具体说明。无论在什么情况下，电流的测量都是通过已知的电化学技术来 进行的，所述电化学技术是电势扫描伏安法型，可以是线性伏安法、循环
伏安法、或脉沖扫描伏安法；或者是电势阶跃型，如计时电流分析法。
此外，优选地，将所述电场施加于适合浸入所述样品中的电极之间。 例如，将电场施加到一个基于金属氧化物、或基于碳、或基于贵金属的电 极，与一个参考电极之间，二者都浸没在样品中，注意在同一次扩增的每 次电流测量中确保电极有恒定的活性表面，以确保电流的变化是由电荷载体的减少而非表面的变化所导致的。可以选择例如用金或铂等贵金属制成 的电才及。
根据本发明的另 一 个特别有利的实施方案，将所述氧化剂限制于其中 一个所述电极的表面上，这可以利用施加于电才及上的、将氧化剂精确地加
以封禁(trap)的凝胶、膜(membrane)或薄膜(film)来实现；或者通过将偶联 有氧化剂的聚合物整个吸附或接枝(grafted )到其中 一个电极的表面上来实现。
根据另 一个方面，本发明提出了 一种用于靶核酸序列电化学检测的组 件，所述组件包含用于容纳可能含至少一种核酸的生物学样品的装置，所 述核酸可包含给定的耙序列，所述生物学样品与氧化剂混合，所述靶序列 包含能够被所述氧化剂氧化的核苷酸碱基；能够偶联所述给定的靶序列的 互补装置；用于向所述样品施加电场的装置，所述电场能够引起所述氧化 剂与所述核苷酸石威基的反应，以及测量通过所述样品的电流以确定所述靶 序列的存在的装置；根据本发明，所述互补装置包含适合于复制所述靶序 列的可活化扩增装置，所述扩增装置包含至少这样的核苷酸，所述核苷酸 属于包含所述核苷酸碱基的类型，其中所述类型的所述核苷酸能够在复制 中被消耗从而构成复制的核酸；并且，如果所述核酸含有所述给定的靶序 列，则当活化所述扩增装置时，所述测量装置给出逐渐降低的电流值。
参照附图阅读下文以非限定性说明的方式给出的本发明具体实施方 案，将明了本发明的其他特点和优点。在附图中
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图1:示意性显示在实施本发明方法过程中发生的化学和电化学反应 的反应图解；
-图2:根据本发明第一个实施方案的本发明方法的第一个组件的示意
-图3根据本发明第二个实施方案的本发明方法的第二个组件的示意
-图4电流变化的曲线与所施加的电位的函数关系的图，该图说明本发 明的方法；
-图5表示电流的降低作为扩增过程的函数的图； -图6用于实施本发明方法的第二组件的示意图； -图7表示电压测量曲线的图。根据本发明电化学检测靶核酸序列的方法，致力于将扩增核酸方法的 的实施，和电化学方法的实施结合起来，从而能够追踪某一特定化学物种 的减少，这种减少反应所述靶核酸序列的存在。这种扩增方法(下面将描述 之)是"PCR类型"，代表聚合酶链式反应。但是，也可以使用任何其他扩增
方法达到同样的效果。特別列举下面的方法"LCR，，型方法，代表连接酶链 式反应；"SDA，，，代表链置换扩增；"RCA"，代表滚环扩增；"NASBA，，代 表基于核酸序列的测定或扩增；或"HDA",代表解旋酶依赖性等温DNA扩增。
"PCR"型方法的原理在于反复地利用DNA聚合酶的一种属性，使用 组成DNA的两条互补双链和一对引物进行复制，来合成两条起始链的两条 新链拷贝；其中引物是大约20个碱基的小核酸链，能够借助碱基互补性与 各自要复制的DNA链特异杂交。当然，引物是根据要在核酸上找出的靶序
列而选择的。
除了 DNA聚合酶一一它们使得在引物结合到链上后，从该引物合成互 补链成为可能——之外，还要提供核苷酸，具体地说是组成DNA的四种核 苦酸dGTP、 dATP、 dTTP和dCTP (分别为脱氧鸟嘌呤三磷酸，脱氧腺嘌呤 三磷酸，脱氧胸腺嗜啶三磷酸和脱氧胞嘧啶三磷酸)，聚合酶将它们组装以 形成复制的互补链。
而且，反应基质——其中加入了可能含有靶核酸序列的检测样品、DNA 聚合酶、引物及四种核苷酸，形成反应混合物——当然是液态的并被緩冲 的。此外，根据该方法，在同一循环的整个过程中，该反应混合物将交替 地承受温度变化，这些温度变化对应于不同阶段核酸的变性、杂交、延 伸。常^见地，反应混合物可以连续地经历大约30个循环。
此外，作为本发明的一个主题，将上面已经描述过原理的扩增方法与 电化学装置偶联起来，用于在扩增循环过程中，在适当的时候，显示四种 核苷酸中 一种的消失，属于四种类型中 一种的所述核苷酸通过DNA聚合酶 的作用纟参入互补DNA链。
为做到这一点，使用氧化剂[尤其是钌络合物，例如三(2,2，-二吡啶基) 钌(II)]，氧化剂在它的氧化态能够氧化含有鸟嘌呤的核苷酸上的鸟嘌呤 dGTP。当然，任何其他的能够氧化鸟嘌呤的氧化剂都可以使用，例如IrC1,。 如图1所示，电极10浸没在液态反应基质12中，氧化剂4参入上述反应混合物中，当对该混合物施加电场时，氧化剂首先从其还原态14变化为氧化
态16,如箭头F,给出一个电子到电极IO。此外，在它的氧化态形式16， 氧化剂能够接着氧化正好具有一个鸟噪呤残基的核苷酸18的一个鸟噪呤， 其中所述核苷酸18或者是游离的，或者插入核酸中。如箭头R,在氧化该 鸟嘌呤时，氧化剂同时被还原，而确定地被氧化的鸟噤呤再不参与反应。 在电极上测得的电流，即电子流，实质上是由于含有一个鸟噤呤残基的游 离核苦酸的氧化而来的电流，而基本上不是由于插入到DNA链中的核香酸 引起的。扩散系数的差异可能是一种解释，那些含有鸟噤呤残基的游离核 苷酸与那些含有掺入核酸中的鸟。票呤残基的核苷酸之间鸟。票呤氧化动力学 的差异也可能是一种解释。
因此，如果在扩增循环期间中，包含鸟。票呤的核芬酸以与其他核苦酸 同样的程度被消耗，来合成复制的核酸(从统计学上说其包含的上述四类核 苷酸中每一类的数目几乎是相同的)，电子流自身也将相应降低，从而电极 上测得的电流也将相应降低。
为了说明本发明的方法，在下文中将描述一个示例性的实施方案。
图2显示根据第一个实施方案的管30,它可安装在热循环仪32中，热 循环仪32可以使管30达到预设的各个温度，这些温度代表根据"PCR"型扩 增方法的各个步骤。常规地，在循环的第一个步骤，将管在94。C加热数秒 以使核酸变性，在此处核酸为DNA。接着，在历时约一分钟的第二步中， 将温度迅速降低到58。C以使引物杂交。然后，将管升温至72°C也保持一 分钟，活化DNA聚合酶，以使互补链延伸。接着，开始新的一轮循环。
反应混合物34在管30的沉淀36中，引入管30的两个电极38、 40浸 没在反应混合物34中。其中的一个电极，38,是例如碳电极，而另一个电 极40是参比电极。这些电极38、 40各自连接于恒电位器42,这样可以根 据给定的曲线变更两电极之间的电位，同时记录通过它们的电流。
根据第二个实施方案(在图3中再现了其中主要的部件)，扩增方法在全 部方面均与上述的方法相同。然而，测量不再在扩增期间进行，而是在扩 增结束时进行。此处，没有将电极直接引入管30，而是将反应混合物34本 身引入一个或多个微量容器44，如在图3中所示。将这些微量容器44无漏 密封在"集成电路，，型的板46上，该板上面丝网印刷了电极48、 50。这些电 极48、 50各自有一个活性端52、 54，它们位于微量容器44的底部并分別向着接触端56、 58伸出。用与上面提到的第一个实施方案相同的方式，接
触端56、 58能够连接到恒电位器上以将电场施加于微量容器44中的反应 混合物。
要注意的是这些微量容器44同样适合于上面提到的"NASBA"、 "RCA,, 或"HDA"类型的扩增方法。
应用实例1
在下文中将详细描述所述方法的 一个应用实例，用于检测生物学样品 中巨细胞病毒(CMV)的存在。该病毒的基因组具有明确鉴定的由406个碱基 对组成的序列，使用两个允许特异扩增该序列的商业引物AC1和AC2 (Argene公司索引60-003和60-004 )。反应混合物的全部体积等于50|il, 含有浓度为0.8 |amol/l的两种引物，100 pmol/1浓度的四种核苷酸，每nl0.02 单位的浓度的聚合酶，20(imol/l浓度的钌络合物，以及十倍稀释的10X緩 冲液。当然，反应混合物含有的生物学样品，在此处为4参入了巨细胞病毒 的细胞提取物。
电化学测量使用恒电位器42,应用伏安法技术，在两个电极38、 40 或52、 54之间施加电位变化，例如，从相对于甘汞电极0.5V的初始电位， 升至1.3V (相对于同一甘汞电极)的终末电位，扫描速率可在每秒O.Ol到 IOOV之间。同时，在电位扫描期间记录由此产生的电流。
参考图4,其中两条伏安测量曲线通过恒电位器以0.1 V.s-'的速率记录， 作为施加于上述电极间的电位差的函数，在此表示为电流密度。第一条曲 线60代表根据上面提到的实验在第二个扩增循环所测得的电流变化。生物 学样品初始含有100, 000拷贝的靶序列。该曲线到达第一个极值62,约 68 nA/cm2,第二条曲线64代表根据上面提到的实验在第三十个扩增循环所 测得的电流变化。该曲线到达第一个极值66,约56 ^A/cm2。该极值66比 第一个极值62低约12 ^A/cm2。
此外，预先明确地证实，用上面提到的扩增装置对不含巨细胞病毒的 生物学样品实施上面提到的方案的两个步骤，结果获得两条基本相同的曲
线。因此，当病毒不存在于生物学样品中时，则不发生扩增。
因此，比较两条曲线60、 64显然可见，在30个扩增循环后，电流强 度相对于其扩增前的初始值有所下降。因而，纟艮显然生物学样品的核酸中巨细胞病毒的存在被相应引物AC1和AC2所识别，明显地发生了互补链的
延伸，同时消耗核苷酸，尤其是dGTP型的含有鸟噤呤残基的核苷酸，因为
钌络合物氧化剂只能够氧化这种核苷酸的碱基。此时，电流的测量值，实
质上就是对应于钌络合物的还原，同时对应于含有dGTP的鸟嘌呤核苷酸的 氧化的电子流的测量结果。因此，当后者核苷酸部分消失时(由于它们掺入 到互补核酸中)，它们游离态的量降低，并且随之由此产生的氧化电流也降低。
进一步，现在参考图5中所示的图，对在给定样品中对核酸靶序列定 量的原理进行说明。
沿图x轴80是复制的循环数目，沿y轴82呈现的是根据图2所述实 施方案在给定的电位下每个循环所记泉的电流经标准化后的值。这些标准 化的电流值对应于电流测量值除以扩增开始前进行的电流测量的测量值。
所示的5条曲线84、 86、 88、 90、 92，代表分别从含有下列拷贝数 的CMV靶序列的生物学样品开始而作得的曲线0拷贝的CMV靶序列， 84; 1,000拷贝的所述靶序列，86; 10,000拷贝的所述靶序列，88; 100,000 拷贝的所述靶序列，90;以及1 ，000,000拷贝的所述靶序列，92 。
因此，应注意的是，在生物学样品中包含靶序列的核酸的含量越高， 通过样品的电流作为循环数目函数的降低就越迅速。这是因为，在样品中 最初时包含靶序列的核酸的含量越高，复制就会越多地消耗dGTP类型的核 苷酸，因此，电流就越早作为循环数目的函数而下降。这样可以理解，有 可能通过确定通过样品的电流的量开始变向(infl&hir)时的循环数，来测量 掺入耙序列的核酸的量。此外，该图5还显示，即使初始存在于样品中的 靶序列只有1，000个拷贝，所述靶序列的存在仍是可以检测到的。
因此，对可能含有经鉴定的病毒的生物学样品应用根据本发明的方法， 不仅可以通过实施扩增方法以及电化学测量来显示所述病毒的存在与否， 还可以对其加以定量。因此，相比于待才全材料制备复杂的先前技术所用方 法，根据本发明，只需要进行常规的扩增方法，然后在扩增期间，使生物 学样品—接触电场并测量由此产生的电流。该方法使用常M4广增方法绝不4吏
用的氧化剂来显示某一种类(在此处是在含有鸟嘌呤残基或与鸟嘌呤相同功 能的化合物的核苷酸类型)的消失。此外，氧化剂的选择将依赖于希望测量 其消失的核苷酸类型的性质。上文的示例性实施方案涉及双链核酸，即DNA分子。然而，通过使用
合适的扩增装置，其绝对能够应用于RNA或DNA类型的单链核酸。在这 两种情况中，这些核酸的扩增导致含有鸟噪呤的核苦酸的消耗，从而导致 基质中随着扩增过程的发生该种化合物减少。
因此，本发明主题的方法的任何实施方案，无论是上文所述支持图2 的第一种方法，或由参考图3所描述的第二种方法，都通过实施贯穿扩增 全过程的测量来评估电流值发生显著降低的时刻。这样可以不仅揭示靶 DNA序列的存在，还能间接推出包含待测靶序列的核酸的初始浓度。这是 因为，包含耙序列的核酸的初始拷贝数目越高，电流将越早降低，相反地， 拷贝数目越低，将越晚观察到电流的降低。
而且，根据在图6中表示的另一方面，本发明还涉及特别适合于电化 学检测耙核酸序列的组件(collection )。该组件包含至少一个如图3所示的 微量容器94，用于容纳生物学样品95，但是此情况下其装备有热绝缘。该 微量容器94底部具有丝网印刷的电极96，所述电极连接到恒电位器P。而 且，该微量容器94置于两个Peltier-effect模块98、 100之间，所述模块通 过适于调节微量容器94内部温度的发电机连接。以这种方式，可以使生物 学样品95的温度突变(according to abrupt variations)到最高达94°C的范围内 的温度，就像上面提到的PCR类型的方法一样。此外，将可活化的扩增材 料，尤其是含有可氧化的核苷酸碱基的核苷酸，添加到生物学样品中。
因此，图6中示出的可由计算机控制的组件，适合于自动地提供"靶 序列确实包含在置于微量容器94中的样品中，，的信息，并且，如果确实如 此，还可以提供包含该靶序列的核酸的浓度的信息。
因此计算机加载有计算机程序，该程序能够根据预先确定的循环同时 运行复制装置(即Peltier-effect模块98、 100)并在循环之间运行恒电位器， 以测量给定的电位值条件下通过样品95的电流量。
此外，当使用扩增装置时，对所述电极的表面条件进行修饰。而且， 进行扩增循环时，反应混合物的溶剂(在此处为水)在所施加的温度易于蒸 发。溶剂的任何蒸发就本身而言均会导致溶质浓度的升高。
因此，电流的测量值(其与消耗的核苷酸碱基的浓度成比例)可能并不完
全与扩增的核酸的量相关。
因此，由此带来的潜在问题是，如何能够克服电极干扰和溶剂蒸发。要做到这一点，根据本发明的另一个特别有利的实施方案，检测方法
还包含下面步骤提供氧化还原化合物，其能够在移位(shifted)的电场值条 件下反应，该移位的电场值与所述氧化剂和所述核苷酸碱基反应时的电场 值不同；测量在所述移位的电场下的氧化还原电流值；如果当所述扩增装 置被活化时，氧化还原电流和所述氧化剂与所述核苷酸碱基反应的电流之 间的电流差异有所减少，则证实所述给定的靶序列的存在。
因此，通过选择氧化还原化合物，或内标，例如二茂铁，紫罗碱或锇 络合物(其氧化电位相对于所述氧化剂和所述核苷酸碱基的氧化电位已移
位，例如800mV)，氧化还原化合物的氧化不会干扰对氧化剂和石咸基的氧化 电流的测量。此外，该氧化剂不会干扰可活化扩增装置。
根据与该实施方案一致的第一个实施方案(可参考图7),在同一实验中 对单独样品进行电流测量值的标准化。
因此，在这样的反应混合物中使用样品，所述反应混合物除了下述几 点之外与上面提到的应用实例的反应混合物是相同的以50)aM的浓度掺入 二茂铁曱醇，并且在两个电极间施加电位变化，从50mV开始到1300mV 终止。因此在图7中呈现的伏安测量曲线是对第一个扩增循环获得的。
这条曲线不再具有单一极值，而是有两个极值。第一个极值210位于 相对于饱和甘汞电极1100mV左右，与在图4所示的曲线的极值相应，第二 个极值220位于200mV左右，与二茂铁曱醇的氧化相应。第一个极值是由 氧化剂钌络合物的氧化所导致的，相应的电流测量值是约32pA，而第二个 极值是由氧化还原化合物的氧化所导致的，约2|iA。
在电位在50mV与1300mV之间电位扫描同时记录电流强度之后，将 相应于第一个极值210的电流的值(在图7所示的实施例中是32pA)除以相 应于第二个极值220的电流的值2)LiA,而使相对于第一个极值210的电流 标准化，从而得出16。
接下来，对于所述实验的所有扩增循环都实施同样的程序。这样，两 个极值210、 220的强度值之差的变化的测量值，仅仅因于核苦S臾碱基(此处 为dGTPs)浓度的降低，使得克服实验条件成为可能。
因此，根据第二个实施方案，分别向一系列如图3中所示类型的微量 容器引入一系列样品，对这些样品实施同样的程序，来实施一系列实验。 有利的是，这些生物学样品来自同一来源，这里，问题是确证给定耙序列的存在。因此，对于每一个实验，通过将相应于氧化剂氧化的强度值分別 标准化，则它们互相之间是可比较的，因为它们与电极的体积和表面条件 的变化无关。
因此，根据本发明的这一另外的实施方案，核苷酸真实消耗的检测得 到了改善，从而可以在进行少数扩增循环之后做出靶序列存在的结论。因 此，减少了确i貪所需的时间。
此外，如上面提到的第二个实施方案所表明的，可以不考虑操作条件 来进行测量值的比较。
应用实例2
此外，根据本发明的检测方法不仅适用于病毒，同时也适用于细菌。 因此，可以利用来检测细菌的存在，尤其是氧化木糖无色杆菌
(爿c/zramo6ac/er x少/oso;aWa似)，它的可动遗传因子，更具体地"i兌是整合子， 对于抗生素抗性基因的获得起着关键作用。
因此，鉴定了该细菌菌抹的三个特征性DNA片段，并且通过PCR型 方法加以扩增。实施本发明的方法，使得通过鉴定含有约900个碱基对的 第一基因'^6-/"来检测上面提到的细菌的存在成为可能。该基因编码beta 内酰胺酶，这种酶赋予对各种抗生素，尤其是对阿莫西林和替卡西林的高 水平抗性。可活化扩增装置包括四种核苷酸、DNA聚合酶及一对该基因特 异性的引物"VEB-F"和"VEB-R"，将它们掺入到包含所述细菌的生物学样品 中。
由此观察到的伏安图(voltamogram)与图4所示的相似。根据实验条件， 相应于扩增开始前的电流测量值的第一条曲线，在电位值约1.075 V处表现 出一个大约6pA的极值。在扩增后产生的第二条曲线表现出降低了约1 的极值。因此，电流的降低是扩增期间核苷酸的消耗，进一步说，是'VA-尸' 基因的有效存在的结果。
以同样的方式鉴定并检测到了上面提到的细菌的第二个特征性片段， 100个碱基对的"/w/尸基因。
所述细菌的第三个2500个碱基对的特征性片段，也可以用类似的方式 检测到。该第三个片段的核苷酸序列相应于所述整合子的含有所有表达框 的可变区，包括"^6-/"基因。因此，作为本发明主题的方法可以应用于通过不同方案，利用不同的 可活化扩增装置或生物学试剂盒，扩增不同大小的遗传材料片段。
权利要求
1. 一种电化学检测靶核酸序列的方法，所述方法是这样类型的方法，根据该类型-提供可能含有至少一种核酸的生物学样品，所述核酸能够包含给定的靶序列，所述生物学样品与氧化剂相混合，所述靶序列包含至少一种能够被所述氧化剂氧化的核苷酸碱基；-提供能够与所述给定靶序列偶联的互补装置；-对所述样品施加电场，所述电场能够引起所述氧化剂与所述核苷酸碱基的反应，并且测量通过所述样品的电流以确定所述靶序列的存在；其特征在于，所述互补装置包含适合于复制所述靶序列的可活化扩增装置，所述扩增装置至少包含属于含有所述核苷酸碱基的类型的核苷酸，其中所述类型的所述核苷酸能够在复制期间被消耗而构成复制的核酸；还在于，依次-将所述生物学样品和所述氧化剂与所述可活化扩增装置相混合；和-活化所述可活化扩增装置，以便如果电流降低，则确定所述给定的靶序列的存在。
2. 权利要求1中要求的检测方法，其特征在于所述核酸是DNA或RNA 分子。
3. 权利要求1或2中要求的检测方法，其特征在于所述核苷酸碱基是 嘌呤含氮碱基。
4. 权利要求3要求的检测方法，其特征在于所述核苷酸碱基是鸟嘌呤 或鸟噤呤化学类似物。
5. 权利要求1至4中任一所要求的检测方法，其特征在于所述氧化剂 是钌络合物。
6. 权利要求1至5中任一所要求的检测方法，其特征在于，由于所述 靶序列随时间而#皮复制，在施加给定时间的所述电场之后测量所述电流。
7. 权利要求1至6中任一所要求的检测方法，其特征在于所述靶序列 根据扩增循环而被复制，还在于在给定数目的循环之后测量所述电流。
8. 权利要求1至7中任一所要求的检测方法，其特征在于将所述电场 施加于适合浸入所述样品的电极之间。
9. 权利要求8中要求的检测方法，其特征在于所述电极之一是基于金属氧化物的电极。
10. 权利要求8中要求的检测方法，其特征在于所述电极之一是基于 贵金属的电极。
11. 权利要求8中要求的检测方法，其特征在于所述电极之一是碳电极。
12. 权利要求8至11中任一项所要求的检测方法，其特征在于将所述 氧化剂限制于所述电极之一的表面。
13. 权利要求1至12中任一项所要求的检测方法，其特征在于其还包 含下列步骤-还提供氧化还原化合物，其能够在移位的电场值发生反应，所述电场值不同于所述氧化剂与所述核苷酸碱基反应的电场值；-测量所述移位的电场值条件下的氧化还原电流值；和-如果当所述扩增装置被活化时，氧化还原电流和所述氧化剂与所述核芬酸碱基反应的电流之间的电流差有所减少，则确定所述给定的靶序列的存在。
14. 用于靶核酸序列的电化学检测的组件，所述组件包含 -用于容纳可能包含至少一种核酸的生物学样品(34, 95)的装置(30, 44,94)，所述核酸能够包含给定的靶序列，所述生物学样品与氧化剂混合，所 述靶序列包含至少一种能够被所述氧化剂氧化的核苷酸碱基； -能够与所述给定靶序列偶联的互补装置；-用于向所述样品施加电场的装置(38, 42， 52, 54， 96),所述电场能够引 起所述氧化剂与所述核苷酸^威基的反应，以及用于测量通过所述样品电流 以确定所述靶序列之存在的装置(42, P);其特征在于所述互补装置包含适合于复制所述靶序列的可活化扩增 装置，所述扩增装置至少包含属于含有所述核苷酸碱基的类型的核苷酸， 其中所述类型的所述核苷酸能够在复制期间被消耗从而构成复制的核酸；并且在于如果所述核酸包含所述给定的靶序列，所述测量装置(42,P) 在所述扩增装置被活化时给出递减的电流值。
全文摘要
本发明涉及用于靶核酸序列的电化学检测的方法和组件。根据该方法，提供可能包含核酸的生物学样品，所述核酸能够包含靶序列，所述生物学样品与氧化剂混合，所述靶序列至少包含一个能够被所述氧化剂所氧化的核苷酸碱基；提供能够与所述靶序列偶连的互补装置；根据本发明，所述互补装置包括适合复制所述靶序列的可活化的扩增装置，所述扩增装置至少包括包含所述核苷酸碱基的核苷酸，其中所述核苷酸能够在扩增在复制期间被消耗从而构成复制的核酸；通过对所述样品施加电场并且记录电流的降低从而确定所述靶序列的存在。
文档编号C12Q1/68GK101437961SQ200780015917
公开日2009年5月20日 申请日期2007年3月2日 优先权日2006年3月3日
发明者缪里尔·德奎尔, 贝努瓦·利莫格斯, 达米恩·马查尔 申请人:巴黎大学迪德罗特第七分校;勃艮第大学