专利名称：：转基因作物的抗性治理策略的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在抗害虫作物的田地中治理抗性的方法。
背景技术：
：昆虫、线虫和相关的节肢动物每年在美国估计破坏15%的农作物，而在发展中国家破坏的比例更高。单单在美国，这些害虫每年造成的作物损害就超过1000亿美元。另外，与杂草及寄生性和腐生性植物的竟争也造成更多的潜在产量损失。这种损害有些是当植物病原体、昆虫和其他此类土传害虫(soilbornepest)在种子种植后攻击种子时在土壤中发生的。例如在玉米的生产中，大部分的损害是由根虫(rootworm)(啃食或以别的方式损害植物的根的害虫)和由切根虫(cutworm)、欧洲玉米螟和其他啃食或损害植物的地上部分的害虫造成的。有关害虫攻击农作物的类型和机制的一4殳描述例如在以下文献中4是供Metcalf(1962),Z)eWrwcrive朋d"e/w//""cte,4thed.(McGraw-HillBookCo"NY)和Agrios(1988)，尸/aw/尸涵o/oW,3ded.(AcademicPress,NY)。在与害虫进行的季节性斗争中，农场主们必须施用几十亿加仑的合成杀虫剂来抗击这些害虫。但是，合成杀虫剂会造成许多问题。它们昂贵，单单美国农场主每年就差不多花掉80亿美元。它们促使抗杀虫剂害虫的出现，而且它们会损害环境。由于关注到杀虫剂对公众健康和环境健全的影响，人们已作出了极大的努力来寻找減少化学杀虫剂使用量的方法。最近，这个努力在很大程度上集中在开发经工程改造能表达衍自微生物的昆虫毒物的转基因作物。例如，Estruch等人的5,877,012号美国专利公开了将来自诸如芽孢杆菌属(万""'〃w》、假单胞杆菌属CPsei^o/wowa力、棒形杆菌属(C/aw力a"w)和根瘤菌属(i/^o&'wm)的微生物的蛋白质克隆到植物中并在植物中表达，以获得对诸如小地老虎(blackcutworm)、行军虫、几种钻心虫(borer)的害虫和其他昆虫害虫有抗性的转基因植物。Privalle等人的PCT出版物WO/EP97/07089教导了用编码过氧化物酶的重组DNA序列转化单子叶植物如玉米，以保护植物免遭玉米螟、穗虫(earworm)和切根虫的啃食。Jansens等人(1997)O叩S"'.，37(5):1616-1624报道了含有编码苏云金杆菌(Sac"/us//mn'wgz'e朋&,份)结晶蛋白的基因的转基因玉米的产生，该玉米控制了两代的欧洲玉米螟(ECB)。Koziel等人的5,625,136号和5，859，336号美国专利报道说，用来自Bt的5-内毒素编码基因转化玉米产生了ECB抗性得到改进的转基因玉米。ArmstrongWa/.,inCrapScience,35(2):550-557(1995)提供了表达Bt杀昆虫蛋白的转基因玉米的田地试验综合报告。对环境友好的害虫控制方法是使用衍自Bt这种土壤细菌的杀虫晶体蛋白，这种蛋白常称为"Cry蛋白"或"Cry肽"。Cry蛋白是球状蛋白质分子，在Bt孢子形成阶段的后期以结晶形式作为前毒素(protoxin)积累。晶体被害虫吞食后，在幼虫的碱性中肠环境中溶解释放出前毒素。前毒素(~130kDa)被肠道蛋白酶转化成毒性片段(66kDaN末端区域)。许多这些蛋白质对特定的目标昆虫毒性很大，但对植物和其他非目标生物无害。已使一些Cry蛋白在作物中进行重组表达，以提供抗害虫转基因植物。在这些植物当中，Bt转基因棉花和玉米已得到广泛种植。有很多Cry蛋白已得到分离、表征和根据氨基酸序列同源性进4亍了分类(Crickmore"a/.,1998，i\^cro&o/.Afo/.历o/.iev.，62:807-813)。这个分类方案为新发现的Cry蛋白的命名和归类提供了系统性机制。Cryl分类法是已知最好的分类法，包含的cry基因数目最多，目前总数超过130个。西方玉米根虫(WCRW)会在大豆中产卵，也可能会在其他的作物产地中产卵，其有一种生物型(biotype)目前能够给第一年玉米(不计划在其后种才直玉米(systematicallyfollowedcorn)的玉米)造成重大伤害。这个生物型常称为第一年玉米根虫或抗轮作(rotation-resistant)玉米根虫。当根虫卵保留在土壤中超过一年时，第一年玉米也可能易受根虫伤害。在这个情况中，产在土地中的卵在随后一年中保持休眠，然后在第二年孵化，此时玉米可能在两年轮作周期中再被种才直。这种才艮虫活动性^皮称为长期滞育(extendeddiapause),通常涉及北方玉米根虫(NCRW)，特别是美国玉米带(ComBdt)的西北部地区的北方玉米才艮虫。此外，包括美国在内的大多数国家在将转基因作物商业化时要求执行昆虫抗性治理(IRM)计划，以使抗性害虫的发展减至最低，从而延长已知的生物杀虫剂的有用寿命。IRM计划的一个最普通的组成是这样的庇护区(refUge)，其中在给定的作物中，所种植的种子有80%可含有能杀死目标害虫(如WCRW)的转基因事件，但20%的种子必须不含对该目标害虫有活性的转基因事件。这种庇护区策略的目的是防止目标害虫发展对转基因作物产生的特定生物杀虫剂的抗性。由于在80%转基因区域中达到成熟的目标昆虫很可能会携带针对该处所用的生物杀虫剂的抗性基因，该庇护区能让对转基因种子中所用的生物杀虫剂没有抗性的成体WCRW昆虫发育。结果，非抗性昆虫与抗性昆虫交配，并且由于抗性基因通常是隐性的，非抗性昆虫使得下一代昆虫中的大部分抗性被消除。这个庇护区策略的问题是，为了产生易感昆虫，所种植的作物中有一些必须对害虫易感，从而会降低产量。如上所述，一个关注的问题是会出现抗性ECB、WCRW或其他害虫。对抗性的发展进行反击的一个策略是，选择表达高水平杀昆虫蛋白的重组玉米事件，使得害虫咬转基因玉米植林一口或几口就会造成该害虫至少完全停止啃食，并随后发生死亡，即使该害虫对于抗性性状是杂合的(即该害虫是抗性害虫与非抗性害虫交配的结果)。另一个策略是，在同一植物中或在接近的植物中，以重组事件的形式并入第二ECB或WCRW特异性杀昆虫蛋白，例如另一Cry蛋白或者别的杀昆虫蛋白如重组酰基脂质水解酶或其杀昆虫变体。参见例如WO01/49834。优选地，第二毒素或毒素复合物会具有与第一毒素不同的作用方式，且优选地，如果受体参与到昆虫对重组蛋白的毒性的话，同一植物或接近的植物中的两种或多种杀昆虫蛋白的每一种的受体会互不相同，使得如果某个受体发生功能变化或某个受体发生功能损失而造成对特定杀昆虫蛋白的抗性的话，那么该功能变化或功能损失不应且可能不会影响其余的毒素的杀昆虫活性，所述其余的毒素会被证实能结合与该造成克隆到植物中的两种杀昆虫蛋白之一的功能损失的受体不同的受体。因此，一个或多个第一转基因和一个或多个第二转基因优选对同一目标昆虫有杀虫作用，和无竟争地结合目标昆虫的肠膜中的不同结合位点。又一个策略是将化学杀虫剂与在转基因植物中表达的杀虫蛋白结合。这可以想到的做法是，用化学杀虫剂对重组种子进行处理，使得杀虫控制量的化学杀虫剂扩散到根部周围的区域，从而保护根部组织免受目标害虫侵扰，只要化学杀虫剂持续或根組织保持在分散到土壤中的杀虫剂的区域当中。杀虫剂常规应用形式的另一替代方案是用杀虫剂处理植物种子。使用杀真菌剂或杀线虫剂来保护种子、幼根和苗在种植和发芽后免受攻击，和使用低水平的杀虫剂来保护例如玉米种子免受线虫影响，这些用法已使用了相当长时间。用杀虫剂处理种子的优点是，在提供对种子的保护的同时，又使所需的杀虫剂量减至最低，和减少与杀虫剂的接触量和为达到在田地控制害虫所需的不同田地应用的次数。通过将杀昆虫剂直接应用到植物种子来控制害虫的其他实例在例如5,696,144号美国专利中提供，该专利公开说，用1-芳基吡唑化合物以500g/公担(quintal)种子的比例处理种子，从中生长的玉米植抹所遭受的ECB啃食损害比从未经处理的种子生长的对照植抹少。另外，Tumblad等人的5,876,739号美国专利(及其母专利5，849，320号美国专利)公开了控制土传昆虫的方法，所述方法涉及用含有一种或多种多聚体粘合剂和某种杀昆虫剂的涂料处理种子。这个参考文献提供了它确认为可用于这个涂料的候选杀昆虫剂的杀昆虫剂列表，还有多种潜在目标昆虫的名称。虽然植物遗传工程的最新进展已改进了不用化学杀虫剂就能保护植物免受害虫侵扰的能力，而且虽然诸如用杀虫剂处理种子的技术已减少了杀虫剂对环境的有害影响，但仍有很多问题限制着这些方法在实际田地条件下的成功应用。昆虫^L'I"生治J里(insectresistancemanagement,IRM)这个术i吾用来描述旨在减少昆虫害虫变成对杀虫剂有抗性的潜在可能的各种措施。BtIRM的保持是非常重要的，因为昆虫抗性会对掺入植物的Bt保护剂(Btpant-incorporatedprotectant)和作为一个整体的Bt4支术的未来使用造成威胁。特定的IRM策略如高剂量/结构化(highdose/structured)庇护区策略，能减轻昆虫对玉米、棉花和马铃薯中产生的特定Bt蛋白的抗性。但是，这些策略会导致要让一部分作物保持对一种或多种害虫易感，以确保有非抗性昆虫发育而可供与在受保护作物中产生的任何抗性害虫交配。因此，从农场主/生产商的观点出发，非常需要的是，具有尽可能小的庇护区，而又能治理昆虫抗性，使得在获得最大产量的同时，仍保持所用的害虫控制方法的功效，无论所用的方法是Bt、化学杀虫剂、某种其他方法或者它们的组合。目前最常用的IRM策略是高剂量和庇护区的种植(庇护区是总种植面积中用非Bt种子种植的那部分面积)，因为通常认为这会通过保持昆虫易感性而延迟昆虫发展对Bt作物的抗性。高剂量/庇护区策略假定认为，对Bt的抗性是隐性的，且由具有导致以下三个基因型的两个等位基因的单一基因座赋予易感纯合体(SS)、杂合体(RS)和抗性純合体(RR)。它还假定认为，会有低的初始抗性等位基因频率，和抗性成虫和易感成虫之间会有广泛的随机交配。在理想的情形下，只有稀少的RR个体能幸免于Bt作物所产生的高剂量。SS个体和RS个体都将易感Bt毒素。结构化庇护区是种植者田地中的非Bt区域，或者允许产生易感(SS)昆虫的一批田地，该易感昆虫可与幸免于Bt作物的稀少抗性(RR)昆虫进行随机交配，产生会被Bt作物杀死的易感RS杂合体。这会将抗性(R)等位基因从昆虫群体清除，延迟抗性的进展。MON810、BT11和TC1507是目前可供使用的据认为是对ECB"高剂量"的产品。高剂量/庇护区策略是目前优选的IRM策略。非高剂量策略目前是通过增加庇护区面积在IRM策略中使用。增加庇护区是因为高剂量的缺乏会让部分抗性的昆虫(即具有一个抗性等位基因的杂合昆虫)存活，从而增加抗性基因在昆虫群体中的频率。由于这个原因，许多IRM研究者和专家小组已一致认为，非高剂量Bt表达与高剂量表达相比会呈现很大的抗性风险(Roush1994,Gould1998,Onstad&Gould1998,SAP1998，ILSI1998，UCS1998,SAP2001)。但是，这种非高剂量策略通常对于农场主是不可接受的，因为庇护区面积越大，导致的产量损失越多。目前认为，庇护区的面积、位置和治理对于高剂量/结构化庇护区策略成功减少昆虫对玉米、棉花和马铃薯中产生的Bt蛋白的抗性是至关重要。通常要求结构化庇护区包括目标害虫的所有合适的非Bt宿主植物，这些植物由人进行种植和治理。可种植这些庇护区，以在害虫可接触到Bt作物的同时提供庇护区，或者在害虫不可接触到Bt作物的时候提供庇护区。这些类型的庇护区存在的问题包括要确保每个农场主都遵守要求。由于庇护区种植区域中的产量下降，一些农场主选择回避庇护区要求，其他人也不遵守面积和/或位置要求。这些不守要求的问题导致没有庇护区或者庇护区不够有效，相应地抗性害虫的发展增加。欧洲玉米螟(ECB)ECB是美国大部分地区的主要玉米害虫。这个害虫每年有l-4代，其中一化(即每年一代)群体出现在远北(即北达科他州全州、南达科他州北部、明尼苏达州北部和威斯康星州北部)、二化(即每年两代)群体遍布美国玉米带的大部分地区，多化(3-4代)群体出现在南部(Mason等人1996)。以下概述与IRM有关的ECB生物学关键方面幼虫移动ECB幼虫能够在玉米田地中进行明显的植林间移动。在非转基因玉米中进行的研究表明，绝大部分的幼虫的移动不会超过一行植株当中的两抹植抹(Ross&Ostlie1990)。但是，在转基因玉米中，RGould(在Onstad&Gould1998中引用)的未发表数据(用于建模工作)表明，大约98。/。的易感ECB新生幼虫离开含有Bt的植株。Hellmich最近进行的多年研究(1996、1997、1998年)试图定量幼虫植林间移动的程度。观察到，第四龄幼虫能够在一行玉米植抹当中移动越过最多达六株植株，和从释放点跨行移动越过六抹植抹。行内移动的可能性比跨行移动高的多(这并不奇怪，因为与跨行植抹相比，行内植抹更可能"互相接触，，)。事实上，绝大部分的跨行移动局限于一个植株。这类信息对于最佳庇护区设计具有明显的意义。移动越过Bt行和非Bt行的幼虫可被暴露于亚致死剂量的蛋白质，从而增加抗性的可能性(Mallet&Porter1992)。鉴于ECB幼虫在植林之间的移动程度，占优势的意见是，种子混合区(seedmixes)是较次的庇护区选择(Mallet&Porter1992,SAP1998,Onstad&Gould1998)。成虫移动需要有关成虫ECB(化蛹后羽化)的移动的信息，来确定庇护区的适当接近度的指导方针。庇护区必须设立在新羽化成虫的飞行范围内，以有助于确保随机交配的潜在可能。美国内布拉斯加州大学进行了详尽的多年期项目，以研究ECB成虫扩散情况(Hunt等人1997,1998a)。在这些标记和再捕捉研究(用新羽化的交配前成虫进行)获得的结果表明，大部分ECB成虫扩散所到之处离它们的羽化地点并不远。再捕捉的成虫的百分数非常低(<1%)，且再捕捉的成虫中大部分是在离释放地点1500英尺以内被捉到。在2000英尺以外捕捉到的蛾极少。这些结果已明确地导致得出了对庇护区接近度和布置的建议和指导方针。交配行为除了成虫移动的模式外，ECB交配行为也是确保易感蛾和潜在抗性蛾之间的随机交配的一个重要考虑因素。具体的说，重要的是确定新羽化的雌虫在哪里交配(即在羽化地点附近还是在一定的扩散之后)。已确知许多ECB利用玉米田地附近的群集地点(通常是杂草丛或草丛)进行交配。雌虫通常在蛹羽化后的第二天晚上交配(Mason等人1996)。一项最近的研究提示，可以假造群集地点，以增加易感ECB和潜在抗性ECB之间随机交配的可能性(Hellmich等人1998)。另一项由内布拉斯加州大学进行的最近研究(用新羽化ECB进行的标记/再捕捉研究)表明，移动出其羽化成为成虫的玉米田地的未交配雌虫相对较少(Hunt等人1998b)。这在灌溉的(即有吸引力的)玉米田地尤为如此。另外，在靠近释》支地点(10英尺以内)捕捉到的雌虫有相对较高的比例是交配过的。这个研究提示，雌虫交配地点非常靠近羽化地点，庇护区可能需要布置在非常靠近Bt田地的地方(或者作为田地内庇护区进行布置)，以使随机交配的可能性最大化。在雄虫交配行为方面，Showers等人(2001)进行的研究观察了雄虫扩散以探寻配偶的情况。该研究是采用标记-捕捉技术，在释放地点200、800、3200和6400m处放置以信息素为鉀的诱捕器来进行。结果显示，探寻配偶的雄虫在离释放地点200m处放置的诱捕器被诱捕的频率更高。但是，在离释放地点800m处或更远处也有很多雄虫被诱捕(Showers等人2001)。与Hunt等人的研究相似，这个研究提示庇护区可能需要布置在相对靠近Bt田地的地方，以使随才几交配最大化。产卵行为ECB产卵行为对于庇护区设计也是重要的。例如，如果在玉米田地当中进行的产卵不是随机的话，某些类型的庇护区(即田地内地带)可能不会有效。在交配后(主要在群集地点进行)，雌虫会移动寻找合适的玉米宿主进行产卵。大部分的雌虫会在靠近群集地点的玉米田地产卵，假如那里有可接受的玉米宿主的话。产卵在交配后就开始，主要在晚上进行。卵是以最多六十个卵的卵群形式产下(每晚产下一个或多个卵群)(Mason等人1996)。已知雌虫通常更喜欢长势较高和较旺盛的玉米田地来产卵(Beck1987)。这对庇护区设计具有意义。为避免产卵雌虫潜在地区分宿主，选用于庇护区的非Bt玉米杂交体应在生长、成熟、产量和治理措施(即种植日期、杂草治理和灌溉)方面与Bt杂交体相似。应指出的是，研究已证实当物候学特征和治理特征相似时，在Bt玉米和非Bt玉米(衍自同一近交系)之间的产卵偏好没有显著差异(Orr&Landis1997,Hellmich等人1999)。在适合产卵的玉米田地当中，认为产卵是随机的，并不限定于靠近群集地点的边界各行玉米(Shelton等人1986,Calvin1998)。宿主范围ECB是一种杂食性害虫，已知侵扰200多种植物。ECB植物宿主包括多种普通杂草，这使一些人想到杂草可以充当Bt玉米的ECB庇护区，这个概念常称为"非结构化庇护区"。与此相应，有很多最近的研究项目已研究了杂草作为庇护区的可能性。Hdlmich进行的研究(1996、1997、1998年)已证实，杂草能够产生ECB，不过产生的数量不定而且太不一致，因而不能作为ECB庇护区的可靠来源。美国科学顾问小组1998年IRM分小组(1998SAPSubpanelonIRM)也得出这个结论。除了杂草外，还研究了多种粮食作物(例如小麦、高粱、燕麦)作为Bt玉米ECB庇护区的潜在可能(Hellmich1996,1997,1998,Mason等人1998)。在这些研究中，小的粮食作物所产生的ECB通常比玉米(爆花玉米(popcorn)或飼料玉米(fieldcorn))少，因此认为不太可能产生足够的易感成虫昆虫而成为可接受的庇护区。因此，根据目前的技术现状，需要针对ECB的改进的IRM。玉米穗虫(CEW)和ECB—样，1998SAP确定了多个需要对CEW进行额外研究的研究区域。除了对幼虫/成虫移动、交配行为和产卵行为有更多的认识外，还需要对玉米/棉花之间的移动和长距离迁飞有更好的了解(SAP1998)。自从1998年以来，出现了有关CEW生物学的额外研究。这些资料已作为研究年报的一部分进行提交，是这种Bt作物得到商业使用许可之前所必需的注册条件。该机构已审查了这些资料并断定，额外的信息对于长期有效改进IRM策略以减轻CEW抗性将是有用的。宿主范围和玉米间移动CEW是一种杂食性昆虫(每年3-4代)，除了杂草和其他野生宿主外，还啃食多种粮食和蔬菜作物。通常认为，CEW有两代啃食野生宿主和/或玉米(第一代啃食轮生期玉米，第二代啃食抽穗期玉米)。玉米衰老后，CEW移动到其他宿主，主要是棉花，再繁殖2-3代。由于CEW在同一生长季节中利用多个宿主，它给Bt抗性治理带来了挑战，因为对Bt玉米和Bt棉花中的Bt蛋白都有两次暴露的可能(在一些地区中潜在地最多达五代暴露)。越冬行为已知CEW在蛹期过冬。虽然已知CEW在生长季节往北迁飞到玉米生长地区(即美国玉米带和加拿大)，但CEW通常不能够在这些地区越冬。相反，已知CEW在南方过冬，往往是棉花田地过冬。温度、水分和耕作措施据认为都在CEW的过冬存活中起到一定的作用(Caprio&Benedict19%)。过冬是一个重要的因素，因为IRM抗性昆虫必须熬过冬天才能将他们的抗性基因传递到后代。例如在美国玉米带，不能够过冬的CEW应该不会造成抗性威胁。鉴于可根据在哪里CEW是一个抗性威胁来开发不同的庇护区策略，准确的采样数据将有助于精确预测合适的CEW过冬地区。成虫移动和迁飞已知CEW是流动性非常高的害虫，能够进行很长距离的移动。标记/再捕捉研究已证实，CEW蛾能够扩散到0，5km(0.3英里)到160km(99英里)的距离；还记录到有些迁飞远达750km(466英里)(Caprio&Benedict1996)。迁飞的一般模式是随着盛行风型向北移动，从南方过冬地点发源的蛾移动到美国北部和加拿大的玉米生长地区。已假定认为，CEW迁飞是随着生长季节过程逐渐地向北进行。但是，FredGould博士(美国北卡罗来那州立大学)进行的观察表明，CEW还可从玉米生长地区向南移动回南方的棉花地区(在1999EPA/USDAWorkshopon说CropResistanceManagementinCotton,Memphis,TN8/26/99所作的评论中有描述)。如果这是真实的话，结果可能会是CEW再次暴露于Bt作物。另外，可能需要再回到关于CEW过冬的假定——椐认为不能够熬过冬天(从而不构成抗性威胁)的蛾可能确实向南移动到合适的过冬地点。大部分的CEW飞行移动是局部性的而不是迁飞性的。玉米夜蛾(Heliothinemoth)主要在晚上移动，羽化后的蛾飞行距离通常是不到200m的短距离(Caprio&Benedict1996)。但是，如1998SAP所指出，额外的研究将是有用的，特别是与CEW和最佳庇护区设计有关的研究。另一方面，鉴于CEW通常能进行长距离移动和Bt玉米杂交体中没有高剂量，2000SAP指出这种害虫与其他害虫(例如ECB)相比，庇护区布置显得没那么重要(SAP2001)。交配/产卵行为MichaelCaprio博士(美国密西西比州立大学昆虫学家)已指出，雌虫的交配地点明显局部化(即离蛹羽化地点600m(1969英尺)之内)，通常是与在附近羽化的雄虫或在雌虫羽化前移动进来的雄虫交配(Caprio1999)。CEW雌虫通常将卵一个一个地产在宿主上。最近的研究(在棉花田地进行)发现，从被释放的CEW雌虫找到的卵中有20%是在释放地点的50-100m(164-328英尺)之内，这表明产卵有一定的局部化。但是，雄虫被证实能够移动超过350m(1148英尺)来与雌虫交配(Caprio2000)。这些数据表明，就CEW而言，庇护区可能不必布置在Bt田地当中或者仅靠Bt田地才能有效(不过数据并不排除这些选择方案)。在交配和产卵行为方面进行的额外研究会给CEWIRM提供有用的信息。幼虫移动CEW幼虫特别是晚龄幼虫能够进行植株间移动。在SAP(1998)的推荐下，美国环保署(EPA)已取消了种子混合区作为CEW的可行Bt棉花庇护区选择方案。因此，也需要针对CEW的改进的IRM策略。西南玉米螟(SWCB)一些SWCB害虫生物学数据已作为研究年报的一部分提供给EPA,是必需的注册条件。但是，可利用的信息仍相对有限。1998SAP指出有关SWCB的信息相对缺乏，断定需要对SWCB进行必要的研究，包括短期移动、长距离迁飞、相对于移动的交配行为(即交配是在迁飞前进行还是在迁飞后进行)。由于这一点，在目前的技术现状下，不知道针对ECB(另一种玉米螟害虫)设计的IRM策略是否也会最佳地对SWCB起作用。SWCB是一些地区(即堪萨斯州西南、科罗拉多州东南部、得克萨斯州北部和俄克拉何马州西部)的玉米经济害虫，可能要求定期治理。和ECB—样，SWCB有2-4代和有相似的啃食行为。第一代幼虫啃食轮生组织(whorltissue),然后钻入茎秆后化蛹，而后面各代啃食抽穗组织(eartissue)后钻入茎秆。雌虫通常在羽化当晚交配，能产250-350个卯(Davis2000)。已启动了对SWCB移动模式的研究(Buschman等人1999)。在这个标记/再捕捉研究中，从1999年数据作出了以下关于SWCB的观察结论l)离释放地点较远的地方捕捉到的雄虫比雌虫多(与ECB相似)；2)SWCB大部分是在离释放地点100英尺以内被再次捕捉，不过也有一些在1200英尺外再次捕捉到；3)ECB和SWCB的蛾移动模式似乎在大部分方面是相似的。鉴于这些结果，很可能IRM策略的这个部分(为ECB确立的庇护区接近度指导方针)也将适用于SWCB。但是，由于可供测试的SWCB数目少，1999年的结果受到了妨碍，作者已指出该项工作将在2000年的季节继续进行。有关其他次要害虫(例如BCW、FAW、SCSB等)的研究也缺乏，这类研究对于其中这些害虫可能令人格外关注的特定区域会是有用的。但是，1998SAP指出，在次要玉米害虫当中，CEW和SWCB应最优先进行生物学研究。根据农业害虫的这些特征和行为，最常用的庇护区策略称为"地块(block)，，庇护区或"地带(strip)，，庇护区。NC-205小组推荐了对于Bt玉米的三个庇护区布置选择方案靠近田地种植的地块、在田地当中种植的地块或者在田地当中种植的地带(Ostlie等人1997)。一般来说，庇护区可设置为田地边缘或畦头上的外部地块，或者为Bt玉米田地当中的地带。研究已证实，ECB幼虫能够在行中或行间移动越过最多六抹玉米，大部分的移动出现在单行中。晚龄(第四龄和第五龄)ECB更有可能在行中移动而不是在行间移动(Hdlmich1998)。这是备受关注的原因所在，因为杂合的(部分抗性的)ECB幼虫可能开始啃食Bt植抹，然后移动到非Bt植林(如果在附近种植的话)以完成发育，从而挫败高剂量策略和增加抗性的风险。由于这个原因，种子混合区(通过在播种机(hopper)中将种子混合而产生的庇护区)通常不是推荐的庇护区(Mallet&Porter1992,Buschman等人1997)。Buschman等人(1997)建议田地内庇护区是IRM计划的理想策略。由于ECB幼虫趋向于在行内移动，作者建议完整的玉米行作为可接受的庇护区。窄的地带(用非Bt玉米种子装播种机的一个或两个播种箱)或宽的地带(用非Bt玉米种子装整个播种机)可用作田地内庇护区。数据表明，田地内地带可为Bt玉米中产生的ECB提供最好的机会来与非Bt玉米的ECB交配。由于初步的数据提示庇护区离Bt玉米应该在100行以内，Buschman等人(1997)推荐交替种植96行非Bt玉米地带和192行Bt玉米地带。这会导致33%的庇护区离Bt玉米在100行以内。目前，田地内地带(作为完整的行种植)应延伸田地的整体长度，包括最少六行交替种植的非Bt玉米与Bt玉米杂交体。NC-205推荐当执行田地内地带庇护区策略时种植6-12行非Bt玉米(NC205Supplement1998)。2000SAP还一致同意，由于幼虫移动的缘故，较宽的保护区地带优于较窄的地带，尽管对于一些规模较小的种植者来说，播种机大小可能会限制地带大小(SAP2001)。田地内地带可提供最大的潜在可能以确保易感成虫和抗性成虫之间的交配，因为这种地带能使成虫遗传混合(geneticmixing)最大化。建模表明，当使用20%庇护区时，至少6行宽的地带对于ECBIRM来说与邻近地块一样有效(Onstad&Guse1999)。但是，仅有两行宽的地带可以与地块一样有效，但危险性可能比地块或更宽地带高，因为我们对易感钻心虫和杂合钻心虫之间的存活差异了解不完全(01^&01&Gould1998)。鉴于目前关注的幼虫移动和随机交配需求的问题，外部地块或者田地内地带(横跨整个田地，至少6行宽)是可以使抗性发展的风险减至最低的庇护区设计。研究表明随机交配极有可能在田地内地带发生。但是如前所述，从作物损害和农场主是否遵守的角度，这个IRM策略会有问题。此外，根据现有的科学信念，目前必须设置庇护区，使得易感蛾(来自庇护区)和可能的抗性幸存者(来自Bt田地)之间的随机交配的潜在可能最大化。因此，当讨论庇护区接近度时，害虫飞行行为是一个关键的考虑因素。作为外部地块种植的庇护区应靠近或非常接近Bt玉米田地(Onstad&Gould1998，Ostlie等人1997b)。NC-205最初推荐庇护区应种植在％地段(section)(320英亩)当中(NC-205Supplement1998)。随后，该推荐经^"改^见定非Bt玉米庇护区应布置在离Bt田地V2英里0英里将更好)以内(Ortman1999)。Hunt等人(1997)完成的研究提示，大部分ECB不会扩散到离它们的蛹羽化地点很远的地方。根据这个标记-再捕捉研究，大部分ECB扩散可能不超过1500-2000英尺。大部分的(70-98%)被再次捕捉的ECB在离释放地点1500英尺以内被诱捕。但是，在1997年的研究的补遗中，作者告诫说1500英尺距离未必代表ECB的最大扩散距离(Hunt等人1998a)。另一个标记-再捕捉ECB项目专注研究羽化ECB(特别是未交配雌虫)的田地内移动(Hunt等人1998b)。再捕捉到的未交配雌虫相对较少(整个试验中有10只)，不过它们大部分是在离释放地点85英尺以内找到。这提示未交配雌虫可能不会扩散到离蛹羽化地点很远的地方(这在灌溉田地中尤为如此)。另外，在灌溉田地中有相对4交高比例的已交配雌虫(31%)在离释放地点10英尺以内的地方被诱捕，这提示交配发生在非常靠近羽化地点的地方。这两个观察结论都表明，许多羽化的ECB雌虫可能不扩散到它们发源田地以外的地方。就抗性治理和庇护区接近度而言，这些结果提示庇护区应布置在非常靠近Bt玉米田地的地方(或者作为田地内庇护区布置)，以增加随机交配的机会(特别是对于灌溉田地)。在雄虫ECB扩散方面，Showers等人(2001)进行的另一标记-再捕捉研究显示，为寻找配偶而扩散的雄虫可移动很长的距离(>800m)。但是，更大比例的雄虫是在离释放地点较近的距离(200m)被诱捕。根据这项研究，作者提出就雄虫移动而言，目前的^英里的庇护区接近度指导方针应当足以确保易感蛾和来自Bt田地的任何抗性幸存者之间的交配。虽然清楚知道ECB扩散随着远离蛹羽化地点而降低，但还没有完全确知ECB的定量扩散行为。但是，就最佳庇护区布置而言，在目前接受的标准下，庇护区接近度选定成使得随机交配的潜在可能最大化被认为是关键的。根据Himt等人的数据，庇护区离Bt玉米越近，抗性的风险越低。由于最大数量的ECB是在离田地1500英尺以内的地方4皮捕4足，且大部分的雌虫可在离田地10英尺以内的地方交配，将庇护区布置在尽可能靠近Bt田地的地方应当能增加随机交配的机会和减少抗性的风险。目前，Bt玉米的接近度要求是Y2英里(在过去用过杀昆虫剂处理ECB和SWCB的地区是W英里)(EPA致Bt玉米注册人的信函，2000年1月31日)。2000SAP同意这个指导方针，指出庇护区应设置在离Bt玉米田地不超过半英里的地方(如果可能的话乂英里以内)(SAP2001)。当然，这些庇护区选择方案的每一个(地块、地带等)在其执行中会带来另外的难题。如前所述，这些方法要让农场主的田地的一些部分对昆虫侵扰易感，以确保有易感昆虫发展并可供与田地中的任何抗性害虫交配。这导致很大的产量损失，因为目前这种庇护区必须占至少20%的田地。由于庇护区部分的转基因抗害虫作物导致产量下降，如前所述还存在农场主是否遵守庇护区要求的问题。时间和空间f匕护区采用时间和空间镶嵌方案(temporalandspatialmosaics)作为结构化庇护区的替代策略来延迟抗性，已得到了一定的关注。时间庇护区在理论上将是通过使Bt部分的作物在这种作物最会吸引ECB的时间里得到种植，来操纵ECB的生活周期。例如，会在种植常规玉米几个星期前种植Bt玉米田地。由于ECB据认为优先在长势较高的玉米植抹上产卵，希望是被侵扰的会是Bt玉米而不是长势较低吸引力较差的常规玉米。但是，田地专家们指出，时间庇护区是结构化庇护区的劣等替代方案(SAP1998)。研究已证实，不能用种植曰期来准确预测和操纵ECB产卵率(Calvin等人1997，Rice等人1997，Ostlie等人1997b,Calvin1998)。当地气候对玉米物候现象的影响使得种植日期成为操纵治理ECB的一个困难因素。将不得不在多种多样的条件下进行另外的研究，以完全回答这个问题。另外，时间镶嵌方案可导致类聚交配(assortivemating),其中来自Bt玉米的抗性蛾会互相交配，因为它们的发育时间与乂人庇护区羽化的易感蛾不同(Gould1994)。空间镶嵌方案涉及到种植具有不同作用模式的两个单独的Bt玉米事件。想法是，昆虫群体会暴露于多种蛋白质，从而减少对任何一种蛋白质的抗性的可能性。但是，目前注册的产品仅表达一种蛋白质，而玉米的主要害虫(ECB、CEW、SWCB)在整个幼虫啃食期通常保持在同一植林上，昆虫个体只会暴露于其中一种蛋白质。在产生易感昆虫的结构化庇护区不存在下，抗性仍可能具有在这种系统中发展的潜在可能，就像它会在单一蛋白单作区(monoculture)中发展那样。因此，目前接受的观点与本文公开的庇护区策略的类型相背离。已知在生长季节中，CEW从南方越冬地点向北迁移到美国玉米带的玉米生长地区。但是，已记录到CEW从北到南迁飞(从玉米生长区到棉花生长区)的观测结果。虽然需要更多的研究来确证，但这个现象会导致对Bt作物有额外暴露和对CEW抗性的选择压力增加。以下事实还使这个影响复杂化Bt棉花或任何注册的Bt玉米事件对CEW而言都不含高剂量。由此，可能有必要考虑额外的针对CEW的减轻措施。考虑到这个问题，2000SAP指出CEW庇护区最好在地区规模上加以考虑(而不是单个农场规模上的结构化庇护区)，因为这种害虫通常能够进行长距离迁移(即庇护区接近度对于CEW来说没那么重要)。根据SAP,20。/o庇护区(每个农场)对于CEW将是足够的，如果该地区中的Bt玉米的数量不超过总玉米作物的50%的话。但是如果地区性价玉米作物超过50%,可能需要额外的结构化庇护区(SAP2001)。但是，SAP没有定义"地区"应是怎样的地区(即国家、州还是其他区域)。根据最近可获得的Bt玉米英亩面积数据，应指出的是美国玉米带中的许多县超过2000SAP所确认的50。/。阈值。因为这一点，可能有CEW抗性的额外风险。在Bt玉米超过50%的地区中额外增加结构化庇护区，可减轻这个风险。但是，可能需要进行额外的研究，来完全确定CEW从北到南迁移的风险和适当的减轻措施。目前公认的庇护区选择方案高剂量事件；MON810、BT11和TC1507(饲料玉米)不定期喷洒杀昆虫剂的非棉花地区这个地区涵盖高地平原(HighPlains)东部的玉米带的大部分区域。最初的USDANC-205庇护区推荐意见包括20-30。/。不经处理的结构化庇护区或者可用非Bt杀昆虫剂处理的40%庇护区(Ostlie等人1997a)。在ECB(美国大部分地区的主要玉米害虫)的情况中，已知平均不到10%的种植者使用杀昆虫剂处理来控制这种害虫(美国食品与农业政策中心,NationalCenterforFoodandAgriculturePolicy1999)。由于许多种植者没有定期处理ECB,NC-205在1999年5月24日致JanetAndersen博士(BPPD主任)的信函中修正了他们的立场。在这个信函中，NC-205将他们的推荐修订为，20。/。非Bt玉米庇护区可用杀昆虫剂处理，且应布置在离Bt玉米乂2英里以内(y4英里更好)。信函中具体的推荐意见如下l)对庇护区的杀昆虫剂处理应基于侦察研究和公认的经济阈值，2)处理应在不含Bt或Cry毒素的产品上进行，3)应对受处理的庇护区进行记录并与EPA共享，4)应紧密监测被喷洒的庇护区的潜在影响并每年进行评估，和5)在较高风险区域例如用杀昆虫剂处理的庇护区应最频繁地监测抗性(Ortman1999)。由于大部分的种植者通常不用杀昆虫剂处理饲料玉米以控制ECB，如果ECB密度超过经济阈值的话可用非Bt杀昆虫剂喷洒的20%非Bt玉米的庇护区，对于美国玉米带应当是可行的。庇护区可按需用非Bt杀昆虫剂或其他适当的IPM措施进行处理，以控制鳞翅目茎秆钻心昆虫。杀昆虫剂的使用应基于使用经济阈值作为IPM计划的一部分的侦察工作。一些实验室研究证明，在BollgardII中表达的单独Cry2Ab蛋白和Cry2Ab+CrylAc蛋白在BollgardII棉花中产生功能性"高剂量"以供控制CBW、TBW和PBW。这些研究将在下文讨论。EPA之前断定，在目前的Bollgard株系中有中等非高剂量的CrylAc产生以控制CBW,有功能性高剂量的CrylAc产生以控制TBW和PBW(USEPA1998，2001)。下表将帮助读者认识昆虫害虫的首字母缩略词。注意，表中列出的是作为转基因害虫抗性策略的目标的最常见害虫，但本发明并不仅限于这些害虫。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>因此，仍需要治理抗害虫作物的田地中的害虫抗性的方法。要是能提供保护植物特别是玉米植物免受害虫的啃食损害的改进方法，将是有益的。如果这种方法会减少常规化学杀虫剂的所需施用频率的话，还有如果它会减少作物种植和栽培所需的单独田地操作数量的话，将是特别有益的。另外，要是有在转基因作物的田地中而不是在转基因作物的田地的周围布置管理机关所要求的转基因庇护区的方法，将是有益的。发明概述提供了治理抗害虫作物的田地中的害虫抗'l"生的方法。所述方法包括在一个种植周期在田地中种植第一抗害虫作物，接着在下一种植周期在同一田地中种植第二抗害虫作物，其中所述第一和第二抗害虫作物对同一目标害虫具有杀虫作用，但通过不同的杀虫作用模式起作用。使用本发明的方法，种植者现在可以在某田地中种植玉米之后的种植周期在同一田地种植玉米作物。在本发明之前，这样做是不明智的，因为存在根虫对作物的损害的风险。此外，由于最近在其他的作物中已有根虫活动，所述方法提供了控制根虫扩散的方法和针对根虫的抗性治理策略。本发明的玉米才艮虫包J舌例浊口"Za6raric(2vz'rg7/eravz>gz/era(LeConte)、D励ra"'ca6arZen'(SmithandLawrence)、_D/"6ra"catmcfec/m戶wctatoAo而W(Barber)和Z)/"Zra〃c"Wrg^ra(KrysanandSmith)。本发明采用到不同的杀虫作用模式。对根虫的抗性可通过任何本领域公知的方法引入到作物中。在一些实施方案中，不同的杀虫作用模式包括毒素与玉米根虫肠膜中的不同结合位点的结合。本发明的可用于抵抗根虫的转基因包括但不限于编码Bt蛋白Cry3A、Cry3Bb和Cry34AM/Cry35Abl蛋白的转基因。其他的适合其他害虫的转基因在本文中讨论。在一些实施方案中，将一种或两种抗害虫作物进一步用选自以下的杀虫剂处理除虫菊酯类和合成的除虫菊酯类、噁二溱类、氯烟酰类、硝基胍类、三唑类、有机磷酸酯、吡咯类、吡唑类、酚吡唑类、双酰肼类、生物/发酵产物、氨基曱酸酯类和它们的组合。在其他的实施方案中，一种或两种抗害虫作物还含有选自以下的除草剂抗性基因草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草丁膦(phosphinothricin)N-乙酰转移酶(PAT)和它们的组合。虽然本发明是在根虫情形中描述的，但本文所公开的根本概念也可应用于在其他害虫的情形中需要抗性治理的田地，所述其他害虫包括欧洲玉米钻心虫(ECB)(Os,n'm'aww&7afo)、西南玉米钻心虫(SWCB)(Z),"^e"gra"d/ose〃fl)、玉米穗虫(CEW)(//Wcovew"zea)、西部豆切才艮虫(WBCW)"/Z)icos/fl)、一大4亍军虫(FAW)(6^oc/optera/n^^enia)或小地老虎(BCW)(jgra/^Zfw7ow)。本发明还可进行组合使用，使得多种害虫在应用所述方法的过程中得到控制，无论是通过转基因手段还是其他手段。优选实施方案的详细描述本发明提供旨在治理抗害虫作物的田地中的抗性的方法。具体的说，所述方法包括在一个种植周期在田地中种植第一抗害虫作物，接着在下一种植周期在同一田地中种植第二抗害虫作物，其中所述第一和第二抗害虫作物对玉米根虫具有杀虫作用，但通过不同的杀虫作用模式起作用。应认识到，抗性性状可通过转化方法(即转基因方法)或传统育种方法引入到作物中。所谓"杀虫(的)"是指针对害虫(例如CRW)的毒性作用，包括外部供应的杀虫剂和/或作物产生的杀虫剂的之一或两者的活性。本文所用的术语"不同的杀虫作用模式"包括一种或多种抗性性状的杀虫作物中，所述杀虫作用例如该作物产生的杀虫毒素与玉米根虫肠膜中的不同结合位点(即不同的毒素受体和/或同一毒素受体上的不同位点)的结合。本文所用的术语"转基因抗害虫作物"是指衍自被转化的植物细胞或原生质体的植抹或其后代(包括种子)，其中该植株DNA含有引入的异源DNA分子，该DNA分子原先不存在于相同林系的天然、非转基因植抹中，能赋予对一种或多种玉米根虫的抗性。该术语指包含异源DNA的原始转化抹和该转化抹的后代。该术语还指通过该转化林和另一包含该异源DNA的品种之间的有性远交产生的后代。还要认识到，两抹不同的转基因植抹还可进行交配，产生含有两个或多个独立分离、加入的异源基因的后代。适当的后代的自交可产生该两个所加入的异源基因的纯合植林。还设想到与亲本植抹的回交和与非转基因植株的远交，还有无性繁殖。有关其他常用于不同性状和作物的育种方法的描述，可在几个参考文献之一找到，例如Fehr(1987)，5reec/wgAfe^O(is/orCw/WvflrDeve/o;meW,ed.J.Wilcox(AmericanSocietyofAgronomy,Madison,WI),每个文献通过引用并入本文。育种方法还可用来将任何天然抗性基因转移到作物中。所谓"植物，，意指主要的食物作物和纤维作物，包括例如玉米、高粱、小麦、向日葵、棉花、水稻、大豆、大米、油菜和马铃薯。本文所用的术语"玉米，，是指学名为玉米(Zeawa>^)，包括可与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米品种在内。在一个实施方案中，所公开的方法可用于治理抗害虫玉米的田地中的抗性问题，该田地在玉米种植后有计划地种植玉米(即连作玉米)。在另一个实施方案中，所述方法可用于治理第一年抗害虫玉米的田地中的抗性问题，即该田地在两年轮作周期中第一年种植玉米后跟着种植另一作物(例如大豆)。在本发明中还设想到了其他的轮作周期，例如种植玉米后接着多年种植一种或多种其他作物，以防止在其他滞育期长的害虫中可能随时间推移而发展的抗性。将核苷酸序列稳定引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法，是本领域公知的。"引入"意指将核苷酸序列以使得该序列能进入植物的细胞的内部的方式呈递给该植物。本发明方法并没有依赖于具体的将核苷酸序列^1入植物中的方法，只要该核普酸序列能进入该植物的细胞的内部即可。转化方案以及将核苷酸序列引入到植物中的方案，可根据要进行转化的植物或植物细胞(即单子叶植物或双子叶植物)的类型而变。例如，将核苷酸引入到植物中的合适方法包括微注射(CrosswayW(1986)4:320-334)、电穿孔(Riggs"(1986)7Va,/.^cac/.5W."61483:5602-5606)、农杆菌介导的转化(5，563，055号和5,981,840号美国专利，两专利都通过引用并入本文)、直接基因转移(PaszkowskiWa/.(1984)五MS(93:2717-2722)、弹道颗粒加速(ballisticparticleacceleration)(参见例如4,945,050号、5,879,918号、5,886,244号和5,932,782号美国专利(每个专利都通过引用并入本文)；和TomesWa/,(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,"P/滅CW/'71ww,aw<iCw/似wFwwc/amewto/MeAotfe,ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin);McCabe"a/.(1988)说otec/mo/ogy6:923-926)和Lecl转化(参见例如WO00/28058)。另参见Weissinger"a/.(1988)^"w.Aev.Gew"22:421-477;Sanford"a/.(1987)尸ar"cw/ateSdewce7k;/mo/ogy5:27-37(洋葱)；Christou"a/.(1988)尸te尸A戸'o/.87:671-674(大豆)；McCabe"a/.(1988)历o/7fec/mo/ogy6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)松raCe〃Z)ev.历o/.27P:175画182(大豆)；Singh"a/.(1998)^;/.G^"^96:319-324(大豆)；DattaW(1990)说'otec/mo/ogy8:736-740(水稻)；Klein"(1988)尸rac.A^/.^c"《85:4305-4309(玉米)；Klein"a/.(1988)万z'otec/mo/ogy6:559-563(玉米)；5,240,855号、5,322,783号和5,324,646号美国专利(每个专利都通过引用并入本文)；Klein"a/.(1988)尸/awf尸/yw'o/.91:440-444(玉米);Fromm"a/.(1990)胸ec/mo/ogy8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren"a/.(1984)(Xo油w」311:763-764;5,736,369号美国专利(谷类)；Bytebier"a/.(1987)尸rac.淑/.爿cat/,84:5345-5349(百合)；DeWetwa/.(1985)in77^5"xpen'mento/AfflmJ!7M/a"owo/(9vw/e7ilwwas'ed.Chapmana/.(Longman,NewYork),pp.197-209(pollen);Kaeppler"a/.(1990)尸/a^CW/Wepor&9:415-418和Kaeppler(1992)T7^c^J/;/.GWze/.84:560-566(颈须介导的專争4b，whisker-mediatedtransformation);D'Halluin"a/,(1992)尸/歸'Ce//4:M95-1505(电穿孔);Lie/"/,(1993)尸/a^Ce〃鄉om12:250-255;Christou和Ford(1995)X朋油o/万otowy75:407-413(7jc牙舀)；和OsjodaWa/.(1996)iV"似re"&&c/wo/og>>14:745-750(玉米，通过才艮瘤农杆菌(XgraZacten'i/m似we/ac,ew力)。在其他实施方案中，可通过将植物与病毒或病毒核酸接触，使核苷酸序列引入到植物中。一般来说，这种方法涉及将核苷酸序列掺入到病毒DNA或RNA分子当中。应i人识到，核苷酸序列可以最初作为病毒聚蛋白的一部分合成，病毒聚蛋白然后可通过体内或体外蛋白水解进行加工，产生期望的重组蛋白。涉及病毒DNA或RNA分子的将核苷酸序列引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法，是本领域公知的。参见例如5,889,191号、5,889,190号、5,866,785号、5,589,367号和5,316,931号美国专利(每个专利都通过引用并入本文)；牙口Porta"a/.(1996)Mo/ecw/arS/otec/mo/ogy5:209-221。本领域已知有将核苷酸定向插入到植物基因组中的特定位置的方法。在一个实施方案中，核苷酸序列在期望的基因组位置的插入是用位点特异性重组系统实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853。简单地说，核苷酸序列可含在转移盒(transfercassette)中，该转移盒两侧接有两个非重组发生的(non-recombinogenic)重组位点。将转移盒？1入到其基因组中稳定掺入了这样的目标位点的植物中，该目标位点两侧接有两个对应于转移盒的位点的非重组发生的重组位点。提供适当的重组酶，转移盒被整合在目标位点。目的核香酸序列因此被整合在植物基因组中的特定染色体位置。本文所用的术语"不同的杀虫作用模式"包括一种或多种抗性性状的杀虫作用，不管这些抗性性状是通过转化还是通过传统育种方法引入到作物中，所述杀虫作用例如该作物产生的杀虫毒素与玉米根虫肠膜中的不同结合位点(即不同的毒素受体和/或同一毒素受体上的不同位点)的结合。就杀虫作用模式而言，各杀虫化合物如果它们在害虫中具有相同的结合位点，而没有一种化合物会结合而另一种化合物不会结合的结合位点，则它们"竟争地"进行结合。例如，如果化合物A4又使用结合位点1和2,而化合物B也仅使用结合位点1和2,则化合物A和B"竟争地，，进行结合。各杀虫化合物如果它们在害虫中具有至少一个共同的结合位点，但也有至少一个不共同的结合位点，则它们"半竟争地"进行结合。例如，如果化合物C使用结合位点3和4,而化合物D仅使用结合位点3，则化合物C和D"半竟争地，，进行结合。各杀虫化合物如果它们在害虫中没有共同的结合位点，则它们"非竟争地，，进行结合。例如，如果化合物E使用结合位点5和6，而化合物F使用结合位点7，则化合物E和F"非竟争地"进行结合。在一些实施方案中，所述不同的杀虫作用模式是通过衍自某苏云金杆菌(Bt)菌林的异源基因的表达提供的，所述异源基因例如编码衍自Bt的杀虫S-内毒素的异源基因，其中该基因已被稳定引入到转基因植物中。这种S-内毒素描述于例如Crickmore"(1998)M/cra.Mo/.肠.iev.62:807-813;5,691,308号、5，188,960号、6,180,774号和5,689,052号美国专利(每个专利都通过引用并入本文);WO2899/24581和WO99/31248,包括例如编码Cry蛋白CrylA、CrylA(a)、CrylA(b)、CrylA(c)、CrylC、CrylD、CryIE、CrylF、Cry2A、Cry3Bb、Cry9C及它们的变体的基因。应认识到，可使用这些核苷酸序列的变体和片段，只要它们编码具有杀虫活性的Cry多肽。价5-内毒素作为前毒素合成，作为类芽孢内含体结晶。当被昆虫害虫摄食时，微晶结构被昆虫中肠的碱性pH溶解，前毒素被昆虫肠蛋白酶切割产生活性毒素。激活的Bt毒素结合昆虫肠上皮中的受体，造成膜损伤和伴随的昆虫肠膨胀和裂解。昆虫因饥饿和败血症而死亡。参见例如Lie,a/.(1991)A/fl似re353:815-821;Aronson(2002)Ce〃Mo/.h/eSc/,59(3):417-425;Schnepf"a/.(1998)Mz'cro.Mo/.祝o/.紐62:775-806。在其他实施方案中，异源基因衍自Bt变体(例如Avar.^ae/ew^s),其中毒素于Cry家族不相关，其杀虫作用模式不同于S-内毒素。示例性的毒素包括CytA毒素和植物杀虫蛋白(VIPs)。VIPs(例如VIP1类、VIP2类或VIP3类的成员)是分泌性蛋白质，通过昆虫中肠液进行蛋白水解加工。它们具有抗广谱的鳞翅目昆虫的杀虫活性。参见例如5,877,012号美国专利(通过引用并入本文)。在另外的实施方案中，所述不同的杀虫作用模式是通过编码杀虫脂肪酶的异源基因的表达来提供，其中该基因已被稳定引入到转基因植物中。任何编码具有杀虫活性的脂肪酶多肽的核苷酸序列都可用来实施本发明方法。术语"杀虫脂肪酶"包括对昆虫害虫具有毒性或抑制作用的脂质酰基水解酶的家族的任何成员。脂肪酶是本领域公知的。脂肪酶中有一类是脂质酰基水解酶类，也称三酰基甘油酰基水解酶或三酰基甘油脂肪酶(在IUBMB命名体系中称为EC3.1.1.3酶)。这些酶催化水解反应三酰基甘油+H20=二酰基甘油+羧酸。脂质酰基水解酶都共享共同的称为催化三元体(catalytictriad)的保守易分割结构区域。催化三元体由甘氨酸-X氨基酸-丝氨酸-X氨基酸-甘氨酸模体(GxSxG)组成。已证实这个区域中的氨基酸置换会消除酶促活性。这些脂质酰基水解酶的酶促作用也与显著的杀昆虫活性相关。参见例如6,657,046号和5,743,477号美国专利中公开的杀昆虫脂肪酶(两个专利都通过引用并入本文)。可用于实施本发明方法的其他杀虫蛋白包括但不限于二元毒素，如Cry34类和Cry35类的Bt结晶蛋白(参见例如Schnepf"a/.(2005)^//.￡>m>o".MZcraZnW.71:1765-1774)，以及链霉菌属(5Vre/7tom少c&y)的月旦固醇氧化酶，和书亍自Zewor/^Z^w属和尸AotoWa^dws属各种纟田菌、J5ac/〃ws/"/ercw/on^和5"c/〃wss/Aaehcws等的杀虫蛋白。还设想到使用嵌合(杂合)毒素(参见例如Bosch等人(1994)历o/Tec/mo/ogy12:915-918)。本发明还包括具有超过一种异源基因的转基因植物(即各异源基因的组合被稳定引入到植物中)。这种转化体可含有衍自同一类别毒素(例如超过一种S-内毒素、超过一种杀虫脂肪酶、超过一种二元毒素等)的转基因，或者可衍自不同类别的毒素(例如S-内毒素与杀虫脂肪酶或二元毒素的组合)的转基因。例如，具有表达衍自Bt的杀昆虫S-内毒素(如CrylF)的能力的植物，也具有表达至少一种不同于CrylF蛋白的其他S-内毒素如CrylA(b)蛋白的能力。类似地，具有表达衍自Bt的杀昆虫5-内毒素(如CrylF)的能力的植物，也具有表达杀虫脂肪酶如脂质酰基水解酶的能力。同样，具有表达二元毒素(如Cry34/35蛋白)的能力的植物，也具有表达至少一种不同于Cry34/35蛋白的其他杀虫蛋白如5-内毒素(例如Cry3Bb蛋白)的能力。Bt毒素和杀虫脂肪酶的毒性和抑制作用包括但不限于阻碍幼虫生长，杀灭卵或幼虫，减少成虫或幼虫啃食转基因植物(相对于在野生型植物上观察到的啃食情况)和诱导昆虫的与啃食、筑巢或繁殖相关的躲避行为。在某些实施方案中，用于本发明方法的核苷酸序列可与各目的核苷酸序列的任何组合进行堆积(stack),以产生具有期望的性状的植物。本文所用的"性状"指衍自特定序列或序列群组的表型。单一表达盒可含有编码目的杀虫蛋白的核普酸和至少一个另外的基因，如用来增加或改进转基因植物的期望性质的基因。或者，另外的基因可在多个表达盒上提供。这些堆积组合可通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法进行的杂交育种，或者遗传转化。如果各序列是通过遗传转化植物来堆积的，各个目的多核苷酸序列可在任何时间和以任何顺序进行组合。例如，可将包含一个或多个期望的性状(例如杀虫毒素的产生)的转基因植物用作目标，以通过随后的转化引入更多的性状。可用通过转化盒(transformationcassette)的任何组合提供的各目的核苷酸序列，按共转化方案同时引入各性状。例如，如果要引入两个序列，该两个序列可各自含在单独的转化盒(反式(trans))中，或者可含在同一个转化盒动Z还认识到，可使用位点特异性5重组;、统，3将各二:因;积在期望的基因组位置。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853。在实践中，根据杀虫作用的性质和某些害虫对某些毒素的易感性，之前描迷的不同Bt基因和其他基因的某些堆积组合(stackedcombinations)最适合于某些害虫。例如，一些转基因组合特别适用于对抗不同类型的CRW(包括WCRW、NCRW、MCRW和NCRW)。这些组合包括Cry34/35和Cry3A及Cry34/35和Cry3B。如前所述，基因堆积也可在这个情形使用。对于其他的害虫，也已知有其他的组合。例如，适合用于抵抗ECB和/或SWCB的组合包括CrylAb和CrylF、CrylAb和Cry2、CrylAb和Cry9、CrylAb和Cry2/Vip3A堆积、CrylAb和CrylF/Vip3A堆积、CrylF和Cry2、CrylF和Cry9以及CrylF和Cry2/Vip3A堆积。适合用于抵抗CEW的组合包括CrylAb和Cry2、CrylF和Cry2、CrylAb和Cry2/Vip3A堆积、CrylAb和CrylF/Vip3A堆积以及CrylF和Cry2/Vip3A堆积。适合用于抵抗FAW、BCW和/或WBCW的组合包括CrylAb和Cry2/Vip3A堆积、这些不同的组合还可互相组合，以提供对多种害虫的抗性治理。在其他的实施方案中，第一和/或第二抗害虫作物任选用杀虫剂或杀昆虫剂进行处理。所谓"杀虫剂"是指在外部供应到作物或作物种子的化学杀虫剂。术语"杀昆虫剂"具有与杀虫剂相同的含义，例外的是它的使用是针对害虫属昆虫的那些情况。适用于本发明的杀虫剂包括除虫菊酯和合成的拟除虫菊酯；嗯二。泰书f生物；氯烟酰类(chloronicotinyls);硝基胍衍生物；三唑类；有机磷酸酯类；吡咯类；吡唑类；苯基吡唑类；双酰肼类；生物/发酵产物和氨基曱酸酯类。这些类另'J当中的已知杀虫剂歹寸举在例如7Tze尸&s"c^eAfawwa/，llthed.,(1997)ed.C.D.S.Tomlin(BritishCropProtectionCouncil,Farnham,Surrey,UK)中。属嗯二溱衍生物的杀昆虫剂可用于本发明方法。可用于本发明的示例性嚼二。秦^"生物包括在5,852,012号美国专利中指出的那些螺二嗪衍生物(该专利通过引用并入本文)。氯烟酰类杀昆虫剂也可用于本发明方法。可用于本发明方法的示例性氯烟酰类在5,952,358号美国专利中有描述(该专利通过引用并入本文)。硝基胍杀昆虫剂也可用于本发明方法。这种硝基胍类可包括5,633,375号、5,034,404号和5,245,040号美国专利中描述的那些硝基胍类(每个专利都通过引用并入本文)。可用于本发明方法的吡咯、吡唑和苯基吡哇杀昆虫剂包括在5,952,358号美国专利中描述的那些吡咯、吡唑和苯基吡唑杀昆虫剂(该专利通过引用并入本文)。在本文中当描述某种杀昆虫剂时，应理解的是，该描述意在包括能显示与所描述的杀昆虫剂形式相同的杀昆虫活性的该杀昆虫剂的盐形式以及该杀昆虫剂的任何异构形式和/或互变异构形式。可用于本发明方法的杀昆虫剂可以为任何在商业交易中被批准用作这种杀昆虫剂的等级或纯度。在还其他的实施方案中，第一和/或第二抗害虫作物任选用杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、除草剂和它们的组合进行处理。在更多的实施方案中，第一和/或第二抗害虫作物还含有能提供除草剂耐受性的除草剂抗性基因，例如抗草甘磷-N-(膦酰基曱基)甘氨酸(包括这种除草剂的异丙胺盐形式)的基因。示例性的除草剂抗性基因包括草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)基因和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因。除草剂抗性基因通常编码对除虫剂不敏感的经修饰目标蛋白，或者编码能在除草剂起作用之前将植物中的该除草剂降解或解毒的酶。参见DeBlock"(1987)嵐卵J.6:2513;DeBlockw"/.(1989)i^>wo/.91:691;Fromm"(1990)历o7k^"o/ogy8:833;Gordon-Kamm"a/.(1990)Ce〃2:603;和Frische/a/.(1995)P/aWMo/.历o/.27:405-9。例如，《吏用编码突变的目标酶5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因，已获得了对草甘磷或磺酰脲除草剂的抗性。通过使用编码草丁膦乙酰转移酶、腈水解酶或2,4-二氯苯氧基乙酸单加氧酶的细菌基因，已获得了对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性，所述三种酶分别解毒这三种除草剂。本说明书中提到的所有出版物和专利申请是表示本发明所属的
技术领域：
的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，就像每个单独的出版物或专利申请都明确地和单独地被指出通过引用并入本文。虽然已出于清楚理解的目的通过举例说明和实例的方式，对前述的各个实施方案进行了一定程度的详细描述，但显而易见的是可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修改方案。3权利要求1.一种治理抗害虫作物的田地中的抗性的方法，所述方法包括以下步骤a)在一个种植周期在田地中种植第一抗害虫作物；和b)在第二种植周期在同一田地中种植第二抗害虫作物，其中所述第一和所述第二抗害虫作物对同种害虫具有杀虫作用，但杀虫作用的模式不同。2.权利要求1的方法，其中所迷第一和所述第二抗害虫作物是相同物种。3.权利要求2的方法，其中所述物种是玉米。4.权利要求1的方法，其中所述害虫选自西部玉米根虫、北部玉米根虫、墨西哥玉米根虫、南部玉米根虫和它们的组合。5.权利要求l的方法，其中所述害虫是西部玉米根虫。6.权利要求1的方法，其中所迷第一和所述第二抗害虫作物是转基因抗害虫作物。7.权利要求6的方法，其中所述不同的杀虫作用模式包括产生能半竟争性或非竟争性结合所述害虫肠膜中的不同结合位点的蛋白质。8.权利要求6的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生Cry34/35蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry3A蛋白。9.权利要求6的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生Cry34/35蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry3B蛋白。10.权利要求6的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生CrylA(b)蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生CrylF蛋白。11.权利要求6的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生Cry1A(b)蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry9蛋白。12.权利要求1的方法，所述方法进一步包括用杀虫剂处理所述第一抗害虫作物和/或所述第二抗害虫作物。13.权利要求12的方法，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、除草剂和它们的组合。14.权利要求13的方法，其中所述杀虫剂是杀昆虫剂。15.权利要求14的方法，其中所述杀昆虫剂选自除虫菊酯类和合成的除虫菊酯类、噁二溱类、氯烟酰类、硝基胍类、三唑类、有机磷酸酯、吡咯类、吡唑类、酚吡唑类、双酰肼类、生物/发酵产物、氨基曱酸酯类和它们的组合。16.权利要求6的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物或所述第二转基因抗害虫作物还含有选自以下的除草剂抗性基因草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草丁膦N-乙酰转移酶(PAT)和它们的组合。全文摘要提供了一种治理抗害虫作物的田地中的抗性的方法。所述方法包括在一个种植周期在田地中种植第一抗害虫作物，接着在第二种植周期在同一田地中种植第二抗害虫作物，其中所述第一和第二抗害虫作物对玉米根虫具有杀虫作用，但通过不同的杀虫作用模式起作用。文档编号C12N15/82GK101568642SQ200780047849公开日2009年10月28日申请日期2007年12月26日优先权日2006年12月22日发明者D·J·科斯格罗夫申请人:先锋高级育种国际公司