淀粉酶和葡糖淀粉酶、编码其的核酸以及关于制备和使用其的方法

专利名称：淀粉酶和葡糖淀粉酶、编码其的核酸以及关于制备和使用其的方法
技术领域：
本发明涉及分子和细胞生物学以及生物化学。在一个方面，本发明涉及具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，编码多肽的多核苷酸，以及关于制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。在一个方面，本发明的多肽可以用作内作用淀粉酶(例如，α淀粉酶)或用作外作用葡糖淀粉酶，例如以催化包含葡萄糖单体的多糖例如淀粉(例如由1，4-α或1，6-α键连接的葡萄糖单体聚合物)水解成糖。在一个方面，本发明涉及具有热稳定的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，包括α淀粉酶活性或1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解活性。在一个方面，本发明的多肽可以用作淀粉酶(例如，α淀粉酶)或葡糖淀粉酶，以催化多糖例如淀粉水解成糖，例如葡萄糖。本发明还涉及包含本发明核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于生产本发明多肽的重组方法。本发明还涉及本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在多糖(例如，淀粉)转换过程中的使用，包括高果糖玉米糖浆(HFCS)、乙醇、右旋糖、右旋糖糖浆的生产。
背景 淀粉是经常在人饮食中发现的复合碳水化合物。淀粉的结构是由α-1，4和α-1，6糖苷键连接的葡萄糖聚合物。商业上，葡糖淀粉酶用于进一步水解已由α-淀粉酶部分水解的玉米淀粉。最广泛利用的葡糖淀粉酶由真菌黑曲霉(Aspergillus niger)生产；关于这种酶的商业使用的问题之一是其相对低的热稳定性。
一般而言，淀粉至果糖加工由4个步骤组成颗粒状淀粉的液化、液化淀粉糖化成右旋糖、纯化和异构化成果糖。淀粉液化过程的目标是将淀粉聚合物颗粒的浓缩悬浮液转换成低粘度的可溶性较短链长度的糊精溶液。这个步骤对于用标准设备的方便处理和至葡萄糖或其他糖的有效转换是必需的。为了液化颗粒状淀粉，必须通过使颗粒状淀粉的温度升高至超过约72℃使颗粒凝胶化。加热过程立即使不溶性淀粉颗粒断裂，以产生水溶性淀粉溶液。溶解的淀粉溶液随后通过淀粉酶液化。淀粉颗粒由下述组成69-74％支链淀粉、26-31％直链淀粉、11-14％水、0.2-0.4％蛋白质、0.5-0.9％脂质、0.05-0.1％炭酸钠、0.02-0.03％磷、0.1％戊聚糖。约70％的颗粒是无定形的和30％是晶状的。
烘焙产品(例如面包)的老化已被认为是随着面包产品制备时刻和消费时刻之间存在的时间越多而变得越严重的问题。术语老化用于描述在离开烘箱后面包产品的性质中对于消费者不希望有的改变，例如面包心硬度的增加、面包心弹性的减少以及面包皮中变得坚韧和革质的变化。面包心的硬度在贮存期间进一步增加至一定水平，这视为负面的。被视为老化的最重要方面的面包心硬度的增加在面包产品在其他方面已变得不适合消费前很长时间由消费者认识到。
在工业中存在关于用于各种用途的新淀粉酶例如酸性淀粉酶的需要，所述用途包括商业玉米淀粉液化过程或改善的制造，所述淀粉酶具有超过例如来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的工业标准酶的新的或改良性能特征。还存在鉴定淀粉酶和葡糖淀粉酶的工业动力，所述酶能够在低温下有效水解颗粒状淀粉(例如粗颗粒状淀粉)而无需高温淀粉凝胶化步骤；本发明的酶，例如淀粉酶、葡糖淀粉酶和葡糖苷酶可以用于满足这个需要。
还存在关于在自动洗碗(ADW)产品和衣物洗涤剂中具有功用的新淀粉酶的需要。在ADW产品中，淀粉酶将在pH 10-11和45-60℃下在钙螯合剂和氧化条件的存在下起作用。对于洗衣，将需要在pH 9-10和40℃下在合适的洗涤剂基质的活性。淀粉酶也在织物脱浆、酿造过程、造纸和制浆工业中的淀粉改性和本领域描述的其他过程中有用。
概述 本发明提供了分离的、合成或重组核酸，其包含在至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个或更多残基的区域上，与本发明的核酸，例如本发明的示例性核酸具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或完全(100％)序列同一性的核酸序列。在一个方面，核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的至少一种多肽，并且序列同一性通过用序列比较算法分析或通过目视检查进行测定。在另一个方面，本发明提供了用于用作探针、抑制分子(例如，反义、iRNAs，例如siRNA、microRNA或miRNAs)，转录或翻译调节等的核酸。
本发明的示例性核酸包括分离的、合成或重组核酸，其包含如SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO80、SEQ ID NO81和/或SEQ ID NO82和/或其子序列中所示的核酸序列，例如长度至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500或更多残基，或在基因或转录物(信使)的全长上。
本发明的示例性核酸还包括编码本发明的多肽的分离的、合成或重组核酸，例如具有如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76和/或SEQ ID NO78中所示的序列，及其子序列和其变体的示例性多肽，以及如本文所描述的，与本发明的示例性多肽具有至少约50％、51％等或更多至100％的序列同一性的多肽。
在一个方面，本发明的多肽具有内作用淀粉酶活性(例如α淀粉酶)或外作用葡糖淀粉酶活性(下文进一步描述的可替代的淀粉酶活性)。在一个方面，本发明的多肽充当免疫原或表位。在一个实施方案中，本发明的多肽可以催化包含葡萄糖单体的多糖和/或寡糖，例如淀粉(由1，4-α或1，6-α键连接的葡萄糖单体聚合物)的水解。
本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可以在商业上用于多糖、寡糖或淀粉加工的最初阶段(液化)中；湿玉米研磨中；醇生产中；用作洗涤剂基质中的清洁剂；在纺织工业中用于淀粉脱浆；烘焙应用中；饮料工业中；在油田钻探过程中；再循环纸的上墨和动物饲料中。本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可以用于织物脱浆，酿造过程，造纸和制浆工业中的多糖、寡糖或淀粉修饰和其他过程中。例如，本发明提供了使用本发明的多肽用于液化糖化的方法，如图5中举例说明的。
本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可以用于催化多糖例如淀粉水解成糖；或用于水解淀粉中的内部α-1，4-糖苷键，以产生更小分子量的麦芽糖糊精。因为多糖和/或寡糖例如淀粉的断裂在消化系统和商业制备过程中是重要的，所以本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶用于食物和饲料以及关于制备其的过程中，以及用于消化帮助中或用作消化帮助。本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可以用于淀粉加工的最初阶段(液化)中；湿玉米研磨中；醇生产中；用作洗涤剂基质中的清洁剂；在纺织工业中用于淀粉脱浆；烘焙应用中；饮料工业中；在油田钻探过程中；再循环纸的上墨中；和动物饲料中。
本发明的酶可以具有外作用葡糖淀粉酶活性，并且可以用于进一步水解已由α-淀粉酶(其也可以是本发明的多肽)部分水解的玉米淀粉，以产生葡萄糖；并且在本发明的这个过程的方面，葡萄糖通过葡萄糖异构酶转变成葡萄糖和果糖的混合物。在本发明的这个过程的另一个方面，使这种混合物富含果糖，以产生高果糖玉米糖浆。在可替代的方面，本发明的多肽在多糖、寡糖或淀粉至果糖加工的任何步骤中使用，例如包括4个步骤颗粒状淀粉的液化，液化多糖、寡糖或淀粉糖化成右旋糖，纯化和异构化成果糖。使用本发明的至少一种多肽的本发明的一个方面包含多糖、寡糖或淀粉液化过程，用于将多糖、寡糖或淀粉聚合物颗粒的浓缩悬浮液转换成低粘度的可溶性较短链长度的糊精溶液。
本发明还提供了使用本发明的至少一种多肽的酶促液化过程，其包括将颗粒状多糖、寡糖或淀粉浆的pH调整至待使用的本发明的酶(例如，本发明的葡糖淀粉酶或淀粉酶)的最佳pH，例如6.0-6.5、或约5.5-7.0；氢氧化钙、氢氧化钠或碳酸钠可以为了这个目的而加入(氢氧化钙的添加具有也提供钙离子的优点，所述钙离子已知针对灭活稳定α-淀粉酶)。在一个方面，在添加本发明的淀粉酶(例如，α-淀粉酶)后，悬浮液通过蒸汽喷嘴进行抽吸，以使温度即刻升高至80℃-115℃，且使淀粉立即凝胶化，并且由于α-淀粉酶的存在，通过经由α-淀粉酶的(1-4)糖苷键的随机水解而解聚成容易抽吸的液体物质。
在关于这个多糖和/或寡糖(例如，淀粉)液化过程的可替代方面，将本发明的淀粉酶(例如，α-淀粉酶)和/或葡糖淀粉酶加入多糖(例如，淀粉)悬浮液中，使悬浮液保持于80-100℃，以使颗粒例如淀粉颗粒部分水解，并且部分水解的多糖/淀粉悬浮液通过喷嘴在超过约105℃的温度下进行抽吸，以使任何其余的颗粒状结构完全凝胶化。在凝胶化的多糖/淀粉冷却后，可以进行本发明的葡糖淀粉酶和/或淀粉酶(例如，α-淀粉酶)的第二次添加，以进一步水解多糖/淀粉。
在一个方面，本发明还提供了编码淀粉酶的和编码葡糖淀粉酶的核酸，其共同新颖性之处在于它们衍生自混合培养物，例如来自环境来源。本发明提供了从混合培养物中分离的编码淀粉酶的和编码葡糖淀粉酶的核酸，其包含在至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个或更多残基的区域上，与本发明的示例性核酸具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或完全(100％)序列同一性的核酸序列，其中核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的至少一种多肽，并且序列同一性通过用序列比较算法分析或通过目视检查进行测定。
在一个方面，本发明提供了从混合培养物例如环境来源中分离的编码淀粉酶和编码葡糖淀粉酶的核酸，其包含本发明的核酸，例如本发明的示例性核酸，例如如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11等中所示的序列，及其子序列，例如长度至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500个或更多残基，或在基因或转录物的全长上；或编码本发明的多肽的核酸。
在一个方面，本发明还提供了编码淀粉酶的和编码葡糖淀粉酶的核酸，其共同新颖性之处在于它们衍生自环境来源(关于从“未知”或环境来源中分离的序列例子参见下表1，第2列)，例如混合环境来源。在一个方面，本发明提供了从环境来源例如混合环境来源中分离的编码淀粉酶的和编码葡糖淀粉酶的核酸，其包含在至少约25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个或更多残基的区域上，与本发明的示例性核酸具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或完全(100％)序列同一性的核酸序列，其中核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的至少一种多肽，并且序列同一性通过用序列比较算法分析或通过目视检查进行测定。
在一个方面，本发明提供了从环境来源例如混合环境来源中分离的编码淀粉酶的和编码葡糖淀粉酶的核酸，其包含本发明的核酸，例如，如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11等、SEQ ID NO583、SEQ ID NO585中所示的本发明的示例性核酸，及其子序列，例如长度至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500个或更多残基，或在基因或转录物的全长上；或编码本发明的多肽的核酸。
在一个方面，本发明还提供了葡糖淀粉酶和淀粉酶、以及编码淀粉酶的和编码葡糖淀粉酶的核酸，其共同新颖性之处在于它们衍生自archael来源，包括本发明的archael衍生的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。
在一个方面，序列比较算法是BLAST版本2.2.2算法，其中过滤设置设为blastall-pblastp-d″nr pataa″-FF，并且所有其他选项设为缺省值。
本发明的另一个方面是包括本发明核酸序列，与其基本上相同的序列，和与其互补的序列的至少10个连续碱基的分离的、合成或重组核酸。
在一个方面，淀粉酶活性包含α-淀粉酶或β-淀粉酶活性，包括水解淀粉中的内部α-1，4-糖苷键以产生更小分子量的麦芽糖糊精的能力。在一个方面，α-淀粉酶活性包括随机水解淀粉中的内部α-1，4-糖苷键。葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性可以包含α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性、外淀粉酶活性、葡聚糖α-麦芽糖四水解酶(maltotetrahydrolase)活性、麦芽糖酶活性、异麦芽糖酶活性、葡聚糖1，4，α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶活性、蔗糖酶活性或琼脂糖酶活性(例如，β-琼脂糖酶活性)。
淀粉酶活性可以包含水解糖苷键。在一个方面，糖苷键包含α-1，4-糖苷键。在另一个方面，糖苷键包含α-1，6-糖苷键。在一个方面，淀粉酶活性包含水解多糖例如淀粉例如液化淀粉中的糖苷键。淀粉酶活性可以进一步包含将糖苷键水解成麦芽糖糊精。在一个方面，淀粉酶活性包含从淀粉的非还原末端切割麦芽糖或D-葡萄糖单位。
在一个方面，分离的、合成或重组核酸编码具有热稳定的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽。多肽可以在包含下述温度范围的任何地方的条件下保留淀粉酶活性约0℃-约37℃、或约37℃-约95℃或更多，例如98℃、100℃或更多；约55℃-约85℃、约70℃-约95℃、或约90℃-约95℃。例如，具有如SEQ ID NO437中所示序列的示例性多肽是热稳定的，在不存在添加的钙的情况下，在100℃下25分钟后保留50％活性。
在另一个方面，分离的、合成或重组核酸编码具有耐热的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽。在暴露于超过37℃-约95℃或超过55℃-约85℃范围中的任何地方的温度后，多肽可以保留淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性。在一个方面，在pH 4.5下在暴露于超过90℃-约95℃的温度后，多肽保留淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性。
本发明提供了分离的、合成或重组核酸，其包含在严格条件下与本发明的核酸杂交的序列，例如本发明的示例性核酸，包含如SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO80、SEQ ID NO81和/或SEQ ID NO82中所示的序列的核酸，和/或其片段或子序列。在一个方面，核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽。核酸可以是长度至少约25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500个或更多残基，或基因或转录物的全长。在一个方面，严格条件包括包含在0.2X SSC中于约65℃约15分钟的洗涤步骤。在一个方面，严格条件包含在包含具有0.15M NaCl的缓冲液的条件下于72℃杂交15分钟。
本发明提供了用于鉴定编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的核酸的核酸探针，其中探针包含含有本发明序列的序列，或其片段或子序列的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多连续碱基，其中探针通过结合或杂交鉴定核酸。探针可以包含含有本发明序列的序列，或其片段或子序列的至少约10-50、约20-60、约30-70、约40-80、或约60-100个连续碱基的寡核苷酸。
本发明提供了用于鉴定编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的核酸的核酸探针，其中探针包含含有至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多残基的序列的核酸，其与本发明的核酸具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或完全(100％)序列同一性，其中序列同一性通过用序列比较算法分析或通过目视检查进行测定。
探针可以包含含有本发明的核酸序列或其子序列的至少约10-50、约20-60、约30-70、约40-80、或约60-100个连续碱基的寡核苷酸。
本发明提供了用于扩增编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的核酸的扩增引物序列对，其中引物对能够扩增包含本发明序列或其片段或子序列的核酸。扩增引物序列对的一个或每个成员可以包含含有序列的至少约10-50个连续碱基的寡核苷酸。
本发明提供了扩增编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的核酸的方法，其包括用能够扩增本发明的核酸序列或其片段或子序列的扩增引物序列对来扩增模板核酸。
本发明提供了包含本发明的核酸或其子序列的表达盒(包括，例如载体和克隆用载体)。在一个方面，表达盒可以包含与启动子可操作地连接的核酸。启动子可以是病毒、细菌、哺乳动物或植物启动子。在一个方面，植物启动子可以是马铃薯、稻、玉米、小麦、烟草或大麦启动子。启动子可以是组成型启动子。组成型启动子可以包含CaMV35S。在另一个方面，启动子可以是诱导型启动子。在一个方面，启动子可以是组织特异性启动子或环境调节或发育调节型启动子。因此，启动子可以是例如种子特异性、叶特异性、根特异性、茎特异性或脱落诱导型启动子。在一个方面，表达盒可以进一步包含植物或植物病毒表达载体。在可替代实施方案中，植物启动子是玉米种子胚特异性球蛋白启动子(参见例如，Belanger(1991)Molecular basisfor allelic polymorphism of the maize Globulin-1 gene.Genetics129863-872)；或玉米种子胚乳特异性γ-玉米醇溶蛋白(zein)启动子(参见例如，Lopes(1995)Identification of two opaque2modifier loci in Quality Protein Maize.Mol.Gen.Genet.247603-613)；或稻种子胚乳特异性GTL1启动子(参见例如，Takaiwa(1991)Analysis of the 5′flanking region responsible for theendosperm-specific expression of arice glutelin chimeric genein transgenic tobacco.Plant Mol.Biol.1649-58)。
本发明提供了包含本发明的表达盒(例如，载体)或本发明的核酸的克隆用载体。克隆用载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、fosmid、细菌病毒或人工染色体。病毒载体可以包含腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体。克隆用载体可以包含细菌人工染色体(BAC)、质粒、噬菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)、或哺乳动物人工染色体(MAC)。
本发明提供了转化细胞(或“宿主细胞”)，其包含本发明的核酸或本发明的表达盒(例如，载体)、或本发明的克隆用载体。在一个方面，转化细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一个方面，植物细胞可以来自任何植物，例如用于任何动物包括反刍动物的草料和/或饲料的植物，或用作原料的来源以产生能量或燃料。特别有利的植物可以包括农作物植物和原料植物，例如玉蜀黍、苜蓿、向日葵、芸苔属(Brassica)、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟、大麦、稻、针叶树，草例如柳枝稷(Switch grass)和芒属(Miscanthus)，豆类作物，例如豌豆、豆和大豆，淀粉块茎/根，例如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉、甜菜、甘蔗等。
本发明提供了包含本发明的核酸或本发明的表达盒(例如，载体)的转基因非人动物。在一个方面，动物是小鼠。本发明提供了从这些转基因非人动物中分离的细胞或细胞系。
本发明提供了包含本发明的核酸或本发明的表达盒(例如，载体)的转基因植物。转基因植物可以是任何植物，但在一个实施方案中，植物将是用于任何动物的草料和/或饲料，或用作原料以产生能量或燃料，例如玉蜀黍、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟、大麦、稻、针叶树，草例如柳枝稷和芒属，豆类作物，例如豌豆、豆和大豆，淀粉块茎/根，例如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉、甜菜、甘蔗等。
本发明提供了包含本发明的核酸或本发明的表达盒(例如，载体)的转基因种子。转基因种子可以来自任何植物，但在一个实施方案中，植物将是用于任何动物的草料和/或饲料，或用作原料以产生能量或燃料，例如玉蜀黍、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟、大麦、稻、针叶树，草例如柳枝稷和芒属，豆类作物，例如豌豆、豆和大豆，淀粉块茎/根，例如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉、甜菜、甘蔗等。
任何植物、植物部分、植物组织、植物种子或植物细胞可以用于稳定地(例如，作为转基因植物、或由其衍生的细胞或细胞系)或瞬时地引入本发明的核酸；因此本发明提供了包含本发明的核酸和/或多肽的植物、植物部分、植物组织、植物种子和植物细胞，其中植物可以是(但不限于)玉米(玉蜀黍(Zea mays))、芸苔属物种(例如欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，包括用作种子油来源的那些芸苔属物种，例如低芥酸菜子、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、稻(水稻(Oryza sativa))、黑麦(黑麦(Secale cereale))、高粱(双色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、栗(例如珍珠栗(珍珠栗(Pennisetumglaucum))、黍(黍(Panicum miliaceum))、谷子(谷子(Setariaitalica))、穇子(穇子(Eleusine coracana)))、向日葵(向日葵(Helianthus annuus))、红花(红花(Carthamus tinctorius))、小麦(小麦(Triticum aestivum))、大豆(大豆(Glycine max))、烟草(烟草(Nicotiana tabacum))、马铃薯(马铃薯(Solanumtuberosum))、花生(花生(Arachis hypogaea))、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(甘薯(Ipomoea batatus))、木薯(木薯(Manihot esculenta))、咖啡(咖啡属物种(Cofea spp.))、椰子(椰子(Cocos nucifera))、菠萝(菠萝(Ananas comosus))、柑橘树(柑橘属物种(Citrus spp.))、可可(可可(Theobroma cacao))、茶(山茶(Camellia sinensis))、香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))、鳄梨(鳄梨(Persea americana))、无花果(无花果(Ficus casica))、番石榴(番石榴(Psidium guajava))、芒果(芒果(Mangifera indica))、橄榄(橄榄(Olea europaea))、番木瓜(番木瓜(Carica papaya))、腰果(腰果(Anacardiumoccidentale))、澳洲坚果(澳洲坚果(Macadamia integrifolia))、杏仁(杏仁(Prunus amygdalus))、甜菜(甜菜属物种(Beta sp.)，例如甜菜(Beta vulgaris))、甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))、须芒草族(Andropogoneae)(草)、藜科(Chenopodiaceae)(有花植物)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树；以及蔬菜，例如番茄(番茄(Lycopersicon esculentum))、莴苣(例如莴苣(Lactucasativa))、菜豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(利马豆(Phaseolus limensis))、豌豆(香豌豆属物种(Lathyruss pp.))，和甜瓜属(Cucumis)成员例如黄瓜(黄瓜(C.sativus))、甜瓜(甜瓜(C.cantalupensis))、和香瓜(香瓜(C.melo))；和观赏植物，包括杜鹃花(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))、绣球花(绣球花(Macrophylla hydrangea))、木槿((Hibiscus rosasanensis))、玫瑰(蔷薇属物种(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属物种(Tulipaspp.))、水仙花(水仙属物种(Narcissus spp.))、牵牛花(矮牵牛(Petunia hybrida))、康乃馨(康乃馨(Dianthuscaryophyllus))、一品红(一品红(Euphorbia pulcherrima))、美人蕉(美人蕉属物种(Cannaceae spp.))和菊花；以及可以使用的针叶树，包括例如松树例如火炬松(火炬松(Pinus taeda))、湿地松(湿地松(Pinus elliotii))、美国黄松(美国黄松(Pinusponderosa))、扭叶松(扭叶松(Pinus contorta))、和辐射松(辐射松(Pinus radiata))、花旗松(花旗松(Pseudotsuga menziesii))；加拿大铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))；北美云杉(北美云杉(Picea glauca))；红杉(红杉(Sequoia sempervirens))；真正的冷杉例如银杉(冷杉(Abies amabilis))和香脂冷杉(香脂冷杉(Abies balsamea))；和雪松例如西部红松(西部红松(Thujaplicata))和黄扁柏(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))；和豆科植物，包括但不限于，豆和豌豆，其中在可替代方面豆可以包括瓜尔豆、刺槐豆、葫芦巴、大豆、菜豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等，并且豆类可以包括但不限于花生属例如花生，蚕豆属例如小冠花、毛苕子、赤豆、绿豆和鹰嘴豆，羽扇豆属例如羽扇豆，三叶草属，菜豆属例如刀豆和利马豆，豌豆属例如芸豆，草木犀属例如三叶草，苜蓿属例如苜蓿，莲属例如车轴草，兵豆属例如小扁豆和紫穗槐；还包括草料和草地草，例如苜蓿、柳枝稷(柳枝稷(Panicum virgatum))、芒属、果园草、高羊茅、多年生黑麦草、匍匐性本特草和小糠草。
在可替代方面，包含本发明的核酸和/或多肽的植物、植物部分、植物组织、植物种子和植物细胞还包括农作物植物和用于产生能量或燃料(例如乙醇或其他生物燃料，例如生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇或生物柴油)的植物，例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、栗、大麦、稻、针叶树、草例如柳枝稷和芒属、豆类作物例如豌豆、豆和大豆、淀粉块茎/根例如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉、甘蔗和/或甜菜等。
本发明提供了反义寡核苷酸，其包含与本发明的核酸互补、或在严格条件下能够与本发明的核酸杂交的核酸序列。本发明提供了抑制细胞中的淀粉酶信使的翻译的方法，其包括给细胞施用反义寡核苷酸或在细胞中表达反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含与本发明的核酸互补、或在严格条件下能够与本发明的核酸杂交的核酸序列。
本发明提供了包含氨基酸序列的分离的、合成或重组多肽，其包含在至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个或更多残基的区域上，或在多肽的全长上与本发明的示例性多肽或肽具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或完全(100％)序列同一性，并且序列同一性通过用序列比较算法分析或通过目视检查进行测定。本发明的示例性多肽或肽序列包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76和/或SEQ ID NO78，和/或其子序列及其变体，例如长度至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500个或更多残基，或在酶的全长上。本发明的示例性多肽或肽序列包括由本发明的核酸编码的序列。本发明的示例性多肽或肽序列包括由本发明的抗体特异性结合的多肽或肽。在一个方面，本发明的多肽具有至少一种淀粉酶活性，例如α淀粉酶活性。
在可替代实施方案中，本发明的多肽缺乏信号序列(前导序列)和/或碳水化合物结合组件。在可替代实施方案中，本发明的多肽进一步包含一种或多种异源序列，其可以包含异源信号序列(前导序列)、异源催化结构域(CD)(即，活性位点)、或异源碳水化合物结合组件、或表位、纯化标签或标记。在一个方面，异源信号序列、异源碳水化合物结合组件或异源催化结构域(CD)衍生自另一种淀粉酶(除本发明的酶以外的淀粉酶)，或衍生自非淀粉酶。
在可替代实施方案中，本发明的多肽具有淀粉酶活性，或可以用于产生与本发明的示例性多肽(例如，SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76和/或SEQ ID NO78)特异性结合的抗体。
在可替代实施方案中，本发明的多肽可以是合成的或以拟肽形式。
本发明的另一个方面是分离的、合成或重组多肽或肽，其包括本发明的多肽或肽序列，与其基本上相同的序列，和与其互补的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450或500个或更多连续氨基酸残基。
在一个方面，本发明的多肽或肽的淀粉酶活性包含α-淀粉酶活性，包括水解淀粉中的内部α-1，4-糖苷键以产生更小分子量的麦芽糖糊精的能力。在一个方面，α-淀粉酶活性包括随机水解淀粉中的内部α-1，4-糖苷键。淀粉酶活性可以包含葡糖淀粉酶活性、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性、α-淀粉酶活性、外淀粉酶活性、或β-淀粉酶活性。淀粉酶活性可以包含水解糖苷键。在一个方面，糖苷键包含α-1，4-糖苷键。在另一个方面，糖苷键包含α-1，6-糖苷键。在一个方面，淀粉酶活性包含水解淀粉例如液化淀粉中的糖苷键。淀粉酶活性可以进一步包含将糖苷键水解成麦芽糖糊精。在一个方面，淀粉酶活性包含从淀粉的非还原末端切割麦芽糖或D-葡萄糖单位。
在一个方面，本发明的淀粉酶活性包含葡糖淀粉酶活性，其可以包含糖苷键的水解的催化。本发明的葡糖淀粉酶活性可以包含催化D-葡萄糖从淀粉或其他相关糊精的非还原末端的逐步水解释放。葡糖淀粉酶活性可以包含1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性。葡糖淀粉酶活性可以包含麦芽糖糊精的水解的催化，导致游离葡萄糖的产生。葡糖淀粉酶活性可以包含外淀粉酶活性。葡糖淀粉酶活性可以包含α-淀粉酶活性或β-淀粉酶活性。水解的糖苷键可以包含α-1，4-糖苷键或α-1，6-糖苷键。葡糖淀粉酶活性可以包含水解淀粉中的糖苷键。葡糖淀粉酶活性可以进一步包含水解淀粉中的糖苷键，以产生麦芽糖糊精。葡糖淀粉酶活性可以包含从淀粉的非还原末端切割麦芽糖或D-葡萄糖单位。
在一个方面，淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性可以是热稳定的。多肽在包含下述温度范围的条件下可以保留淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性约37℃-约95℃、约55℃-约85℃、约70℃-约95℃、或约90℃-约95℃。在另一个方面，淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性可以是耐热的。在暴露于超过37℃-约95℃或超过55℃-约85℃范围中的任何地方的温度后，多肽可以保留淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性。在一个方面，在pH 4.5下在暴露于超过90℃-约95℃的温度后，多肽可以保留淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性。
在一个方面，淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性是热稳定的，例如其中多肽在包含下述温度范围的条件下保留淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性约-100℃-约-80℃、约-80℃-约-40℃、约-40℃-约-20℃、约-20℃-约0℃、约0℃-约5℃、约5℃-约15℃、约15℃-约25℃、约25℃-约37℃、约37℃-约45℃、约45℃-约55℃、约55℃-约70℃、约70℃-约75℃、约75℃-约85℃、约85℃-约90℃、约90℃-约95℃、约95℃-约100℃、约100℃-约105℃、约105℃-约110℃、约110℃-约120℃或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高。在某些实施方案中，在上文描述的温度范围下，在约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高下，根据本发明的热稳定的多肽保留活性，例如淀粉酶活性和/或葡糖淀粉酶活性。
在一个方面，淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性是耐热的，例如其中多肽在暴露于下述温度范围后保留淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性约-100℃-约-80℃、约-80℃-约-40℃、约-40℃-约-20℃、约-20℃-约0℃、约0℃-约5℃、约5℃-约15℃、约15℃-约25℃、约25℃-约37℃、约37℃-约45℃、约45℃-约55℃、约55℃-约70℃、约70℃-约75℃、约75℃-约85℃、约85℃-约90℃、约90℃-约95℃、约95℃-约100℃、约100℃-约105℃、约105℃-约110℃、约110℃-约120℃或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高。在暴露于约-100℃-约-80℃、约-80℃-约-40℃、约-40℃-约-20℃、约-20℃-约0℃、约0℃-约5℃、约5℃-约15℃、约15℃-约25℃、约25℃-约37℃、约37℃-约45℃、约45℃-约55℃、约55℃-约70℃、约70℃-约75℃、约75℃-约85℃、约85℃-约90℃、约90℃-约95℃、约95℃-约100℃、约100℃-约105℃、约105℃-约110℃、约110℃-约120℃或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高的温度后，根据本发明的耐热的多肽可以保留活性，例如淀粉酶活性和/或葡糖淀粉酶活性。在某些实施方案中，在暴露于上文描述的温度范围后，在约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高下，根据本发明的耐热的多肽保留活性，例如淀粉酶活性和/或葡糖淀粉酶活性。
在一个方面，在包含约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更低(更酸性)pH的酸性条件下，由本发明的核酸编码的多肽的淀粉酶活性和/或葡糖淀粉酶活性保留活性，或在暴露于包含约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH3.5、pH 3.0或更低(更酸性)pH的酸性条件后，保留淀粉酶活性和/或葡糖淀粉酶活性；或在包含约pH 7、pH 7.5pH 8.0、pH 8.5、pH 9、 pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更高(更碱性)的碱性条件下保留活性，或在暴露于包含约pH 7、pH 7.5pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更高(更碱性)的碱性条件下，保留淀粉酶活性和/或葡糖淀粉酶活性。在一个方面，在至少约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度下，和至少约pH 7.5pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更高(更碱性)的碱性pH下，由本发明的核酸编码的多肽的淀粉酶活性和/或葡糖淀粉酶活性保留活性。
在一个方面，分离的、合成或重组多肽可以包含缺乏信号序列的本发明的多肽。在一个方面，分离的、合成或重组多肽可以包含含有异源信号序列的本发明的多肽，例如异源淀粉酶或非淀粉酶信号序列。
在一个方面，本发明提供了包含如表1中所示的肽的信号序列。在一个方面，本发明提供了由包含表1中所示的肽的信号序列。在一个方面，本发明提供了嵌合蛋白质，其包含含有本发明的信号序列的第一结构域和至少第二结构域。蛋白质可以是融合蛋白。第二结构域可以包含酶。酶可以是任何葡糖淀粉酶和/或淀粉酶(例如，本发明的葡糖淀粉酶或淀粉酶，或另一种淀粉酶或葡糖淀粉酶)。
在一个方面，本发明的酶的酶促活性(例如葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)包含在约37℃下约1-约1200单位/毫克蛋白质、或约100-约1000单位/毫克蛋白质的比活性。在另一个方面，本发明的酶的酶促活性(例如葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)包含约100-约1000单位/毫克蛋白质、或约500-约750单位/毫克蛋白质的比活性。可替代地，本发明的酶的酶促活性(例如葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)包含在约37℃下约1-约750单位/毫克蛋白质、或约500-约1200单位/毫克蛋白质的比活性。在一个方面，本发明的酶的酶促活性(例如葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)包含在约37℃下约1-约500单位/毫克蛋白质、或约750-约1000单位/毫克蛋白质的比活性。在另一个方面，本发明的酶的酶促活性(例如葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)包含在约37℃下约1-约250单位/毫克蛋白质的比活性。可替代地，本发明的酶的酶促活性(例如葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)包含在约37℃下约1-约100单位/毫克蛋白质的比活性。在另一个方面，耐热性包含在加热至升高的温度后保留本发明的酶的酶促活性(例如葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)于37℃的至少一半比活性，例如约0℃-约20℃、约20℃-约37℃、约37℃-约50℃、约50℃-约70℃、约70℃-约75℃、约75℃-约80℃、约80℃-约85℃、约85℃-约90℃、约90℃-约95℃、约95℃-约100℃、约100℃-约110℃或更高。可替代地，耐热性可以包含在加热至升高的温度后保留约1-约1200单位/毫克蛋白质、或约500-约1000单位/毫克蛋白质的于37℃的比活性。在另一个方面，如上所述，耐热性可以包含在加热至升高的温度后保留约1-约500单位/毫克蛋白质的于37℃的比活性。
本发明提供了本发明的分离的、合成或重组多肽，其中多肽包含至少一个糖基化位点。在一个方面，糖基化可以是N联糖基化。在一个方面，多肽在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或栗酒裂殖酵母(S.pombe)中表达后可以是糖基化的。本发明还提供了翻译后或以化学方法给多肽添加糖基化的方法，以改变多肽的性质，例如其热稳定性、溶解性、聚集的趋势等。
在一个方面，在包含约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更低(更酸性)pH的条件下，多肽可以保留本发明的酶的酶促活性(例如，葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)。在另一个方面，在包含约pH 7、pH 7.5 pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更高(更碱性)pH的条件下，多肽可以保留本发明的酶的酶促活性(例如，葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)。在一个方面，在暴露于包含pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更低(更酸性)pH的条件后，多肽可以保留本发明的酶的酶促活性(例如，葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)。在另一个方面，在暴露于包含pH 7、pH 7.5pH8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更高(更碱性)pH的条件下，多肽可以保留本发明的酶的酶促活性(例如，葡糖淀粉酶和/或淀粉酶活性)。
本发明提供了包含本发明的多肽的蛋白质制剂，其中蛋白质制剂包含液体、固体或凝胶。
本发明提供了包含本发明的多肽和第二结构域的异二聚体。在一个方面，第二结构域可以是多肽，和异二聚体可以是融合蛋白。在一个方面，第二结构域可以是表位或标记。在一个方面，本发明提供了包含本发明的多肽的同二聚体。
本发明提供了具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的固定多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽、由本发明的核酸编码的多肽、或包含本发明的多肽和第二结构域的多肽。在一个方面，多肽可以固定在细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠、凝胶、板、阵列或毛细管上。
本发明提供了包含本发明的固体核酸的阵列。本发明提供了包含本发明的抗体的阵列。
本发明提供了分离的、合成或重组抗体，其与本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽特异性结合。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。本发明提供了包含本发明的抗体的杂交瘤，所述抗体例如与本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽特异性结合的抗体。
本发明提供了用于动物的食物补充剂，其包含本发明的多肽，例如由本发明的核酸编码的多肽。在一个方面，食物补充剂中的多肽可以是糖基化的。本发明提供了可食用的酶递送基质，其包含本发明的多肽，例如由本发明的核酸编码的多肽。在一个方面，递送基质包含丸剂。在一个方面，多肽可以是糖基化的。在一个方面，淀粉酶活性是耐热的。在一个方面，淀粉酶活性是热稳定的。
本发明提供了分离或鉴定具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的方法，其包括步骤(a)提供本发明的抗体；(b)提供包含多肽的样品；和(c)在其中所述抗体可以与所述多肽特异性结合的条件下，使步骤(b)的样品与步骤(a)的抗体接触，从而分离或鉴定具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽。
本发明提供了制备抗淀粉酶抗体的方法，其包括以足以产生体液免疫应答的量给非人动物施用本发明的核酸或本发明的多肽或其子序列，从而制备抗淀粉酶或抗葡糖淀粉酶抗体。本发明提供了形成抗葡糖淀粉酶和/或抗淀粉酶免疫的方法，其包括以足以产生免疫应答的量给非人动物施用本发明的核酸或本发明的多肽或其子序列。
本发明提供了生产重组多肽的方法，其包括步骤(a)提供与启动子可操作地连接的本发明的核酸；和(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，从而生产重组多肽。在一个方面，该方法可以进一步包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，随后表达步骤(a)的核酸，从而在转化细胞中生产重组多肽。
本发明提供了用于鉴定具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的方法，其包括下述步骤(a)提供本发明的多肽；或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供淀粉酶底物；和(c)使步骤(a)的多肽或其片段或变体与步骤(b)的底物接触，并且检测底物量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加检测具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽。在一个方面，底物可以是多糖、寡糖或淀粉，例如液化淀粉。
本发明提供了用于鉴定淀粉酶或葡糖淀粉酶底物的方法，其包括下述步骤(a)提供本发明的多肽；或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供测试底物；和(c)使步骤(a)的多肽与步骤(b)的测试底物接触，并且检测底物量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加鉴定测试底物为淀粉酶或葡糖淀粉酶底物。
本发明提供了测定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法，其包括下述步骤(a)在允许核酸翻译成多肽的条件下表达核酸或包含所述核酸的载体，其中所述核酸包含本发明的核酸，或提供本发明的多肽；(b)提供测试化合物；(c)使多肽与测试化合物接触；和(d)测定步骤(b)的测试化合物是否与多肽特异性结合。
本发明提供了用于鉴定淀粉酶或葡糖淀粉酶活性的调节剂的方法，其包括下述步骤(a)提供本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供测试化合物；(c)使步骤(a)的多肽与步骤(b)的测试化合物接触，并且测量淀粉酶或葡糖淀粉酶活性，其中与在不存在测试化合物的情况下的活性比较，在测试化合物的存在下测量的淀粉酶或葡糖淀粉酶活性的改变提供了测试化合物调节淀粉酶或葡糖淀粉酶活性的测定。在一个方面，淀粉酶或葡糖淀粉酶活性通过下述进行测量提供淀粉酶或葡糖淀粉酶底物，并且检测底物量的减少或反应产物量的增加，或者底物量的增加或反应产物量的减少。与不含测试化合物的底物或反应产物量比较，底物量的减少或反应产物量的增加鉴定测试化合物为淀粉酶或葡糖淀粉酶活性的活化剂。与不含测试化合物的底物或反应产物量比较，底物量的增加或反应产物量的减少鉴定测试化合物为淀粉酶或葡糖淀粉酶活性的抑制剂。
本发明提供了包含处理器和数据存储设备的计算机系统，其中所述数据存储设备已在其上储存本发明的多肽序列或核酸序列(例如，由本发明的核酸编码的多肽)。在一个方面，计算机系统可以进一步包含序列比较算法和具有在其上储存的至少一种参考序列的数据存储设备。在另一个方面，序列比较算法包含指示多态性的计算机程序。在一个方面，计算机系统可以进一步包含鉴定所述序列中的一个或多个特征的鉴别器。本发明提供了在其上已储存本发明的多肽序列或核酸序列的计算机可读介质。本发明提供了用于鉴定序列中的特征的方法，其包括步骤(a)使用鉴定序列中的一个或多个特征的计算机程序阅读序列，其中所述多肽序列包含本发明的多肽序列或核酸序列；和(b)用计算机程序鉴定序列中的一个或多个特征。本发明提供了用于比较第一序列与第二序列的方法，其包括步骤(a)通过使用比较序列的计算机程序阅读第一序列和第二序列，其中第一序列包含本发明的多肽序列或核酸序列；和(b)用计算机程序测定第一序列和第二序列之间的差异。测定第一序列和第二序列之间的差异的步骤可以进一步包括鉴定多态性的步骤。在一个方面，该方法可以进一步包括鉴定序列中的一个或多个特征的鉴别器。在另一个方面，该方法可以包括使用计算机程序阅读第一序列，和鉴定序列中的一个或多个特征。
本发明提供了用于从环境样品中分离或回收核酸的方法，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，所述方法包括步骤(a)提供用于扩增核酸的扩增引物序列对，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中引物对能够扩增本发明的核酸；(b)从环境样品中分离核酸，或处理环境样品，从而使得样品中的核酸可用于与扩增引物对杂交；和，(c)使步骤(b)的核酸与步骤(a)的扩增引物对组合，且扩增来自环境样品的核酸，从而从环境样品中分离或回收核酸，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽。扩增引物序列对的一个或每个成员可以包含含有本发明的序列的至少约10-50个连续碱基的寡核苷酸。
本发明提供了用于从环境样品中分离或回收核酸的方法，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，所述方法包括步骤(a)提供包含本发明的核酸或其子序列的多核苷酸探针；(b)从环境样品中分离核酸，或处理环境样品，从而使得样品中的核酸可用于与步骤(a)的多核苷酸探针杂交；(c)使步骤(b)的分离的核酸或处理的环境样品与步骤(a)的多核苷酸探针组合；和(d)分离与步骤(a)的多核苷酸探针特异性杂交的核酸，从而从环境样品中分离或回收核酸，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽。环境样品可以包含水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品。在一个方面，生物样品可以衍生自细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了产生核酸的变体的方法，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，所述方法包括步骤(a)提供包含本发明的核酸的模板核酸；和(b)在模板序列中修饰、缺失或添加一个或多个核苷酸，或其组合，以产生模板核酸的变体。在一个方面，该方法可以进一步包括表达变体核酸，以产生变体淀粉酶和/或葡糖淀粉酶多肽。修饰、缺失或添加可以通过下述方法引入易错PCR、改组、寡核苷酸定向的诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归总体诱变、指数总体诱变、位点特异性诱变、基因重新装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重新装配(SLR)及其组合。在另一个方面，修饰、缺失或添加通过下述方法引入重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射产生的诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、总体诱变、嵌合核酸多聚体产生及其组合。
在一个方面，该方法可以反复重复直至产生淀粉酶或葡糖淀粉酶，其具有与由模板核酸编码的多肽不同的改变或不同的活性、或者改变或不同的稳定性。在一个方面，变体淀粉酶或葡糖淀粉酶多肽是耐热的，并且在暴露于升高的温度后保留一定活性。在另一个方面，与由模板核酸编码的淀粉酶或葡糖淀粉酶比较，变体淀粉酶或葡糖淀粉酶多肽具有增加的糖基化。可替代地，变体淀粉酶或葡糖淀粉酶多肽在高温下具有淀粉酶或葡糖淀粉酶活性，其中由模板核酸编码的淀粉酶或葡糖淀粉酶在高温是无活性的。在一个方面，该方法可以反复重复直至产生淀粉酶或葡糖淀粉酶编码序列，其具有与模板核酸不同的改变的密码子使用。在另一个方面，该方法可以反复重复直至产生淀粉酶或葡糖淀粉酶基因，其具有与模板核酸不同的更高或更低水平的信使表达或稳定性。
本发明提供了用于修饰核酸中的密码子以增强其在宿主细胞中的表达的方法，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，所述方法包括下述步骤(a)提供编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的本发明的核酸；和，(b)鉴定步骤(a)的核酸中的非优选或较不优选的密码子，且用编码相同氨基酸的优选或中立使用的密码子作为替换密码子替换它，其中优选密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中过度表现的密码子，并且非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰核酸以增强其在宿主细胞中的表达。
本发明提供了用于修饰编码淀粉酶和/或葡糖淀粉酶多肽的核酸中的密码子的方法；所述方法包括下述步骤(a)提供本发明的核酸；和，(b)鉴定步骤(a)的核酸中的密码子，且用编码相同氨基酸的不同密码子作为替换密码子替换它，从而修饰编码淀粉酶或葡糖淀粉酶的核酸中的密码子。
本发明提供了用于修饰核酸中的密码子以增强其在宿主细胞中的表达的方法，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，所述方法包括下述步骤(a)提供编码淀粉酶或葡糖淀粉酶多肽的本发明的核酸；和，(b)鉴定步骤(a)的核酸中的非优选或较不优选的密码子，且用编码相同氨基酸的优选或中立使用的密码子作为替换密码子替换它，其中优选密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中过度表现的密码子，并且非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰所述核酸以增强其在宿主细胞中的表达。
本发明提供了用于修饰核酸中的密码子以减少其在宿主细胞中的表达的方法，所述核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，所述方法包括下述步骤(a)提供本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的至少一个优选密码子，且用编码相同氨基酸的非优选或较不优选的密码子作为替换密码子替换它，其中优选密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中过度表现的密码子，并且非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰所述核酸以减少其在宿主细胞中的表达。在一个方面，宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了用于生产核酸文库的方法，所述核酸编码多个经修饰的淀粉酶或葡糖淀粉酶活性位点或底物结合位点，其中所述经修饰的活性位点或底物结合位点衍生自包含编码第一活性位点或第一底物结合位点的序列的第一核酸，所述方法包括下述步骤(a)提供编码第一活性位点或第一底物结合位点的第一核酸，其中所述第一核酸序列包含在严格条件下与本发明的核酸杂交的序列，并且所述核酸编码淀粉酶或葡糖淀粉酶活性位点或淀粉酶或葡糖淀粉酶底物结合位点；(b)提供在第一核酸中在多个靶向密码子处编码天然存在的氨基酸变体的一组诱变寡核苷酸；和，(c)使用该组诱变寡核苷酸以产生一组编码活性位点的或编码底物结合位点的变体核酸，其编码在诱变的每个氨基酸密码子处的一系列氨基酸变化，从而生产编码多个经修饰的淀粉酶或葡糖淀粉酶活性位点或底物结合位点的核酸文库。在一个方面，该方法包括通过下述方法使步骤(a)的第一核酸诱变优化定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)、或合成连接重新装配(SLR)、易错PCR、改组、寡核苷酸定向的诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归总体诱变、指数总体诱变、位点特异性诱变、基因重新装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重新装配(SLR)及其组合。在另一个方面，该方法包括通过下述方法使步骤(a)的第一核酸或变体诱变重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、辐射产生的诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、总体诱变、嵌合核酸多聚体产生及其组合。
本发明提供了用于制备小分子的方法，其包括下述步骤(a)提供能够合成或修饰小分子的多种生物合成酶，其中所述酶之一包含由本发明的核酸编码的淀粉酶或葡糖淀粉酶；(b)提供步骤(a)的至少一种酶的底物；和(c)使步骤(b)的底物与所述酶在有利于多种生物催化反应的条件下反应，以通过一系列生物催化反应产生小分子。本发明提供了用于修饰小分子的方法，其包括下述步骤(a)提供淀粉酶或葡糖淀粉酶，其中所述酶包含本发明的多肽、或由本发明的核酸编码的多肽、或其子序列；(b)提供小分子；和(c)使步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子在有利于由淀粉酶或葡糖淀粉酶催化的酶促反应的条件下反应，从而通过淀粉酶或葡糖淀粉酶的酶促反应修饰小分子。在一个方面，该方法可以包括关于步骤(a)的酶的多种小分子底物，从而产生通过至少一种酶促反应生产的经修饰的小分子文库，所述酶促反应由淀粉酶或葡糖淀粉酶催化。在一个方面，该方法可以包括多种另外的酶，在有利于经由所述酶的多种生物催化反应的条件下，以形成通过多种酶促反应生产的经修饰的小分子文库。在另一个方面，该方法可以进一步包括测试文库的步骤，以测定显示所需活性的特定经修饰的小分子是否存在于文库内。测试文库的步骤可以进一步包括系统地消除在文库内除了一个以外的所有生物催化反应的步骤，所述生物催化反应用于生产多个经修饰的小分子的部分，这是通过就具有所需活性的特定经修饰的小分子的存在或不存在测试经修饰的小分子的部分，并且鉴定生产具有所需活性的特定经修饰的小分子的至少一种特异性生物催化反应来完成的。
本发明提供了用于测定淀粉酶或葡糖淀粉酶的功能片段的方法，其包括步骤(a)提供淀粉酶或葡糖淀粉酶，其中所述酶包含本发明的多肽、或由本发明的核酸编码的多肽、或其子序列；和(b)使来自步骤(a)的序列的多个氨基酸残基缺失，且就淀粉酶或葡糖淀粉酶活性测试其余子序列，从而测定淀粉酶或葡糖淀粉酶的功能片段。在一个方面，淀粉酶或葡糖淀粉酶活性通过下述进行测量提供淀粉酶或葡糖淀粉酶底物，且检测底物量的减少或反应产物量的增加。
本发明提供了通过使用实时代谢流分析用于新或修饰表型的全细胞改造的方法，所述方法包括下述步骤(a)通过修饰细胞的遗传组成制备经修饰的细胞，其中所述遗传组成通过给细胞添加本发明的核酸进行修饰；(b)培养经修饰的细胞以产生多个经修饰的细胞；(c)通过实时监控步骤(b)的细胞培养物测量细胞的至少一种代谢参数；和，(d)分析步骤(c)的数据，以测定测量参数是否不同于在相似条件下未经修饰的细胞中的可比较测量，从而使用实时代谢流分析鉴定细胞中的改造表型。在一个方面，细胞的遗传组成通过下述方法进行修饰，所述方法包括细胞中的序列缺失或序列修饰，或，击倒基因的表达。在一个方面，该方法可以进一步包括选择包含新改造表型的细胞。在另一个方面，该方法可以包括培养所选择的细胞，从而产生包含新改造表型的新细胞株。
本发明提供了用于水解多糖、寡糖或淀粉的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽；(b)提供包含多糖、寡糖或淀粉的组合物；和(c)使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在其中所述多肽水解多糖、寡糖或淀粉的条件下接触。在一个方面，包含多糖、寡糖或淀粉的组合物包含α-1，4-糖苷键或α-1，6-糖苷键。在一个方面，淀粉酶活性是α-淀粉酶或β-淀粉酶活性。在一个方面，α-淀粉酶活性水解淀粉或其他多糖中的内部键。
本发明提供了用于从组合物中液化或去除多糖、寡糖或淀粉的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽；(b)提供包含多糖、寡糖或淀粉的组合物；和(c)使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在其中所述多肽去除或液化多糖、寡糖或淀粉的条件下接触。
本发明提供了增加淀粉酶多肽的耐热性或热稳定性的方法，所述方法包括使淀粉酶或葡糖淀粉酶多肽糖基化，其中所述多肽包含本发明的多肽；或由本发明的核酸序列编码的多肽的至少30个邻接氨基酸，从而增加淀粉酶或葡糖淀粉酶多肽的耐热性或热稳定性。在一个方面，淀粉酶或葡糖淀粉酶比活性在超过约37℃-约95℃的温度下可以是热稳定的或耐热的。
本发明提供了用于在细胞中超表达重组淀粉酶或葡糖淀粉酶多肽的方法，其包含含有本发明的核酸或本发明的核酸序列的核酸，其中序列同一性通过用序列比较算法分析或通过目视检查进行测定，其中超表达通过使用高活性启动子、双顺反子载体或通过载体的基因扩增来实现。
本发明提供了包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的洗涤剂组合物，其中所述多肽包含淀粉酶或葡糖淀粉酶活性。在一个方面，淀粉酶或葡糖淀粉酶可以是非表面活性的淀粉酶或葡糖淀粉酶。在另一个方面，淀粉酶或葡糖淀粉酶可以是表面活性的淀粉酶或葡糖淀粉酶。
本发明提供了用于洗涤物体的方法，其包括下述步骤(a)提供包含具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽的组合物，其中所述多肽包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供物体；和(c)使步骤(a)的多肽与步骤(b)的物体在其中组合物可以洗涤物体的条件下接触。
本发明提供了用于在由动物消耗前水解饲料或食物中的多糖、寡糖或淀粉的方法，其包括下述步骤(a)获得包含多糖、寡糖或淀粉的组合物，例如饲料材料，其中所述多肽包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；和(b)将步骤(a)的多肽以足够的量加入组合物例如饲料或食物材料中足够的时间段，以引起多糖、寡糖或淀粉的水解，从而水解多糖、寡糖或淀粉。在一个方面，食物或饲料包含稻、玉米、大麦、小麦、豆类或马铃薯。
例如，在一个实施方案中，本发明提供了包含淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合的组合物(其中这些酶中的一种或两种是本发明的酶)，用于水解多糖、寡糖或淀粉，例如稻、玉米、大麦、小麦、豆类或马铃薯。在一个方面，关于淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合的酶装载包含110的淀粉酶葡糖淀粉酶比；其中在一个实施方案中，酶总载量为完全水解33％面粉例如玉米粉所需的0.015％-0.0255％酶。可替代地，关于装载的示例性范围为用于水解23％纯化的玉米淀粉的约0.01％(w/w)，和用于水解33％玉米粉中的玉米淀粉的0.015％-0.2％(w/w)。
本发明提供了用于织物脱浆的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供织品；和(c)使步骤(a)的多肽和步骤(b)的织品在其中淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可以使织品脱浆的条件下接触。
本发明提供了用于使纸或纤维脱墨的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽；(b)提供包含纸或纤维的组合物；和(c)使步骤(a)的多肽和步骤(b)的组合物在其中所述多肽可以使纸或纤维脱墨的条件下接触。
本发明提供了用于处理木质纤维素纤维的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽；(b)提供木质纤维素纤维；和(c)使步骤(a)的多肽和步骤(b)的纤维在其中所述多肽可以处理纤维的条件下接触，从而改善纤维性质。
本发明提供了用于生产高麦芽糖或高葡萄糖糖浆的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的酶；(b)提供包含多糖、寡糖或淀粉的组合物；和(c)使步骤(a)的多肽和步骤(b)的织物在其中步骤(a)的多肽可以水解步骤(b)的组合物的条件下接触，从而生产可溶性多糖、寡糖或淀粉、水解产物，并且使可溶性多糖、寡糖或淀粉、水解产物糖化，从而生产糖浆。在一个方面，淀粉可以来自稻、玉米、大麦、小麦、豆类、马铃薯或甘薯。
本发明提供了用于改善含多糖例如含淀粉生产液的流动的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽；(b)提供生产液；和(c)使步骤(a)的多肽和步骤(b)的生产液在其中淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可以水解生产液中的多糖、寡糖或淀粉的条件下接触，从而通过减少其密度而改善其流动。在一个方面，生产液可以来自地层(subterraneanformation)。
本发明提供了抗老化组合物，其包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽。本发明提供了用于预防烘焙产品的老化的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽；(b)提供包含多糖、寡糖或淀粉用于烘焙的组合物；(c)在这样的条件下使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物相组合，其中所述多肽可以水解用于烘焙的组合物中的多糖、寡糖或淀粉，从而防止烘焙产品的老化。在一个方面，烘焙产品可以是面包。
本发明提供了关于在酿造或醇生产中使用淀粉酶或葡糖淀粉酶的方法，其包括下述步骤(a)提供具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含本发明的多肽；(b)提供包含多糖、寡糖或淀粉用于酿造或醇生产中的组合物；(c)在这样的条件下使步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物相组合，其中所述多肽可以水解用于酿造或醇生产的组合物中的多糖、寡糖或淀粉。在一个方面，包含多糖、寡糖或淀粉的组合物可以是啤酒。
本发明提供了制备转基因植物的方法，其包括下述步骤(a)将异源核酸序列引入细胞内，其中所述异源核酸序列包含本发明的核酸序列，从而生产转化的植物细胞；(b)由转化细胞生产转基因植物。在一个方面，步骤(a)可以进一步包括通过植物细胞原生质体的电穿孔或显微注射引入异源核酸序列。在另一个方面，步骤(a)可以进一步包括通过DNA粒子轰击将异源核酸序列直接引入植物组织。可替代地，步骤(a)可以进一步包括使用根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)宿主将异源核酸序列直接引入植物细胞DNA内。在一个方面，植物细胞可以是马铃薯、玉米、稻、小麦、烟草或大麦细胞。
本发明提供了在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，其包括下述步骤(a)用与启动子可操作地连接的异源核酸序列转化植物细胞，其中所述异源核酸序列包含本发明的核酸；(b)在其中异源核酸序列在植物细胞中表达的条件下培养植物。
本发明还提供了用于制备生面团或由生面团制备的烘焙产品的过程，其包括将本发明的淀粉酶或葡糖淀粉酶以有效延缓面包的老化的量加入生面团中。本发明还提供了包含所述淀粉酶或葡糖淀粉酶的生面团，和包含面粉连同所述淀粉酶或葡糖淀粉酶的预混合料。最后，本发明提供了酶促烘焙添加剂，其包含所述淀粉酶或葡糖淀粉酶。淀粉酶或葡糖淀粉酶依照本发明的使用提供了改善的抗老化效应，如通过例如较少的面包心硬化、保留的面包心弹性、改善的切片能力(例如较少的碎屑、非胶粘碎屑)、改善的适口性或滋味。
本发明的含酶组合物(例如，包含本发明的多肽、核酸和/或抗体)可以以各种形式进行配制，例如作为液体、凝胶、丸剂、片剂、喷雾、粉剂、食物、饲料丸剂或包囊形式，包括纳米包囊形式。这些实施方案中的任何一种可以设计或进一步配制为延迟释放或“控制释放”组合物。
本发明提供了包含由乳胶聚合物(或等价物)包衣包被的所需成分的延迟释放(“控制释放”)组合物。在一个方面，所需成分包含酶，例如本发明的酶。在一个方面，包被组合物包含药物或药品。在一个方面，所需成分包含小分子、药物、多糖、脂质、核酸、维生素、抗生素或杀昆虫剂。在一个方面，所需成分包含丸剂或基质，例如包含可食用材料的丸剂或基质(例如，作为动物食物或饲料或补充剂或药物)。本发明还提供了关于组合物的“控制释放”或“延迟释放”的方法，其中组合物由乳胶聚合物(或等价物)包衣包被。
在一个方面，乳胶聚合物包衣包含乳胶漆或等价物。乳胶聚合物包衣可以包含(甲基)丙烯酸酯、乙酸乙烯酯、苯乙烯、乙烯、氯乙烯、丁二烯、乙烯叉氯、叔碳酸乙烯酯(vinyl versatate)、丙酸乙烯酯、叔丁基丙烯酸酯、丙烯腈、氯丁橡胶、马来酸酯、延胡索酸酯、其等价物、其组合和/或其衍生物。
本发明提供了用于组合物的延迟释放或控制释放的方法，其包括(i)(a)提供组合物，且提供乳胶聚合物包衣；和(b)用乳胶聚合物包衣包被组合物；(ii)(i)的方法，其中组合物包含药物或药品；或(iii)(i)或(ii)的方法，其中组合物包含权利要求56的多肽或权利要求1的核酸编码的多肽、或由权利要求56的多肽或权利要求1的核酸编码的多肽组成。
本发明提供了包含本发明的多肽的油井钻井液。本发明提供了用于改变组合物的粘度的方法，其包括(i)(a)提供组合物和本发明的多肽，且提供组合物；和(b)用本发明的多肽处理组合物；或(ii)(i)的方法，其中组合物包含土壤或钻探泥浆。
本发明提供了用于帮助运走钻探泥浆的方法，其包括(a)提供组合物和本发明的多肽，以及钻探泥浆；和(b)用包含本发明的多肽的组合物处理钻探泥浆。
本发明提供了包含本发明的多肽的生物漂白溶液。本发明提供了用于生物漂白组合物的方法，其包括(i)(a)提供组合物和本发明的多肽；和(b)用本发明的多肽处理组合物；或(ii)(i)的方法，其中组合物是纸或浆产品。
本发明提供了用于制备燃料的方法，其包括(i)(a)提供本发明的多肽；(b)提供包含多糖、寡糖或淀粉的组合物；和(c)使(a)的多肽与(b)的组合物在其中多肽水解多糖、寡糖或淀粉的条件下接触；或(ii)(i)的方法，其中多肽是热稳定酶；(iii)(i)的方法，其中燃料是基于乙醇的。
本发明提供了包含本发明的多肽的消毒剂。
本发明提供了包含本发明的多肽的生物防卫或生物解毒剂。
本发明提供了包含本发明的多肽的乳制品。
本发明提供了用于加工包含木质纤维素的生物质材料的方法，其包括(i)(a)提供包含本发明的多肽的组合物，且提供生物质材料；和(b)使包含本发明的多肽的组合物与生物质材料接触；(ii)(i)的方法，其中生物质材料包含或衍生自农业作物，或是食物或饲料生产的副产品，或是木质纤维素废品，或是植物残渣或废纸或废纸产品；(iii)(i)或(ii)的方法，其中多肽具有包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶例如α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶活性的活性；(iv)(ii)中任何一个的方法，其中植物残渣包含茎、叶、外壳、外皮、穗轴、木材、木片、木浆和锯屑，或者，纸废物包含丢弃或用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、便签纸、打字机纸、报纸、杂志、卡纸板和基于纸的包装材料；或(v)(i)-(iv)中任何一个的方法，其中生物质材料的加工产生生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇或生物柴油；(vi)(i)-(v)中任何一个的方法，其中生物质材料包含木质纤维素。
本发明提供了包含本发明的多肽的生物质材料。
本发明提供了用于制备生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇或生物柴油的方法，其包括(i)(a)提供本发明的多肽，且提供包含多糖或寡糖的组合物；和(b)使包含多糖或寡糖的组合物与本发明的多肽接触；(ii)(i)的方法，其中包含多糖或寡糖的组合物包含植物、植物产品或植物衍生物；(iii)(ii)的方法，其中植物或植物产品包含蔗糖植物或植物产品、甜菜根或甜菜、小麦、玉米、大豆、马铃薯、稻或大麦；(iv)(i)-(iii)中任何一个的方法，其中多肽具有包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶例如α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶活性的活性；或(v)(i)-(iv)中任何一个的方法，其中多糖或寡糖包含可发酵糖。
本发明提供了用于制备燃料的方法，其包括(i)(a)提供本发明的多肽，且提供包含可发酵糖的组合物；和(b)使包含可发酵糖的组合物与本发明的多肽接触；(ii)(i)的方法，其中包含可发酵糖的组合物包含植物、植物产品或植物衍生物；(iii)(ii)的方法，其中植物或植物产品包含蔗糖植物或植物产品、甜菜根或甜菜、小麦、玉米、大豆、马铃薯、稻或大麦；(iv)(i)-(iii)中任何一个的方法，其中多肽具有包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶例如α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶活性的活性；或(v)(i)-(iv)中任何一个的方法，其中燃料包含生物乙醇或汽油-乙醇混合物，或包含生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇或生物柴油。
本发明提供了燃料，其包含(a)本发明的多肽；(b)(a)的燃料，其中多肽具有包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶例如α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶活性的活性；(c)(a)或(b)的燃料，其中燃料衍生自植物材料，或燃料衍生自马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜根或甘蔗；或(d)(a)-(c)中任何一个的燃料，其中燃料包含生物乙醇或汽油-乙醇混合物，或包含生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇或生物柴油。
本发明提供了用于生产糖(例如，多糖)的方法，所述方法包括(i)(a)提供具有淀粉酶或葡糖淀粉酶活性的至少一种多肽；(b)提供包含多糖或寡糖的组合物；和(c)使步骤(b)的组合物与步骤(a)的多肽接触，从而产生糖；(ii)(i)的方法，其中包含多糖或寡糖的组合物包含淀粉；(iii)(i)或(ii)中任何一个的方法，其中多糖、寡糖和/或糖包含或是可发酵糖；(iv)(i)、(ii)或(iii)中任何一个的方法，其进一步包括使糖发酵以生产醇；或(v)(iv)的方法，其中醇是乙醇、丙醇或丁醇。
本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和下文说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点由于说明书和附图以及权利要求将是显而易见的。
本文引用的所有出版物、专利、专利申请、Genbank序列和ATCC保藏为了所有目的在此特别引入作为参考。
附图描述

图1是计算机系统的方框图。
图2是举例说明关于使新核苷酸或蛋白质序列与序列数据库比较的过程的一个方面的流程图，以便测定新序列和数据库中的序列之间的同源性水平。
图3是举例说明在计算机中用于测定2个序列是否是同源的过程的一个方面的流程图。
图4是举例说明用于检测序列中特征的存在的鉴别器过程300的一个方面的流程图。
图5举例说明用于液化糖化的本发明的示例性方法，如下文详细讨论的。
图6举例说明使用本发明的至少一种酶的本发明的示例性玉米湿磨过程，如下文详细讨论的。
图7、图8和图9举例说明可替代的示例性多糖例如淀粉加工方法(例如，工业过程)，如下文详细讨论的。
图10和图11举例说明在约pH 3.5-6.0中的pH对淀粉经由本发明的七(7)种葡糖淀粉酶和两(2)种淀粉酶的水解的影响，如下文详细讨论的。
图12举例说明本发明的酶如何可以用于通过干研磨来自玉米的醇生产中，包括其在“常规过程”和“同时液化糖化和发酵过程”中的使用，如下文详细讨论的。
图13、图14、图15、图16、图17、图18、图19和图20举例说明本发明的示例性酶在不同贮存缓冲液中的速率比较，如下文实施例1中详细讨论的。
图21举例说明显示示例性酶SEQ ID NO52经由胃蛋白酶的蛋白酶解结果的SDS PAGE；和图22举例说明SEQ ID NO52的这种胃蛋白酶消化中产生的肽的表征；和图23A举例说明用于SEQ ID NO52经由胃蛋白酶的蛋白酶解产生的肽的小肽分离方案；图23B举例说明小肽分离方案的SDS PAGE结果；图23C举例说明C18RP洗脱级分的LC/MS谱；图23D举例说明通过LCMS/MS分析鉴定的肽的序列；图23E和图23F举例说明在序列输出中的“Asn-Xaa-Ser/Thr”sequins(基序)(以蓝色突出显示)；预测为N联糖基化的天冬酰胺以红色突出显示，如下文实施例22中详细讨论的。
图24举例说明表1，其概括了比较经由本发明的示例性酶和基准酶黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶的颗粒状玉米淀粉和可溶性淀粉(糊精)水解的起始速率的数据，如下文实施例23中详细讨论的。
图25举例说明温度对示例性葡糖淀粉酶SEQ ID NO20和黑曲霉“基准”酶的活性的作用，用可溶性淀粉(糊精)作为底物，如下文实施例23中详细讨论的。
图26举例说明概括示例性酶纯化方案对本发明选择的酶的效率，以及尤其是比较纯化和未纯化的酶关于粗淀粉和可溶性淀粉的相应活性数据的表，如下文实施例18中详细讨论的。
图27举例说明CERALPHA α-淀粉酶测定操作的理论基础，如下文实施例27中详细讨论的。
图28A显示证实温度对例如本发明的示例性葡糖淀粉酶的活性的作用的数据，使用颗粒状淀粉作为底物，如下文实施例29中详细讨论的。
图28B显示证实温度对例如本发明的示例性葡糖淀粉酶的活性的作用的数据，使用可溶性淀粉(糊精)作为底物，如下文实施例29中详细讨论的。
图29A显示证实pH对例如本发明的示例性葡糖淀粉酶的活性的作用的数据，使用颗粒状淀粉作为底物，如下文实施例29中详细讨论的。
图29B显示证实pH对例如本发明的示例性葡糖淀粉酶的活性的作用的数据，使用可溶性淀粉(糊精)作为底物，如下文实施例29中详细讨论的。
图30显示证实温度对经由所表征的α-淀粉酶的淀粉水解的作用的数据，如下文实施例29中详细讨论的。
图31A显示证实pH对本发明的示例性α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的活性的作用的数据，使用颗粒状淀粉作为底物，如下文实施例29中详细讨论的。
图31B显示证实pH对本发明的示例性α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的活性的作用的数据，使用可溶性淀粉作为底物，如下文实施例29中详细讨论的。
各图中的相似参考符号指相似元素。
详述 本发明提供了淀粉酶例如α淀粉酶，编码酶的多核苷酸，以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。本发明涉及具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性例如α-淀粉酶活性的新多肽，编码其的核酸和与其结合的抗体。本发明的多肽可以在各种诊断、治疗和工业背景中使用。本发明的多肽可以用作例如添加剂，用于洗涤剂、用于加工食物和用于利用可逆反应的化学合成。此外，本发明的多肽可以用于织品处理、醇生产中，并且用作关于食物或动物饲料的添加剂。
在一个方面，本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在高和/或低温下是有活性的，或在广泛温度范围下是有活性的。例如，它们在20℃-90℃、30℃-80℃、或40℃-70℃的温度中可以是有活性的。本发明还提供了在碱性pHs或酸性pHs例如低水酸性下具有活性的淀粉酶。在可替代方面，本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在低至pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5、pH 4.0和pH 3.5的酸性pH s下可以具有活性。在可替代方面，本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在高至pH 8、pH 9.5、pH 10、pH 10.5和pH 11的碱性pH s下可以具有活性。在一个方面，本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在约40℃-约70℃的温度中在低水分活性(低含水量)的条件下是有活性的。例如，本发明提供了在低温下，例如约30℃-40℃；在低pH下，例如约pH 3.5-pH 6.0；以及在低温和低pH下，例如约30℃-40℃和在约pH 3.5-pH 6.0的低pH下，具有水解多糖、寡糖或淀粉例如颗粒状淀粉(包括粗颗粒状淀粉)的能力的淀粉酶，包括葡糖淀粉酶。
本发明还提供了用于进一步修饰本发明的示例性淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的方法，以产生具有所需性质的蛋白质。例如，通过本发明的方法产生的淀粉酶可以具有改变的酶活性、热稳定性、pH/活性谱、pH/稳定性谱(例如，在低例如pH＜6或pH＜5或高例如pH＞9的pH值下增加的稳定性)、对于氧化的稳定性、Ca2+依赖性、比活性等。本发明为改变任何目的性质作准备。例如，改变可以导致这样的变体，与亲本酶比较，其具有改变的酶促活性、或pH或温度活性谱。
产生和处理核酸 在一个方面，本发明提供了分离的、合成或重组核酸，其包含在至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个或更多残基的区域上，与本发明的示例性核酸具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多、或完全(100％)序列同一性的核酸序列。在一个方面，核酸编码具有淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性例如α淀粉酶活性的至少一种多肽。
本发明的“合成”核酸(包括寡核苷酸)、多肽或蛋白质包括通过任何化学合成制备的那些，例如如下所述的。
短语“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸、或这些中任何一个的片段，基因组、重组或合成起源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是单链或双链的且可以表示有义或反义链，肽核酸(PNA)、或天然或合成起源的任何DNA样或RNA样材料，包括例如iRNA例如miRNA或siRNA，核糖核蛋白(例如iRNPs)。该术语包括包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。该术语还包含具有合成主链的核酸样结构，参见例如，Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 368692-8698；Samstag(1996)Antisense NucleicAcid Drug Dev 6153-156。
本发明提供了“重组”和合成核酸，其可以包括和它在其自然环境中与之不相邻的“主链”核酸相邻的核酸。在一个方面，核酸表示核酸“主链分子”的群体中5％或更多数目的核酸插入片段。根据本发明的“主链”分子包括核酸，例如表达载体、自主复制核酸、病毒、整合核酸、或用于维持或处理目的核酸插入片段的其他载体或核酸。在一个方面，富集的核酸表示重组主链分子的群体中50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多数目的核酸插入片段。“重组”多肽或蛋白质指通过重组DNA技术生产的多肽或蛋白质；例如通过编码所需多肽或蛋白质的外源DNA构建体转化的细胞生产的。
“寡核苷酸”包括单链多聚脱氧核苷酸或2条互补的多聚脱氧核苷酸链，其可以是化学合成的(即，作为合成核酸)。在可替代实施方案中，本发明的合成核酸和寡核苷酸不具有5′磷酸，且因此在激酶的存在下，将不与另一种寡核苷酸连接，用ATP不添加磷酸。在可替代实施方案中，合成寡核苷酸可以与未脱去磷酸的片段连接。
术语“基因”包括包含涉及产生转录产物(例如，信使)的DNA区段的核酸序列，其依次进行翻译以产生多肽链，或调节基因转录、复制或稳定性。基因可以包括在编码区前和后的区域，例如前导区和尾部、启动子和增强子、以及可应用时在单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本发明提供了编码本发明的多肽的分离的和重组核酸，包括表达盒例如表达载体。本发明提供了包含本发明的核酸或由本发明的核酸组成的探针。本发明还包括使用本发明的核酸用于发现新淀粉酶序列的方法。本发明还包括使用本发明的核酸用于抑制淀粉酶基因、转录物和多肽的表达的方法。还提供了通过例如合成连接重新装配、优化定向进化系统和/或基因位点饱和诱变(GSSM)修饰本发明的核酸的方法。
本发明的核酸可以通过例如cDNA文库的克隆和表达、经由PCR扩增信使或基因组DNA等进行制备、分离和/或处理。在实践本发明的方法中，同源基因可以通过处理模板核酸进行修饰，如本文所描述的。本发明可以与本领域已知的任何方法或方案或装置结合进行实践，其在科学和专利文献中充分描述。
一般技术 用于实践本发明的核酸，无论是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒还是其杂交物，都可以从各种来源进行分离、基因工程、扩增和/或重组表达/产生。由这些核酸产生的重组多肽可以个别地进行分离或克隆，且就所需活性进行测试。可以使用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
本发明提供了用于优化编码淀粉酶和酶的核酸序列例如制备“变体序列”的方法，其包括本发明的序列的使用，使用例如“饱和诱变”或“GSSM”(包括使用简并寡核苷酸引物以将点突变引入多核苷酸内的方法，如下文详细描述的)；“优化定向进化系统”或“优化定向进化”(包括用于重新装配相关核酸序列的片段例如相关基因的方法，且在下文详细说明)和/或“合成连接重新装配”或“SLR”(包括以非随机化方式连接寡核苷酸片段的方法，且在下文详细说明)。“变体”包括在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基(分别地)处修饰的本发明的多核苷酸或多肽，仍保留本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的生物活性。变体可以通过任何方法进行生产，包括方法例如易错PCR、改组、寡核苷酸定向的诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归总体诱变、指数总体诱变、位点特异性诱变、基因重新装配、GSSM及其任何组合。本文提供了用于产生例如与本发明的示例性酶不同的、在pH或温度下具有活性的变体淀粉酶的技术。
本发明的核酸可以是完全或部分合成的，并且在可替代方面，它们可以通过众所周知的化学合成技术进行体外合成，如例如Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic AcidsRes.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.68109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；美国专利号4,458,066中描述的。
用于核酸处理，例如亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶的随机引物标记、缺口翻译、扩增)、测序、杂交等的技术在科学和专利文献中充分描述，参见例如，Sambrook，编辑，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL(2ND ED.)，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory，(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Ausubel，编辑John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULARBIOLOGYHYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，编辑Elsevier，N.Y.(1993)。
获得和处理用于实践本发明的方法的核酸的另一种有用方式是从基因组样品中克隆，以及需要时，筛选且再克隆从例如基因组克隆或cDNA克隆中分离或扩增的插入片段。在本发明的方法中使用的核酸的来源包括在下述中包含的基因组或cDNA文库，例如哺乳动物人工染色体(MACs)，参见例如，美国专利号5,721,118；6,025,155；人类人工染色体，参见例如，Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，参见例如，Woon(1998)Genomics 50306-316；P1衍生载体(PAC)，参见例如，Kern(1997)Biotechniques 23120-124；粘粒、重组病毒、噬菌体或质粒。
在一个方面，编码本发明的多肽的核酸在合适的阶段装配有前导序列，其能够指导翻译多肽或其片段的分泌。
本发明提供了融合蛋白和编码其的核酸。本发明的多肽可以与异源肽或多肽融合，例如赋予所需特征例如增加的稳定性或简化的纯化的N末端鉴定肽。本发明的肽和多肽也可以作为融合蛋白进行合成且表达，所述融合蛋白具有与之连接的一个或多个另外的结构域，用于例如产生更有免疫原性的肽，以更容易地分离重组合成的肽，鉴定且分离抗体和表达抗体的B细胞等。检测和纯化促进结构域包括例如，允许在固定金属上纯化的金属螯合肽例如多组氨酸束和组氨酸-色氨酸分子，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域，和在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)中使用的结构域。在纯化结构域和含肽或多肽基序之间包括可切割的接头序列，例如因子Xa或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)，以促进纯化。例如，表达载体可以包括编码与6组氨酸残基连接的表位核酸序列，随后为硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(参见例如，Williams(1995)Biochemistry 341787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12404-414)。组氨酸残基促进检测和纯化，而肠激酶切割位点提供用于纯化来自融合蛋白的其余部分的表位的方法。与编码融合蛋白的载体和融合蛋白的应用有关的技术在科学和专利文献中充分描述，参见例如，Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12441-53。
转录和翻译控制序列 本发明提供了与一种或多种表达(例如，转录或翻译)控制序列可操作地连接的本发明的核酸(例如，DNA)序列，例如启动子或增强子，以指导或调节RNA合成/表达。用于实践本发明的启动子包括能够驱动编码序列在细胞例如植物细胞中的转录的所有序列。因此，在本发明的构建体中使用的启动子包括顺式作用的转录控制元件和调节序列，其涉及调节或调整基因的转录时间选择和/或转录率。例如，用于实践本发明的启动子可以是顺式作用的转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5′和3′非翻译区、或涉及转录调节的内含子序列。这些顺式作用序列一般与蛋白质或其他生物分子相互作用，以进行(开始/关闭、调节、调整等)转录。用于实践本发明的“组成型”启动子可以是在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下驱动连续表达的那些。用于实践本发明的启动子可以是在环境条件或发育条件的影响下，指导本发明的核酸表达的“诱导型”或“调节型”启动子。可以影响经由诱导型启动子的转录的环境条件例子包括缺氧条件、升高的温度、干旱或光的存在。
在一个实施方案中，启动子序列可以与本发明的编码序列“可操作地连接”，例如当在启动子下起始转录的RNA聚合酶使编码序列转录成mRNA时。
用于实践本发明的启动子包括“组织特异性”启动子，其是仅在特定细胞或组织或器官中例如在植物或动物中有活性的转录控制元件。组织特异性调节可以通过某些内因素来达到，所述内因素确保编码对于给定组织特异的蛋白质的基因表达。此种因素已知存在于哺乳动物和植物中，以便允许特定组织发育。
用于实践本发明的一种或多种表达控制序列可以在表达载体中。示例性细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。示例性真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTRs、和小鼠金属硫蛋白I。适合于在细菌中表达多肽的启动子包括大肠杆菌(E.coli)lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子、λPL启动子、来自编码糖酵解酶例如3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)的操纵子的启动子、和酸性磷酸酶启动子。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热休克启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTRs、和小鼠金属硫蛋白I启动子。也可以使用已知控制基因在原核或真核细胞或其病毒中的表达的其他启动子。
组织特异性植物启动子 本发明提供了这样的表达盒，其可以以组织特异性方式进行表达，例如其可以以组织特异性方式表达本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。本发明还提供了以组织特异性方式表达本发明的淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的植物或种子。组织特异性可以是种子特异性、茎特异性、叶特异性、根特异性、果实特异性等。
在一个方面，组成型启动子例如CaMV 35S启动子可以用于在植物或种子的特定部分或者植物各处中表达。例如，对于超表达，可以使用植物启动子片段，其将指导核酸在植物例如再生植物的某些或所有组织中的表达。此种启动子在本文中称为“组成型”启动子，并且在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下有活性。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、衍生自根瘤土壤杆菌的T-DNA的1′-或2′-启动子、和本领域技术人员已知的来自各种植物基因的其他转录起始区。此种基因包括，例如来自拟南芥属的ACT11(Huang(1996)Plant Mol.Biol.33125-139)；来自拟南芥属的Cat3(GenBank编号U43147，Zhong(1996)Mol.Gen.Genet.251196-203)；来自欧洲油菜的编码硬脂酰-酰基载体蛋白质去饱和酶的基因(Genbank编号X74782，Solocombe(1994)Plant Physiol.1041167-1176)；来自玉蜀黍的GPcl(GenBank编号X15596；Martinez(1989)J.Mol.Biol 208551-565)；来自玉蜀黍的Gpc2(GenBank编号U45855，Manjunath(1997)Plant Mol.Biol.3397-112)；在美国专利号4,962,028；5,633,440中描述的植物启动子。
本发明使用衍生自病毒的组织特异性或组成型启动子，其可以包括例如烟草花叶病毒属亚基因组启动子(Kumagai(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 921679-1683；水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)，其仅在受感染的稻植物中的韧皮部细胞中复制，其启动子驱动强韧皮部特异性报道基因表达；木薯叶脉花叶病毒(CVMV)启动子，在脉管元件、叶肉细胞和根尖中具有最高活性(Verdaguer(1996)Plant Mol.Biol.311129-1139)。
可替代地，植物启动子可以指导淀粉酶表达核酸在特定组织、器官或细胞类型中的表达(即组织特异性启动子)，或可以另外处于更精确的环境或发育控制下或者诱导型启动子控制下。可以影响转录的环境条件例子包括缺氧条件、升高的温度、光的存在或用化学制品/激素喷射。例如，本发明掺入玉蜀黍的干旱诱导型启动子(Busk(1997)同上)；来自马铃薯的冷、干旱和高盐诱导型启动子(Kirch(1997)Plant Mol.Biol.33897909)。
组织特异性启动子仅在那个组织内在发育阶段的某个时帧内促进转录。参见，例如，表征拟南芥属LEAFY基因启动子的Blazquez(1998)Plant Cell 10791-800。还参见描述转录因子SPL3的Cardon(1997)Plant J 12367-77，其识别在拟南芥花的分生组织鉴定基因AP1的启动子区中的保守序列基序；和描述分生组织启动子eIF4的Mandel(1995)Plant Molecular Biology，第29卷，第995-1004页。可以使用在特定组织的生活周期自始至终有活性的组织特异性启动子。在一个方面，本发明的核酸与主要仅在棉花纤维细胞中有活性的启动子可操作地连接。在一个方面，本发明的核酸与主要在棉花纤维细胞延长阶段过程中有活性的启动子可操作地连接，例如，如由Rinehart(1996)同上描述的。核酸可以与Fbl2A基因启动子可操作地连接，以在棉花纤维细胞中优先表达(同前)。还参见描述棉花纤维特异性启动子和用于构建转基因棉花植物的方法的John(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895769-5773；John，等人，美国专利号5,608,148和5,602,321。根特异性启动子也可以用于表达本发明的核酸。根特异性启动子的例子包括来自醇脱氢酶基因的启动子(DeLisle(1990)Int.Rev.Cytol.12339-60)。可以用于表达本发明的核酸的其他启动子包括例如，胚珠特异性、胚芽特异性、胚乳特异性、外壳特异性、种皮特异性启动子、或其某些组合；叶特异性启动子(参见例如，描述玉蜀黍中的叶特异性启动子的Busk(1997)Plant J.1112851295)；来自毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的ORF13启动子(其显示在根中的高活性，参见例如，Hansen(1997)同上)；玉蜀黍花粉特异性启动子(参见例如，Guerrero(1990)Mol.Gen.Genet.224161168)；可以使用在果实催熟、叶以及至较少程度的花枯萎和脱落过程中有活性的番茄启动子(参见，例如，Blume(1997)PlantJ.12731746)；来自马铃薯SK2基因的雌蕊特异性启动子(参见例如，Ficker(1997)Plant Mol.Biol.35425431)；来自豌豆的Blec4基因，其在转基因苜蓿的营养和花梗端的表皮组织中有活性，使得其成为使外源基因的表达靶向活跃生长的芽或纤维的表皮层的有力工具；胚珠特异性BEL1基因(参见例如，Reiser(1995)Cell 83735-742，GenBank编号U39944)；和/或，描述植物启动子区的美国专利号5,589,583，Klee中的启动子能够在分生组织和/或快速分裂细胞中赋予高转录水平。
可替代地，在暴露于植物激素例如植物生长素后可诱导的植物启动子用于表达本发明的核酸。例如，本发明可以使用大豆(大豆(Glycine max L.))中的植物生长素应答元件E1启动子片段(AuxREs)(Liu(1997)Plant Physiol.115397-407)；植物生长素应答性拟南芥属GST6启动子(也响应水杨酸和过氧化氢)(Chen(1996)PlantJ.10955-966)；来自烟草的植物生长素诱导型parC启动子(Sakai(1996)37906-913)；植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10933-937)；和响应应激激素脱落酸的启动子(Sheen(1996)Science 2741900-1902)。
本发明的核酸也可以与在暴露于化学试剂后可诱导的植物启动子可操作地连接，所述化学试剂可以应用于植物，例如除草剂或抗生素。例如，可以使用由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant Cell Physiol.38568-577)；不同除草剂安全剂的应用诱导不同的基因表达模式，包括在根、排水器和芽顶端分生组织中的表达。编码序列可以处于例如四环素诱导型启动子的控制下，例如如用包含燕麦(Avena sativa L.)(燕麦)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物描述的(Masgrau(1997)Plant J.11465-473)；或，水杨酸应答元件(Stange(1997)Plant J.111315-1324)。使用以化学方法(例如激素或杀虫剂)诱导的启动子，即，响应可以在田间应用于转基因植物的化学制品的启动子，本发明的多肽的表达可以在植物的特定发育阶段时诱导。因此，本发明还提供了包含编码本发明的多肽的可诱导基因的转基因植物，其宿主范围限制于在农作物的任何发育阶段时可诱导的转基因植物物种，例如玉米、稻、大麦、小麦、马铃薯、甘蔗、甜菜或其他农作物。
技术人员应认识到组织特异性植物启动子可以驱动可操作地连接的序列在除靶组织外的组织中表达。因此，组织特异性启动子是驱动优先在靶组织或细胞类型中的表达，但也可以导致同样在其他组织中的某些表达的启动子。
本发明的核酸也可以与在暴露于化学试剂后可诱导的植物启动子可操作地连接。这些试剂包括例如可以应用于例如喷射在转基因植物上的除草剂、合成植物生长素、或抗生素。本发明的淀粉酶生产核酸的可诱导表达将允许栽培者选择具有最佳淀粉/糖比率的植物。因此可以控制植物部分的发育。这样，本发明提供了促进植物和植物部分的收获的方法。例如，在各种实施方案中，使用由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant Cell Physiol.38568-577)；不同除草剂安全剂的应用诱导不同的基因表达模式，诱导在根、排水器和芽顶端分生组织中的表达。本发明的编码序列也处于四环素诱导型启动子的控制下，例如如用包含燕麦(燕麦)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物描述的(Masgrau(1997)Plant J.11465-473)；或，水杨酸应答元件(Stange(1997)Plant J.111315-1324)。
如果需要适当的多肽表达，那么应包括在编码区的3′末端处的多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可以衍生自天然基因，各种其他植物基因，或土壤杆菌属T-DNA中的基因。
本发明提供了包含与转录调节剂“可操作地连接的”本发明的任何序列的“表达盒”；例如其中如本文所使用的，“可操作地连接的”指2个或更多核酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。一般地，它指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，启动子与编码序列例如本发明的核酸可操作地连接，如果它刺激或调节编码序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中的转录。一般地，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列一般与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，某些转录调节序列例如增强子无需与它们增强其转录的编码序列在物理上邻接，或位于它们增强其转录的编码序列附近。
编码序列和相邻序列的修饰 衍生自异种来源的基因在植物中的转基因表达可以涉及这些基因的修饰，以达到且优化其在植物中的表达。特别地，编码分开的酶但在天然微生物中由相同转录物编码的细菌ORFs在分开的转录物上在植物中最佳表达。为了达到这点，每个细菌ORF单独地进行分离，且克隆在这样的盒内，所述盒提供在ORF的5′末端处的植物启动子序列和在ORF的3′末端处的植物转录终止子。分离的ORF序列优选包括起始ATG密码子和终止STOP密码子，但可以包括除起始ATG和STOP密码子外的另外序列。此外，ORF可以是截短的，但仍保留所需活性；对于特别长的ORFs，保留活性的截短形式可以优选用于在转基因生物中表达。“植物启动子”和“植物转录终止子”意指在植物细胞内起作用的启动子和转录终止子。这包括可以衍生自非植物来源例如病毒(例子是花椰菜花叶病毒)的启动子和转录终止子。
在某些情况下，不需要对于ORF编码序列和相邻序列的修饰。分离包含目的ORF的片段且将其插入植物启动子的下游就足够了。例如，Gaffney等人(Science 261754-756(1993))已在转基因植物中在CaMV 35S启动子和CaMV tml终止子的控制下成功地表达假单胞菌属(Pseudomonas)nahG基因，而无需编码序列的修饰，和具有仍附着的假单胞菌属基因ATG下游的核苷酸，并且STOP密码子下游的核苷酸仍与nahG ORF附着。优选地应留下尽可能少的相邻微生物序列与ATG的上游和STOP密码子的下游附着。在实践中，此种构建可以依赖限制位点的可用性。
在其他情况下，衍生自微生物来源的基因的表达可能提供表达的问题。这些问题已在本领域中充分表征，并且对于衍生自某些来源例如芽孢杆菌属(Bacillus)的基因特别常见。这些问题可能应用于本发明的核苷酸序列，并且这些基因的修饰可以使用本领域目前众所周知的技术来实现。可能遇到下述问题 密码子使用 植物中的优选密码子使用不同于某些微生物中的优选密码子使用。在克隆的微生物ORF内的密码子使用与植物基因(并且特别是来自靶植物的基因)中的使用的比较将使得能够鉴定在ORF内应优选改变的密码子。一般地植物进化已趋向在单子叶植物的第三个碱基位置中的核苷酸C和G的强偏爱，而双子叶植物通常在这个位置处使用核苷酸A或T。通过修饰基因以掺入关于特定靶转基因物种的优选密码子使用，将克服下文描述的关于GC/AT含量和不正常剪接的许多问题。
GC/AT含量 植物基因一般具有超过35％的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列在植物中可以造成几个问题。首先，ATTTA基序被认为造成信使的去稳定作用，并且在许多短命mRNAs的3′末端处发现。其次，多腺苷酸化信号例如AATAAA在信使内不合适位置处的出现被认为造成转录的过早平截。此外，单子叶植物可能识别AT富含序列作为剪接位点(参见下文)。
与起始甲硫氨酸相邻的序列 植物不同于微生物之处在于它们的信使不具有限定的核糖体结合位点。相反，认为核糖体与信使的5′末端附着且扫描第一个可用的ATG，在其上起始翻译。然而，认为存在与ATG相邻的某些核苷酸的优先选择，并且微生物基因的表达可以通过在ATG处包括真核共有翻译起始子得到增强。Clontech(1993/1994 catalog，page 210)已提出一个序列作为关于大肠杆菌uidA基因在植物中的表达的共有翻译起始子。此外，Joshi，N.A.R.156643-6653(1987)已比较与ATG相邻的许多植物序列，并且提出另一个共有序列。在其中微生物ORFs在植物中的表达遇到困难的情况下，这些序列之一在起始ATG处的包括可以改善翻译。在此种情况下，由于它们第二个AA残基的修饰，共有区的最后3个核苷酸可能不适合于包括在修饰序列中。与起始甲硫氨酸相邻的优选序列在不同植物物种之间可能不同。位于Genbank数据库中的14种玉蜀黍基因的研究提供下述结果 在14种玉蜀黍基因中在起始ATG前的位置 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 C3846256010 7 T3034321110 A2314323723 G6360654615 这种分析可以对于核苷酸序列引入其内的所需植物物种进行，并且与ATG相邻的序列进行修饰以掺入所需核苷酸。
不正常剪接位点的去除 从非植物来源克隆且未对于植物中的表达优化的基因也可以包含这样的基序，所述基序可以在植物中作为5′或3′剪接位点被识别，并且可以被切割，从而产生截短的或缺失的信使。这些位点可以使用本领域众所周知的技术进行去除。
用于修饰编码序列和相邻序列的技术是本领域众所周知的。在其中微生物ORF的起始表达很低且如上所述对序列进行改变视为合适的情况下，合成基因的构建随后可以根据本领域众所周知的方法来完成。这些例如在公开的专利公开EP 0385962(Monsanto)、EP 0359472(Lubrizol)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)中描述。在大多数情况下，优选在其转移至转基因植物前使用瞬时测定方案(这是本领域众所周知的)测定基因构建体的表达。
植物启动子 本发明的组合物可以包含用于在目的植物中转化和表达的核酸序列。核酸序列可以存在于DNA构建体或表达盒中。在可替代实施方案中，如本文所使用的，“表达盒”意指这样的核酸分子，其能够指导特定核苷酸序列在合适的宿主细胞中的表达，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述启动子与终止信号可操作地连接。一般还包含核苷酸序列的正确翻译所需的序列。编码区通常编码目的蛋白质，但也可以在有义或反义方向上编码目的功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指它的至少一个组分就它的至少一个其他组分而言是异源的。表达盒还可以是天然存在，但以用于异源表达的重组形式获得的那种。在可替代实施方案中，表达盒就宿主而言是异源的，即，表达盒的特定DNA序列在宿主细胞中未天然存在，并且必须已通过转化事件引入宿主细胞或宿主细胞的祖先内。表达盒中的核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于某些特定外刺激时起始转录。在可替代实施方案中，启动子也可以对于特定组织或器官或发育阶段特异。
本发明包含用能够表达多核苷酸的表达盒转化植物。在可替代实施方案中，表达盒将以转录的5′-3′方向包括转录和翻译起始区(即启动子)和目的多核苷酸。表达盒可以另外包含在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。在某些实施方案中，表达盒包含可选标记基因，以允许选择稳定转化体。本发明的表达构建体也可以包含前导序列和/或允许目的多核苷酸的可诱导表达的序列。关于允许可诱导表达的序列例子，参见，Guo等人(2003)Plant J.34383-92和Chen等人(2003)Plant J.36731-40。
在可替代实施方案中，表达构建体的调节序列与目的多核苷酸可操作地连接。“可操作地连接”意指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列起始且介导相应于第二序列的DNA序列的转录。在可替代实施方案中，可操作地连接意指被连接的核苷酸序列是邻接的。
能够在目的植物中驱动表达的任何启动子可以在本发明的实践中使用。启动子对于植物宿主可以是天然的或相似的或外来的或异源的。在可替代实施方案中，在本文中用于指核酸序列(例如DNA或RNA序列)或基因时，术语“异源的”和“外源的”指源于对于特定宿主细胞外来的来源的序列，或如果来自相同来源，根据其原始形式而被修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞内源但已进行修饰的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语指这样的DNA区段，其对于细胞是外来或异源的，或者如果对于细胞是同源的，但位于宿主细胞核酸内的所述元件通常未发现的位置中。外源DNA区段进行表达以产生外源多肽。
在可替代实施方案中，“同源”核酸(例如DNA)序列是与它引入其内的宿主细胞天然相关的核酸(例如DNA或RNA)序列。
待包括的启动子的选择可以依赖几个因素，包括但不限于，效率、可选择性、诱导性、所需表达水平、和细胞或组织优先表达。对于本领域技术人员而言，通过相对于那种序列适当地选择且放置启动子和其他调节区来调节序列的表达是常规事件。
在可替代实施方案中，合适的启动子仅在某些细胞类型中或主要在某些细胞类型中起始转录。因此，如本文所使用的，细胞类型或组织优选启动子是驱动优先在靶组织中的表达，但也可以导致同样在其他细胞类型或组织中的某些表达的启动子。用于鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区的方法包括，例如下述参考文献中描述的那些Jordano，等人，Plant Cell，1855-866(1989)；Bustos，等人，Plant Cell，1839-854(1989)；Green，等人，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，等人，Plant Cell，3，309-316(1991)；和Zhang，等人，Plant Physiology 1101069-1079(1996)。
在可替代实施方案中，可以使用已在植物中报告的植物优先的调节基因和/或启动子。在可替代实施方案中可以使用的报告的组织优选基因包括编码种子贮藏蛋白(例如napin、cruciferin、β-伴大豆球蛋白和菜豆球蛋白、醇溶谷蛋白、谷蛋白、球蛋白和玉米醇溶蛋白)玉米醇溶蛋白或油体蛋白(例如油质蛋白)的基因，或涉及脂肪酸生物合成的基因(包括酰基载体蛋白质、硬脂酰-ACP去饱和酶、和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))，和在胚发育过程中表达的其他基因(例如Bce4，参见例如，EP 255378和Kridl等人，(1991)Seed ScienceResearch，1209)。已得到描述的、可以用于实践本发明的组织特异性启动子的例子包括凝集素(Vodkin，Prog.Clin.Biol.Res.，138；87(1983)；Lindstrom等人，(1990)Der.Genet.，11160)、玉米醇脱氢酶1(Dennis等人，Nucleic Acids Res.，123983(1984))、玉米获光复合物(参见例如，Simpson，(1986)Science，23334；Bansal(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893654)、玉米热休克蛋白(参见例如，Odell等人，(1985)Nature，313810；豌豆小亚基RuBP羧化酶(参见例如，Poulsen等人，(1986)Mol.Gen.Genet.，205193-200；Cashmore等人，(1983)Gen.Eng.of Plants，Plenum Press，New York，29-38)；Ti质粒甘露碱合酶(参见例如，Langridge等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863219-3223)，Ti质粒胭脂碱合酶(Langridge等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863219-3223)、牵牛花查尔酮异构酶(参见例如，vanTunen(1988)EMBO J.71257)；豆甘氨酸富含蛋白质1(参见例如，Keller(1989)Genes Dev.31639)；截短的CaMV 35s(参见例如，Odell(1985)Nature 313810)；马铃薯patatin(参见例如，Wenzler(1989)Plant Mol.Biol.13347；根细胞(参见例如，Yamamoto(1990)Nucleic Acids Res.187449)；玉蜀黍玉米醇溶蛋白(参见例如，Reina(1990)Nucleic Acids Res.186425；Lopes等人(1995)Mol.Gen.Genet.247603-613；Kriz(1987)Mol.Gen.Genet.20790；Wandelt(1989)Nucleic AcidsRes.，172354；Langridge(1983)Cell，341015；Reina(1990)Nucleic Acids Res.，187449)，ADP-gpp promoter(参见例如，美国专利号7,102,057)；球蛋白-1(参见例如，Belanger(1991)Genetics 129863)；α-球蛋白(Sunilkumar，等人(2002)，Transgenic Res.11347-359)；α-微管蛋白；cab(参见例如，Sullivan(1989)Mol.Gen.Genet.，215431)；PEPCase(参见例如，Hudspeth & Grula，(1989)Plant Molec.Biol.，12579-589)；R基因复合物相关启动子(Chandler等人，(1989)Plant Cell，11175)；豌豆豌豆球蛋白启动子(Czako等人，(1992)Mol.Gen.Genet.，23533；美国专利号5,625,136)；GTL1启动子(Takaiwa等人(1991)Plant Mol.Biol.16(1)，49-58)；查尔酮合酶启动子(Franken等人，(1991)EMBO J.，102605)；和/或GY1启动子(Sims & Goldburg(1989)Nuc.Acid Res.17(11)4368)等。
在可替代实施方案中，使用在通过果实发育的对立(antithesis)时或期间至少直至成熟开始表达的一类果实优先启动子，例如在U.S.4,943,674中讨论的。关于聚半乳糖醛酸酶基因的启动子在果实成熟中是有活性的。还可以使用聚半乳糖醛酸酶基因，例如如美国专利号4,535,060、美国专利号4,769,061、美国专利号4,801,590和美国专利号5,107,065中描述的。
可以使用的组织优选启动子的其他例子包括这样的启动子，其在对叶的损害(例如来自咀嚼式昆虫)后的叶细胞、微管(例如，patatin基因启动子)和纤维细胞(发育调节的纤维细胞蛋白质例子E6(John& Crow(1992)PNAS 895769-5773)中指导表达。E6基因在纤维中最有活性，尽管在叶、胚珠和花中发现低水平的转录。
在可替代实施方案中，可以使用在光合组织中有活性的启动子，以便在绿色组织例如叶和茎中驱动转录；这些启动子是合适的，当它们仅在此种组织中或主要在此种组织中驱动表达时。在可替代实施方案中，启动子可以赋予在植物各处组成地表达，或就绿色组织而言差异地表达，或就其中表达发生的绿色组织的发育阶段而言、或响应外刺激而差异地表达。
可以用于实践本发明的启动子的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，例如来自美洲落叶松(美洲落叶松(Larixlaricina))的RbcS启动子、松树cab6启动子(Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35773-778)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等人(1990)Plant Mol.Biol.15921-932)、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等人(1994)Plant Physiol.104997-1006)、来自稻的cab1R启动子(Luan等人(1992)Plant Cell4971-981)、来自玉米的丙酮酸磷酸盐双激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 909586-9590)、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等人(1997)Plant Mol.Biol.33245-255)、拟南芥SUC2蔗糖-H+共运输体启动子(Truernit等人(1995)Planta196564-570)、和来自菠菜的类囊体膜蛋白质启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS。在茎、叶和绿色组织中驱动表达的其他启动子在美国专利
发明者M·斯鲁普斯卡, G·哈兹莱伍德, C·常, P·卢津布尔, E·布尔克, M·卡尤特, U·古纳瓦德纳, M·盖瑟弥安, A·斯韦尔斯通, 燕 张 申请人:范恩尼姆公司, 先正达参股股份有限公司