专利名称：用于在细菌细胞中表达基因的修饰型信使rna稳定化序列的制作方法
用于在细菌细胞中表达基因的修饰型信使RNA稳定化序列 涉M列表
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背景技术：
发明领域
本发明涉及在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法。本发 明还涉及分离的修饰型mRNA力。工/稳定化序列(modified mRNA processing/stabilizing sequence),还涉及核酸构建体、载体和宿主细胞,其包 含与用于表达多核苦酸序列的启动子区可操作地连接的所述修饰型mRNA 加工/稳定化序列，所述多核苷酸序列编码具有生物学活性的多肽序列。
相关技术描述
具有生物学活性的天然或异源多肽在细菌宿主细胞，特别是芽孢杆菌属 CBad/Zw力细胞中的重组生产可为以适合商用的量(commercially relevant quantities)生产物质提供一种更理想的手段(vehicle)。
具有生物学活性的天然或异源多肽的重组生产通过构建表达盒 (expression cassette)来完成，在所述表达盒中将编码所述多肽的DNA置于启 动子的表达调控之下，所述启动子是>^人受调节的基因切下的，适合用于所述 宿主细胞。将表达盒导入宿主细胞，通常通过质粒介导的转化进行。然后多 肽的产生通过在表达盒中所含启动子正确发挥功能所必需的诱导条件下培 养经转化的宿主细胞来实现。
翻译起始频率、密码子选择和RNA二级结构是影响细菌中mRNA稳定 性的因素(Rignier和Arraiano, 2000,历oawap 22: 235-244; Steege, 2000,7 iV」6: 1079-1090)。在枯草芽孢杆菌CBacz7/w wto'fc)中，mRNA稳定性受到在5'-非翻译区处核糖体停顿(stalling)的影响。例如，发现枯草芽孢杆菌碱性蛋白 酶基因("/^￡)的稳定性由于基因前导区中存在核糖体结合位点 (Shine-Dalgarno序列)而在枯草芽孢杆菌中具有大约25分钟的长半衰期 (Hambraeus等，2002， MfcraWo/ogy 148: 1795-1803)。在16S核糖体RNA的 3'-OH端的Shine-Dalgarno序列的互补性决定了核糖体亚单位和mRNA之间 的亲和力。已经报导了核糖体亚单位固定于5'-UTR是枯草芽孢杆菌中mRNA 稳定性的诱导者(Sharp和Bechhofer, 2003, /丑a"enb/ogy 173: 4952-4958)。 已经4是出4皮称作稳定子序歹'J (stabilizer sequence)的Shine-Dalgamo才羊序列在 5'-UTR中的存在是引起针对基因的高mRNA稳定性的原因之一 (Agaisse和Lereclus, 1996, i^fo/. MifcraWo/. 20: 633-643)。美国专利Nos. 6，255，076和5,955,310描述了使用c^y/tt4 mRNA稳定子序列用于改进酶在芽 孢杆菌属细胞中的表达的用途。Daguer等，2005， Zw M&ra&o/ogv 41: 221-226描述了增加转录物的稳定性可改进枯草芽孢 杆菌中的果聚糖蔗糖酶产生。
在本领域中提供新方法用于转录稳定化以改进细菌宿主菌林表达的多 肽的水平将是有利的。
本发明涉及改进的在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法。
发明概述
本发明涉及在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包括 (a)在有益于产生所述具有生物学活性的多肽的培养基中培养细菌宿主细胞， 其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含启动子区，该启 动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核苦S臾序列和位于所述启动子区下 游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核香酸序列核糖体结合位点(RBS) 上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA 加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸 序列的更高的表达；和(b)从培养基分离所述具有生物学活性的多肽。
本发明还涉及包含核酸构建体的细菌宿主细胞，所述核酸构建体包含启 动子区，该启动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核普酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苦酸序列核糖体
结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修 饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使 所述多核苷酸序列的更高的表达。
本发明还涉及获得细菌宿主细胞的方法，包括向细菌细胞导入核酸构建 体，所述核酸构建体包含启动子区，该启动子区与编码具有生物学活性的多 肽的多核苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的 多肽的多核香S1^列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列 可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA 加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。
本发明还涉及修饰型mRNA加工/稳定化序列。
本发明还涉及核酸构建体，其包含启动子区，该启动子区与编码具有生 物学活性的多肽的多核香酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有 生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加 工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未 修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。
本发明进一步涉及产生细菌宿主细胞不含选择标记的突变体的方法，包 括缺失细菌宿主细胞的选择标记基因，其中所述细菌细胞包含核酸构建体， 该核酸构建体包含启动子区，该启动子与编码具有生物学活性的多肽的多核 苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多 核芬酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地 连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳 定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。
附图简述
图1显示未加工的mRNA的示意图，和与所表达的基因相关的各种修 饰型mRNA加工/稳定化Shine-Dalgarno (S-D)序列、所述基因的内源核糖体 结合位点(RBS)和转录终止子序列的位置(茎-环)。"野生型"表示未修饰的 mRNA加工/稳定化序列。"修饰型l"是实施例5中描述的mRNA加工/稳定 化序列的修饰形式。"修饰型2、 3和4"是多种不同的修饰型mRNA加工/稳 定化序列。"修饰型2"含有一个额外的Shine-Dalgamo序列，其类似于"修饰型1",只是所述额外的Shine-Dalgamo序列在不同的位置。"修饰型3和4" 含有额外的位于不同位置的Shine-Dalgamo序列。所有额外的Shine-Dalgarno 序列都位于基因的内源RBS和未加工的mRNA的5'端之间。
图2显示pGME079的限制图。
图3显示pNBT48的限制图。
图4显示pNBT55的限制图。
图5显示pNBT56的限制图。
图6显示从枯草芽孢杆菌菌抹BW198 (P,e/c7//" stab/a/^//表达盒) 和BW199 (Pa，e/mod. cr_y//" stab/a; r/f表达盒)获得的摇瓶中的相对克劳氏 芽孢杆菌(Sacz7/w c/awWz')石威性蛋白酶(AprH)活性。
图7显示pGME085的限制图。
图8显示pGME080的限制图。
图9显示从枯草芽孢杆菌菌抹GME200 (野生型P^/^/c^//" stab/ pr// 表达盒)、GME201 (P **co;////f/co^7" stab/qpr/f表达盒)、GME202 (P^〃/乂mod. ct少/ZL4 stab/fl/ r7/表达盒)和GME203 (P共有^肌/mod. c^y//L4 stab/ap"i/表达盒) 获得的摇瓶中的相对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)活性。
图10显示pMDT131的限制图。
图11显示pMDT159的限制图。
图12显示pMDT160的限制图。
图13显示pHyGe203的限制图。
图14显示pHyGe205的限制图。
图15显示pHyGe201的限制图。
图16显示pHyGe206的限制图。
图17显示三联启动子(triple tandem promoter)变体对地衣芽孢杆菌菌抹 HyGe210和HyGe211中克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)生产的作用。 图18显示pKK223-3的限制图。 图19显示pNBT51的限制图。 图20显示pNBT52的限制图。 图21显示pNBT53的限制图。 图22显示pNBT54的限制图。 图23显示pNBT35的限制图。图24显示pNBT30的限制图。 图25显示pNBT31的限制图。 图26显示pNBT36的限制图。 图27显示pMDT100的限制图。 图28显示pMDT174的限制图。
图29显示枯草芽孢杆菌菌抹MDT134和MDT135的相对蛋白酶活性。 定义
信使RNA (mRNA)加工/稳定化序列术语"mRNA加工/稳定化序列"在 本文定义为这样的序列,其位于启动子区下游和编码具有生物学活性的多肽 的多核苦酸的翻译起始位点(即，核糖体结合位点；RBS)上游，所述启动子 区与该序列可操作地连接，由此可以使从启动子区合成的所有mRNA得到 加工以生成在其5'端具有稳定子序歹'J(stabilizer s叫uence)的mRNA转录物。 这种稳定子序列在mRNA转录物的5'端的存在使mRNA转录物的半衰期增 力口(Agaisse禾口 Lereclus， 1994,见上文，Hue等，1995, Jow77a/o/5ac/en'o/ogy 177: 3465-3471)。所述mRNA加工/稳定化序列与细菌16S核糖体RNA的3' 最末端互补。在优选的方面，所述mRNA加工/稳定化序列生成基本上单一 大小的转录物，所述转录物在其5'端具有稳定化序列。mRNA加工/稳定化 序列优选与细菌16S核糖体RNA的3'最末端互补。参见，例如，美国专利 Nos. 6,255,076和5,955,310。
Shine-Dalgarno序列术语"Shine-Dalgarno序列"在本文定义为在信使 RNA分子中核糖体将与之结合的核苷酸序列。这样的序列与细菌16S核糖 体RNA的3'端互补。
在优选的方面，Shine-Dalgamo序列包含序列GGAG。在另 一优选的方 面，Shine-Dalgamo序列包含序列GGAGG 。在另 一 优选的方面， Shine-Dalgamo序列包含序列AGAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1)。在另 一优选 的方面，Shine-Dalgamo序列包含序列AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAC C (SEQ ID NO: 2)。在另一优选的方面，Shine-Dalgarno序列包含序列
未修饰的mRNA加工/稳定化序列术语"未修饰的mRNA加工/稳定化 序列，，在本文定义为包含mRNA加工/稳定化序列的野生型多核苷酸。修饰型mRNA加工/稳定化序列术语"修饰型mRNA加工/稳定化序列" 在本文定义为经过重组修饰而包含至少一个额外的Shine-Dalgarno序列拷贝 的mRNA稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的 mRNA加工/稳定化序列相比促使多核苷酸序列的更高的表达。
启动子术语"启动子"在本文定义为这样的DNA序列，其结合RNA聚 合酶并指导该聚合酶到达多核苷酸的正确下游转录起始位点以起始转录，所 述多核苷酸编码具有生物学活性的多肽。RNA聚合酶有效地催化与编码区 的适当DNA链互补的信使RNA装配。术语"启动子"还应理解为包括用于在 转录成mRNA之后的翻译的5'非编码区(启动子和翻译起点之间)，顺式作用 转录调控元件例如增强子，和/或其它能够与转录因子相互作用的核苷酸序 列。启动子可以是野生型启动子、变体启动子、杂合启动子体或共有启动子 (consensus promoter)。
启动子区术语"启动子区"在本文定义为包含一个或多个(几个)启动子 序列的核普酸序列，例如串耳关三启动子(tandem triple promoter)。
启动子变体术语"启动子变体"在本文定义为这样的启动子，其具有的 核苷酸序列包含对亲本启动子的一个或多个(几个)核苷酸的取代、缺失和/ 或插入，其中所述突变启动子比相应的亲本启动子具有更高或更^f氐的启动子 活性。术语"启动子变体"还将包括天然变体和使用本领域^^知的方法获得的 体外生成的变体，所述方法如经典诱变、定点诱变和DNA改组。
串联启动子术语"串联启动子"在本文定义为两个或更多个启动子序 列，其中每一个都和编码序列可操作地连接并且介导所述编码序列转录成 mRNA。
杂合启动子术语"杂合启动子"在本文定义为两个或更多个启动子的部 分，其融合在一起生成的序列是所述两个或更多个启动子的融合体，当与编 码具有生物学活性的多肽的多核苷酸编码序列可操作地连接时，其介导该编 码区转录成mRNA。
分离的多肽术语"分离的多肽"如用于本文是指从某个来源分离的多 肽。在优选的方面，所述多肽为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少 10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至 更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯，如通过SDS-PAGE测定的。
基本上纯的多肽术语"基本上纯的多肽"在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物按重量计含有至多10%,优选至多8%,更优选至多6°/。，更优选 至多5%,更优选至多4%,更优选至多3%,甚至更优选至多2%,最优选至 多1%，并且甚至最优选至多0.5。/。的与其天然或重组结合的(natively or recombinantlyassociated)其它多肽材料。因此，优选的是所述基本上纯的多肽 是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯， 更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97% 纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99°/。纯，最优选至少99.5%纯，并 且甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，所述多肽 制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。这可以 通过，例如，用公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。
分离的多核苷酸术语"分离的多核苷酸，，用于本文是指从某个来源分离的 多核苷酸。在优选的方面，多核苷酸为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至 少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚 至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯，如通过琼脂糖电泳测定的。
基本上纯的多核苷酸术语"基本上纯的多核苷酸"用于本文是指不含其 它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处 于适合于在遗传工程化蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多 核苷酸按重量计含有至多10%，优选至多8%,更优选至多6%，更优选至多 5%,更优选至多4%，更优选至多3%,甚至更优选至多2%，最优选至多 1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。 然而，基本上纯的多核香酸可以包括天然存在的5，和3，非翻译区，如启动子 和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92% 纯，更优选至少94°/。纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至 少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少 99.5%纯的。本发明的多核苷酸优选是基本上纯的形式，即，所述多核苷酸 制备物基本上不含(essentially free of)与其天然或重组结合的其它多核苷酸材 料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、 RNA、半合成、合成来源的，或 它们的^f壬何组合。
核酸构建体术语"核酸构建体"如用于本文是指单链或双链的核酸分 子，其从天然存在的基因分离，或其经过修饰从而以本不存在于自然界的方 式含有核酸的区段(segment),或其是合成的。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语"表达盒"同义。
调控序列术语"调控序列"在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核 苷酸的表达是必需的所有成分。每个调控序列对于编码所述多肽的核苷^ 列可以是天然的或外源的，或对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序 列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号 肽序列和转录终止子。最少的情况下，调控序列包括启动子，以及转录和翻 译的停止信号。调控序列可以与接头一起提供，所述接头的目的是引入特异 性限制位点，促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。
可操作地连接术语"可操作地连接"在本文表示这样的构型，其中将调 控序列置于相对于多核香酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导 多肽的编码序列的表达。
编码序列当用于本文时术语"编码序列"的意思是直接指定其蛋白产物 的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述 开放阅读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和 TTG开始，并以终止密码子例如TAA、 TAG和TGA结束。编码序列可以是 DNA、 cDNA、合成或重组核苷酸序列。
表达术语"表达，，包括多肽的产生所涉及的任何步骤，其包括但不限于 转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体术语"表达载体"在本文定义为线性的或环状的DNA分子， 其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的 额外核苦酸可操作地连接。
宿主细胞如本文中所使用的术语"宿主细胞"包括任何对于使用核酸构 建体或表达载体的转化、转染、转导、接合等易感的(susceptible)细胞类型。
发明详述
本发明涉及在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包 括(a)在有益于产生所述具有生物学活性的多肽的培养基中培养细菌宿主细 胞，其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含启动子区， 该启动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述启动 子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位 点(RBS)上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所 述多核苷酸序列的更高的表达；和(b)从培养基分离具有生物学活性的多肽。
本发明的一个优势在于，为了获得饱和水平的mRNA而需要向宿主染 色体中导入的表达盒拷贝较少，由此显著缩短构建生产菌抹所需的时间长 度。同样，本发明允许在当前技术不足以生成饱和水平的mRNA的情况下 有更高水平的基因表达。
在优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工 /稳定化序列相比促使多核苷^列的表达高出至少15%,优选至少25%, 更优选至少50%,更优选至少75%,更优选至少100%,更优选至少150%, 更优选至少200%，更优选至少250%,甚至更优选至少300%,最优选至少 400%,并且甚至最优选至少500%。
信使RNA (mRNA)加工/稳定化序列
本发明还涉及修饰型mRNA加工/稳定化序列。任何mRNA加工/稳定 化序列可以用作亲本来构建本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列。
本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少一个额外的 Shine-Dalgamo序列，该序列为其所连接的mRNA提供增强的保护，由此， 与利用野生型mRNA稳定化序列的构建体相比产生更高水平的基因表达。所 述至少 一个额外的Shine-Dalgarno序列可以是与所述mRNA加工/稳定化序列 天然结合的或所述mRNA加工/稳定化序列固有的Shine-Dalgarno序列的副本 (duplicate),或者可以获得自不同的mJRNA加工/稳定化序列。图1显示的是 未加工mRNA的示意图，和与表达的基因相关的各种修饰型mRNA加工/稳 定化序列、内源核糖体结合位点(RBS)和转录终止子序列的位置(茎-环)。
在优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少两个 Shine-Dalgarno序列。在另 一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包 含至少三个Shine-Dalgamo序列。在另 一优选的方面，修饰型mRNA加工/ 稳定化序列包含至少四个Shine-Dalgarno序列。在另一优选的方面，修饰型 mRNA加工/稳定化序列包含至少五个Shine-Dalgarno序列。
在另 一 优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的 Shine-Dalgarno 序歹U (a Shine-Dalgarno sequence comprising the modified mRNA processing/stabilizing sequence)至少为4 bp。在另 一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少为5 bp。在另一 优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至 少为10 bp。在另一优选的方面，》务饰型mRNA加工/稳定化序列包含的 Shine-Dalgamo序列至少为15 bp。在另 一优选的方面，修饰型mRNA加工/ 稳定化序列包含的Shine-Dalgamo序列至少为20 bp。在另一优选的方面， 修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgamo序列至少为25 bp。在 另 一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgamo序 列至少为30bp。
修饰型mRNA加工/稳定化序列的构建可以(l)通过除已经存在的 Shine-Delgamo/mRNA稳定化序列之外，将一个或多个(几个)Shine-Delgarno 序列置于感兴趣的基因的转录起始位点和基因的RBS之间，或(2)通过将两 个或更多个(几个)Shine-Delgarno序列置于感兴趣的基因的转录起始位点和 基因的RBS之间，其中所述基因除了原有的RBS之外先前不含 Shine-Delgamo/mRNA稳定化序列。修饰型mRNA加工/稳定化序列可以从 不同于所述基因的Shine-Delgarno序列构建。修饰型mRNA加工/稳定化序 列的每个Shine-Delgarno序列可以是相同的序列或一个或多个(几个)不同序 列的组合。例如，如本文所述，将额外的Shine-Delgarno序列置于已经存在 的Shine-Delgarno/mRNA稳定化序列和RBS之间。由于RBS本身通常也是 Shine-Delgarno序列，因此在未加工的mRNA上存在最少三个Shine-Delgarno 序列。前两个(从5，端起)赋予mRNA稳定性，而第三个(RBS)指导mRNA的 翻译。
在优选的方面，亲本mRNA加工/稳定化序列是WO 94/25612和Agaisse 和Lereclus， 1994, Mo/ecw/w M/cra6/o/ogv 13: 97-107中公开的苏云金芽孢杆 菌CSac/〃w Aw/"g/m^) C7//" mRNA力口工/稳定化序歹寸，或其保留着mRNA 加工/稳定化功能的部分。
在另一优选的方面，亲本mRNA加工/稳定化序列是Hue等，1995,见 上文中公开的枯草芽孢杆菌SP82 mRNA加工/稳定化序列，或其保留着 mRNA加工/稳定化功能的部分。
在更优选的方面，co/i/L4 mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO: 4,或 保留着SEQ ID NO: 4的mRNA稳定化功能的SEQ ID NO: 4的一部分。
在另 一更优选的方面，SP82 mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO: 5 ，或保留着SEQ ID NO: 5的mRNA稳定化功能的SEQ ID NO: 5的一部分。
在优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQIDNO:6，或保 留着SEQ ID NO: 6的mRNA稳定化功能的SEQ ID NO: 6的一部分。
修饰型mRNA加工/稳定化序列优选位于启动子区的下游和基因的核糖 体结合位点的上游。然而，修饰型mRNA加工/稳定化序列可以位于启动子 区包含的"f壬"f可启动子的下游(downstream of any promoter comprising the promoter region), 和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合 位点的上游。另外，修饰型mRNA加工/稳定化序列可以位于启动子区包含 的每个启动子的下游，和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体 结合位点的上游。修饰型mRNA加工/稳定化序列的亲本对于启动子区的一 个或多个(儿个)启动子可以是外源的。
编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸
由导入细菌宿主细胞中的多核苷酸编码的具有生物学活性的多肽可以 是感兴趣的任何多肽。术语"多肽"在此不是指特定长度的编码产物，因此， 包括肽、寡肽和蛋白质。多肽对于细菌宿主细胞可以是天然的或异源(夕卜源) 的。术语"异源多肽"在本文定义为多肽，其对于宿主细胞不是天然的；天 然多肽，其中进行过结构修^饰而改变了天然多肽，例如，天然多肽的蛋白质 序列；或天然多肽，由于通过重组DNA技术对编码所述多肽的DNA进行 了操作(例如，较强的启动子)而使所述天然多肽的表达量改变。多肽可以是 任何多肽的工程化变体。
在优选的方面，多肽是抗体、抗原、抗孩i生物肽、酶、生长因子、激素、 免疫调节剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白和转录 因子。
在更优选的方面，多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构 酶或连接酶。在最优选的方面，多肽是乙酰木聚糖酯酶(acetylxylanesterase)、 a-葡糖香酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解 酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、 内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀 粉酶、葡糖脑苷脂酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、 甘露糖苷酶、变构酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、
尿激酶或木聚糖酶。
在另一优选的方面，多肽是清蛋白、M^、、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。 在另一优选的方面，多肽是杂合多肽，其包含从至少两种不同多肽获得
的部分或完整多肽序列的组合，其中的一种或多种(几种)对于细菌宿主细胞
可以是异源的。
在另一优选的方面，多肽是融合的多肽，其中将另一多肽融合在所述多 肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通过将编码一种多肽的核苷 酸序列(或其部分)与编码另 一多肽的核苷酸序列(或其片段)融合来产生的。 用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括，连接编码多肽的编码 序列从而使它们符合阅读框并且使所述融合的多肽的表达在相同启动子和 终止子的调控下。
编码感兴趣的多肽的多核苷酸可以获得自任何原核、真核或其它来源。 就本发明而言，术语"获得自"用于本文中与具体的微生物来源有关，意思应 该是多肽由所述来源产生，或由其中已插入来自该来源的基因的细胞产生。
用于分离或克隆编码感兴趣多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且
包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或它们的组合。从这种基因组DNA 克隆感兴趣的多核苷酸可以例如通过使用公知的聚合酶链式反应(PCR)来实 王见。参见，例3口，Innis等,1990,尸C7 尸ratocofc:」GW<ie to Afef/zo(is ^/^//cario": Academic Press, New York。克隆步骤可以牵涉切下和分离包含编码多肽的多核 苦酸的核酸片段，将所述片段插入载体分子，和将重组载体并入细菌宿主细胞， 在该细菌宿主细胞中将复制所述多核苷酸的多个拷贝或克隆。DNA可以M 因组、cDNA、 RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
可以用许多方式操作编码感兴趣的多肽的多核苷酸以提供多核苷酸在 合适细菌宿主细胞中的表达。为编码感兴趣的多肽的多核苷酸构建核酸构建 体和重组表达载体可以如本文关于表达具有生物学活性的多肽所描述的来 进行。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含与编码具有生物学活性的多肽的多核 苦酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核香酸序列核糖体结合位点(RBS)上游的修饰型 mRNA加工/稳定化序列。
构建包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接 的启动子区和本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列(其位于启动子区的下 游和多核苷酸序列核糖体结合位点的上游)的核酸构建体可以如下完成通 过使用本领域公知的方法修饰所述多核苷酸序列，以将启动子区和修饰型 mRNA加工/稳定化序列，以及其它调控序列，与所述多核芬酸可操作地连 接，将所述构建体插入载体，再将所述载体通过同源重组导入细菌细胞的染 色体或作为染色体外自主复制元件(例如，质粒)导入细菌细胞。
每个调控序列对于编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可以是 天然的或外源的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、启动子区、信 号序列和转录终止子。最少的情况下，调控序列包括启动子区，以及转录和 翻译的停止信号。调控序列可以与接头一起提供，所述接头的目的是引入特 异性限制位点，促进调控序列与编码具有生物学活性的多肽的多核香卧^列 编码区连接。
启动子区。启动子区可以包含单个启动子或多个启动子的组合。在启动 子区包含多个启动子的组合的情况下，多个启动子优选是前后串联的(in tandem)。启动子区的启动子可以是能够在感兴趣的细菌宿主细胞中起始编码 具有生物学活性的多肽的多核苷酸转录的任何启动子。启动子对于编码具有 生物学活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的、或它们的组合。这 样的启动子可以从指导具有生物学活性的胞外或胞内多肽(对于细菌宿主细 胞是同源的或异源的)合成的基因获得。
在优选的方面，启动子区包含/人细菌来源获得的启动子。在更优选的方 面，启动子区包含从革兰氏阳性细菌获得的启动子。在另一更优选的方面， 启动子区包含从革兰氏阴性细菌获得的启动子。革兰氏阳性细菌包括，但不 限于，芽孢杆菌属CSac/〃ws)、 链球菌属(&reptococcw力、链霉菌属 OSfre/ tom;vces)、 葡萄球菌属(&qp/i;y/ococciw)、肠球菌属(五wto-ococcus)、 乳杆 菌属(丄(3cto6ac/〃w)、乳J求菌属(丄ac ococcw》、才炎菌属(C7oWn-fl^m)、 土芽孑包4干 菌属(Geo6ac/〃w力和海洋芽孢杆菌属(Ocea"okzc/〃us)。革兰氏阴性细菌包括， 但不P艮于，大肠杆菌、假单胞菌属(尸化wcfowowos)、沙门氏菌属(5b/wo"e〃a)、 弯曲杆菌属(Cam;7少/oZ^"er)、 螺杆菌属(i/e//co6a"er)、 黄杆菌属CF/(3vc>6ac/en.i/m)、才炎4干菌属(尸wsoZ^c/er/w/w)、；尼4干菌属(7/少o6a"e/")、 奈瑟氏 ^求菌属(iVe/Men'a)和尿4支原体属(t/reqp/mwa)。
在最优选的方面，启动子区包含从以下菌抹获得的启动子芽孢杆菌属 菌才朱，例如,5ac/〃ws agara(i/^rem1、嗜;威芽孑包4干菌(5ac/〃ws a/fejf/c;p/zz7^s")、解 淀粉芽孑包軒菌C6flc,〃ws am;;/o/一ey^cz'ms)、短芽孑包軒菌(Bac/〃w51 6rev")、环状 芽孢杆菌C8flc///^ c/rcw/ara)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(5ac/〃w coflgM/a"s)、 坚强芽孑包軒菌C6a"7,us，mus)、 杣烂芽抱杆菌(5flc"/m: /om加)、 迟纟爰芽孑包4干菌(Aac〃/ws /ewftw) 、 i也衣芽孑包4干菌(5"c/〃uy //c/zem》/7m'力、巨大芽 孢杆菌(5ac〃/iw wegafen'w/w)、短小芽孢杆菌(8a"7/z^ /7w脂7m)、嗜热月旨肪芽 孢杆菌(万ac///^ >sfeara//zerwo/ /2//w1s)、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌 (5czc/〃ws决wn'"g^m^); 或4连霉菌属菌4朱，寸列^口^i青f，链霉菌OS!^e/ towycey //v油/m)或鼠灰链雾菌(浙，owyces wwr/"—。
用于在本发明的方法中指导编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸转 录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子大肠杆菌/ac操纵子、天蓝 色链霉菌(&r印tom^&s coe/Zco/or)琼脂糖酶基因(^g^)、迟緩芽孢杆菌或克劳 氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(^^//)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白 酶Carlsberg基因(subtilisin Carlsberg gene))、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因 O"cS)、枯草芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amj^)、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因 (am_y￡)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(am少M)、解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因(flmy0、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(pew巧、枯草芽孢杆菌；qyM 和x_y/B基因、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种CBacz7/w决wn7 gz'e"^s subsp. te朋6n'om'力CryIIIA基因(c^y//")或其部分，原核(3-内酰胺酶基因 (Villa-Kamaroff等，1978,尸racee^V^ o/f/ze iVa"o加/
75:3727-3731)，和巨大芽孢杆菌基因(Rygus和Hillen， 1992, / Bacfen'o/. 174:3049-3055; Kim等，1996， (7e"e 181: 71-76)，以及toc启动子(DeBoer 等,1983,尸raceWwgs o/Ato/owa/爿c^em;; o/5Wewc^ 80:21 -25)，质 粒pUB U 0的启动子(Tortosa等，2000， Mo/. M/cra6/o/. 35:1110-1119)， 和spac启动子(Henner， 1990, MeAocfe五"2^wo/. 185: 223-228)。其它实例是 spo7谨菌体启动子和tac启动子的启动子(DeBoer等，1983,尸race^/wgs o/f/^ A^"owa/^c^/em_y 。/5Wewces WSv4 80:21-25)。另夕卜的启动子在"Useflil proteins from recombinant bacteria"于 5"cz'e打hy c 4wten.ca打，1980, 242:74-94; 及Sambrook, Fritsch和Maniatus， 1989， Mo/ecw/ar C7ow/"g， Z^orato^ Mwwa/, 第2版，Cold Spring Harbor, New York中描述。
在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是"共有，，启动子，其具有 "-35"区的序列TTGACA和"-10"区的TATAAT。共有启动子可以从能够在细 菌宿主细胞例如芽孢杆菌属宿主细胞中发挥功能的任何启动子获得。可以使 用本领域公知的方法通过定点诱变完成"共有"启动子的构建以创造启动子， 该启动子更加完美地符合枯草芽孢杆菌营养型(vegetative)"cj A型"启动子 "-10"和"-35"区的已确定的共有序歹寸(Voskuil等，1995, Mo/ecw/w MfcraZ)Zo/og); 17: 271-279)。
在另一优选的方面，启动子包含"共有"启动子，该"共有"启动子获得自 从以下获得的启动子大肠杆菌/ac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因 (&g^)、克劳氏芽孢杆菌或迟緩芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(a/^//)、地衣芽孢 杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖 酶基因0acB)、枯草芽孢杆菌a-淀粉酶基因(am少5)、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶 基因(amyZ0、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(a;^M)、解淀粉芽孢杆菌 a-淀粉酶基因(am;^)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(pmP)、枯草芽孢杆菌 和"/S基因、苏云金芽孢杆菌拟步行曱亚种(3^111八基因(67^//")或其部分， 或原核P-内酰胺酶基因^po/细菌的噬菌体启动子。
在更优选的方面，启动子区包含获得自解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因 (am少g)的"共有"启动子。
在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是杂合启动子。
在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是变体启动子。参见，例如， WO 05/098016,美国专利No. 5,698,415和美国专利No. 6,100,063。在优选
的方面，变体启动子是P肌yl^99,其中P:启动子。
在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是串联启动子。参见，例如，
WO 99/043835和WO 05/098016。在优选的方面，串联启动子是P共有鹏w P^/,『cO^" mRNA加工/稳定化序列。在另一优选的方面，串联启动子是 P。,一4i9r P共有。，e-Pco^4-co^" mRNA加工/稳定化序列。
在本发明的方法中，杂合启动子或串联启动子将被理解为对于编码具有 生物学活性的多肽的多核苷酸序列是外源的，即使野生型启动子对于所述多 核苷酸序列是天然的。例如，在由至少两个启动子组成的串联启动子中，其中一个启动子可以是编码生物学物质的多核苦酸的野生型启动子。
终止子。调控序列还可以是合适的转录终止子序列，其是由细菌细胞识 别以终止转录的序列。终止子序列与编码具有生物学活性的多肽的核苷S^
列3，末端可操作地连接。在所选细菌宿主细胞中有功能的任何终止子均可以 在本发明中使用。
前导序列。调控序列还可以是合适的前导序列，其是mRNA非翻译区， 对于细菌细胞的翻译是重要的。前导序列与指导具有生物学活性的多肽合成 的核苷酸序列的5'末端可操作地连接。在所选细菌宿主细胞中有功能的任何 前导序列可以用于本发明中。
信号肽编码区。调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基 末端连接的氨基酸序列，其能够指导表达的多肽进入细胞的分泌途径。信号 肽编码区对于多肽可以是天然的或可以得自外源。编码多肽的多核苷酸编码 序列的5，端可以固有地(inherently)含有信号肽编码区，其天然地在翻译阅读 框之内与编码所分泌多肽的编码区片段连接。或者，编码序列的5'端可以含 有信号肽编码区，其对于编码所分泌多肽的编码序列部分是外源的。当编码 序列天然不含信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。或者，外源信 号肽编码区可以简单地代替天然信号肽编码区，以获得相对于通常与编码序 列连接的天然信号肽编码区增强的多肽分泌。信号肽编码区可以从例如芽孢 杆菌属菌种的淀粉酶或蛋白酶基因获得。然而，能够指导表达的多肽进入所 选细菌宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区可以在本发明中使用。
对于细菌细胞，例如芽孢杆菌属细胞有效的信号肽编码区是获得自以下 基因的信号肽编码区来自芽孢杆菌属NCIB 11837的产麦芽淀粉酶基因、 嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢 杆菌P-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因07^r、 "pnS、 和枯草芽孢杆菌基因。另外的信号肽由Simonen和Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137描述。
选择标记。核酸构建体可以进一步含有一个或多个(几个)选择标记，其 允许简单选择转化的细胞。选择标记是基因，其产物提供杀生物剂抗性、对 重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。细菌选 择标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的由/基因，或赋予抗生 素抗性的标记，例如氨节青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素 四环素抗性。另外，选择可以通过共转化完成，例如，如WO 91/09129中所述，其中选择 标记在单独的载体上。
然后可以使用本领域已知的方法或那些在本文中描述的用于表达具有 生物学活性的多肽的方法将核酸构建体导入细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可 以含有相同核酸构建体的一个或多个(几个)拷贝，或至少两种不同核酸构建 体的一个或多个(几个)拷贝，其中每种构建体都如上文所述构建。
表达栽体
在本发明的方法中，重组表达载体可以构建成包含与编码具有生物学活 性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和本发明的修饰型 mRNA加工/稳定化序列，其位于启动子区的下游和编码具有生物学活性的 多肽的多核苷i^f列核糖体结合位点的上游。可以将上述的多种核酸和调控 序列结合在一起，产生重组表达载体，其可能包括一个或多个(几个)方便的 限制位点，以允许在这些位点插入或取代多核苷酸。或者，可以通过将多核 苷酸序列或包含该多核苷酸序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中 来表达编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列。在创建表达载体的过程 中，将编码具有生物学活性的多肽的多核苷S饼列置于载体中，使得该编码 序列与启动子区和修饰型mRNA加工/稳定化序列，以及任何其它用于表达 和可能用于易位(translocation)的适当调控序列可操作地连才妄。
重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA方法并且在导入细菌宿 主细胞时能够引起具有生物学活性的多肽表达的任何载体。载体的选择将通 常依赖于载体与将导入该载体的细菌宿主细胞的相容性。载体可以是线性的 或闭合环状的质粒。载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存 在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色 体或人工染色体。载体可以含有保证自复制的任何手段。或者，载体可以是 一种当被导入细菌宿主细胞中时，整合到染色体中并且与其所整合的染色体 一起复制的载体。载体系统可以是单一载体或质粒，或是两个或更多个的载 体或质粒，或是转座子。
"导入，，是指将载体导入细菌宿主细胞从而使所述载体作为染色体整合 体或作为自复制的染色体外载体保留。通常认为整合是一种优势，因为更有 可能将一个或多个(几个)编码序列或基因稳定地保留在细胞中。将载体整合入染色体通过同源重组、非同源重组或转座来进行。
例如，将表达载体导入细菌宿主细胞可以通过转化、转染、转导、接合
等来进行。
对于整合，载体可以依赖于任何载体元件通过同源重组将载体稳定整合 入基因组。载体可以含有额外的多核苦酸序列用于指导通过同源重组向细菌 宿主细胞基因组中的整合。所述额外的多核香酸序列使得载体能够整合入细 菌宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能 性，整合元件应该优选含有足够数目的与相应目标序列高度同源的核酸，如
100至10,000个碱基对，优选400至10,000个石咸基对，并且最优选800至 10,000个碱基对，以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何多核苷^
列，其与细菌宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非 编码或编码序列。
为了自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所述的芽孢杆菌属细 胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的
质粒pBR322、 pUC19、 pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽 孢杆菌属中复制的质粒pUBllO、 pE194、 pTA1060和pAMBl的复制起点。 复制起点可以具有突变，其使得该复制起点的功能在细菌宿主细胞中是温度 壽文感的(参见，例^口, Ehrlich, 1978, Praceecf!'wgs o/ f/ze ATafz'owaZ爿cacfemy o/ 6W置&s , 75: 1433)。
用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员公知 的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
细菌宿主细胞
本发明还涉及细菌宿主细胞，其包含与编码具有生物学活性的多肽的多 核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和本发明的修饰型mRNA加工/稳定 化序列，该序列位于启动子区的下游和编码具有生物学活性的多肽的多核苷 酸序列核糖体结合位点的上游，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与 未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表 达。在优选的方面，细菌细胞不含外源(异源)选择标记基因。
本发明还涉及获得细菌宿主细胞的方法，包括向细菌细胞导入核酸构建 体，该核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷S吏序列可操作地连4妻的启动子区，和本发明的修饰型mRNA加工/稳定4匕序列，该序列位 于启动子区的下游和编码具有生物学活性的多肽的多核苦酸序列核糖体结 合位点的上游，其中所述》务饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA 加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。
细菌宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳 性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、 肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、土芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。 革兰氏阴性细菌包括，但不限于，大肠杆菌、布I单胞菌属、沙门氏菌属、弯 曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏球菌属和尿 枝原体属。
在本发明的方法中，细菌宿主细胞可以是<壬何芽孢杆菌属细胞。在本发 明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括，但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉 芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌(bacillusatrophaeus)、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、 克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟緩芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌(^ac/〃附w^/avera&)、 短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和花域
芽孑包4干菌(5<3C/〃M>S V(3〃&WOW力纟田月包。
在优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、地衣 芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面，细菌 宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一更优选的方面，细菌宿主细胞是克 劳氏芽孢杆菌细胞。在另一更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细 胞。在另一更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
在本发明的方法中，细菌宿主细胞可以是任何链球菌属细胞。在本发明
的实践中有用的链球菌属细胞包括，但不限于，似马链球菌OSyr印tococcm e《M/57'w//^)、 酉良脓《连王求菌(AS^re/ tococczw /^oge"es)、 吝'L房链J求菌(iS reptococciw i/6m'力和马链球菌兽痙亚种(浙取ococcw5 subsp. Zooe/ /ofe附/cw力。
在另一优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一优选的方 面中，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细 胞是乳房链球菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟 亚种细月包。
在本发明的方法中，细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实践中有用的链霉菌属细胞包括，但不限于，不产色链霉菌(5^epfomyces ac/ ramogewey)、 P余虫链霉菌(及^ptomyces averm"//^)、 天蓝色链霉菌、灰色 链霉菌(浙取画戸s gni潔)和浅青紫链霉菌。
在另一优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一优选的 方面中，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主 细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是灰色链霉 菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。
在本发明的另一方面，细菌宿主细胞可以额外地含有对其它基因的修 饰，例如，缺失或破坏(disruption)，所述其它基因可能对具有生物学活性的 多肽的生产、回收和/或应用有害。在优选的方面，细菌宿主细胞是蛋白^: 陷型细胞。在更优选的方面，细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌属细胞，包含 对qp必和"/ r五的破坏或缺失。在另 一优选的方面，细菌宿主细胞不产孢子。 在另一更优选的方面，细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌属细胞，包含对s; o/Z4C 的破坏或缺失。在另一优选的方面，细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌属细胞， 包含对表面活性肽生物合成中涉及的基因(例如，w/4、 wW、 w/C和w^D) 之一的破坏或缺失。参见，例如，美国专利No. 5,958,728。对具有生物学活 性的多肽的生产、回收和/或应用有害的其它基因(例如，基因)也可以 被破坏或缺失。
可以例如通过如下方法实现将DNA导入芽孢杆茵属细胞原生质体转化 (参见，例如，Chang和Cohen， 1979, Mo/ecw/w Ge恥ra/Ge"e"cs 168: 111-115)， 4吏用感受态纟田月包(参见，例长口 ， Young牙口 Spizizen, 1961, /owr""/ o/5acten'o/ogy 81: 823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson, 1971, Jowtoj/ Mo/ecw/ar所o/ogy 56:209-221)，电穿孑L(参见，侈'J^口， Shigekawa禾口 Dower， 1988,5/otec/zm々was 6: 742-751 )或接合(参见，例如，Koehler和Thome, 1987， Jowr"a/ o/SacteHo/ogy 169:5271-5278)。可以例如通过如下方法实现将DNA导入大肠杆菌细胞原 生质体转化(参见，例如，Hanahan, 1983， Mo/.说o/. 166: 557-580)或电穿孔(参 见，例如，Dower等，1988, A^c/e/c爿c/cfei 仏16:6127-6145)。可以例如通过 如下方法实现将DNA导入链霉菌属细胞原生质体转化和电穿孔(参见，例 如，Gong等，2004, M/cra&o/. (Pra/z"」49: 399-405)，接合(参见，例如， Mazodier等，1989, J Bacfen'o/. 171: 3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke 等，2001,尸rac. Jcad 5W. USA 98: 6289-6294)。可以例如通过如下方法实现将DNA导入假单胞菌属细胞电穿孔(参见，例如，Choi等，2006， Mz'cra6/。/. MeAo^r 64: 391國397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets, 2005, ^ p/.
Mz'cra&o/. 71: 51-57)。可以例如通过如下方法实现将DNA导入链球 菌属细胞天然感受态(参见，例如，Peny和Kuramitsu， 1981，/"/e". /附m柳.32: 1295-1297),原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick, 1991, Mz'cra&o;y. 68: 189-207),电穿孑L(参见，例如，Buckley等，1999， jpp/.五"Wra". M/cro&o/. 65: 3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell, 1981，Mz'cra6/o/.及ev. 45:409-436)。然 而，可以使用任何本领域已知用于将DNA导入宿主细胞的方法。
生产
在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于具有生物学活 性的多肽产生的营养培养基中培养细菌宿主细胞。例如，可以通过在合适的 培养基中以及允许具有生物学活性的多肽表达和/或分离的条件下进行的、在 实验室中或工业发酵罐中的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分 批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源和无机盐的合适 的营养培养基中，使用本领域已知的方法进行培养。合适的培养基可以从商 业供应商获得，或可以根据已公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中 心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果具有生物学活性的 多肽分泌至营养培养基中，那么能够直接从培养基中回收所述多肽。如果具 有生物学活性的多肽不分泌，那么可以从细胞裂解物中回收所述多肽。
具有生物学活性的多肽可以使用本领域已知的、特别用于所述具有生物 学活性的多肽的方法来检测。这些检测方法可以包括使用特异性抗体、高效 液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如， 可以使用酶测定法来测定酶的活性。对于许多酶用于测定酶活性的步骤是本 领i或已知的(参见，例如，D. Schomburg和M. Salzmann (编)，五"zyme i/aw/6ooA:: Springer-Verlag， New York, 1990)。
得到的具有生物学活性的多肽可以使用本领域7>知的方法分离。例如， 可以通过常规步骤，包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或 沉淀从营养培养基分离具有生物学活性的多肽。然后可以通过多种本领域已 知的方法进一步纯化分离的具有生物学活性的多肽，所述方法包括，但不限 于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见，例如， 尸wny c(3"o", J,C. Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers, New York, 1989)。
在本发明的方法中，当在相同的生产条件下培养时，所述细菌宿主细胞 相对于含有与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的 启动子区和亲本mRNA加工/稳定化序列(位于所述启动子区的下游和编码具 有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点的上游)的细菌宿主， 优选多产生至少15%,优选至少25%,更优选至少50%，更优选至少75%, 更优选至少100%，更优选至少150%，更优选至少200%,更优选至少250%， 甚至更优选至少300%,最优选至少400%,并且甚至最优选至少500%的具 有生物学活性的多肽。
缺失/破坏
本发明还涉及产生细菌宿主细胞不含选择标记的突变体的方法，包括将 细菌宿主细胞的选择标记基因缺失，其中所述细菌细胞包含核酸构建体，该 核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连 接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽 的多核香酸序列核糖体结合位点(RBS)上游的修饰型mRNA加工/稳定化序 列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未<奮饰的mRNA加工/稳定 化序列相比促使所述多核苦酸序列的更高的表达。
其它不理想的基因。在这些方法中，选择标记基因的缺失可以使用质粒通过 同源重组来完成，将所述质粒构建成连续地含有侧翼为选择标记基因的5' 和3'区。例如，可以将连续的5'和3'区与第二选择标记相关联导入芽孢杆菌 属细胞中温度敏感型质粒例如pE194上，在允许的温度下使质粒能够在细胞 中逐渐确立(become established)。然后将细胞转移至非允许温度以选4奪在染 色体中于同源侧翼区之一整合了质粒的细胞。质粒整合的选择通过选择第二 选择标记来实现。整合之后，通过将细胞转移至允许温度不进行选择地增殖 几代来刺激第二同源侧翼区的重组事件。将细胞铺板以获得单菌落，并检查 菌落的两种选择标记的缺失(参见，例如，Perego, 1993,于A丄.Sonneshein, J.A. Hoch和R. Losick编，5acz7/ws jm6"/z^ aw<i (9f/zer GV"aw-尸o^Y/ve 5acfenV2， 第42章，American Society of Microbiology, Washington, D.C， 1993)。选择标记基因还可以如下通过同源重组去除将包含缺陷型基因的5' 和3'区但是缺乏选择标记基因的核酸片段导入突变细胞，继而在反选择培养 基(counter-selectionmedium)上选择。通过同源重组，将含有选择标记基因的 缺陷型基因用缺乏选择标记基因的核酸片段代替。也可以使用本领域已知的 其它方法。
也可以使用上述步骤来缺失或破坏不理想的基因。美国专利No. 5,891,701公开了用于缺失包括s/w/"C、 a; r￡、和aw^五的几种基因的技术。
其它不理想的生物学化合物也可以通过上述方法去除，例如由c少pX(登 录号BG12580)和/或"mC(登录号BG14121)合成的红色素。
在优选的方面，未用任何外源或异源选择标记对芽孢杆菌属宿主细胞进 行标记。在另一优选的方面，芽孢杆菌属宿主细胞不产生由c少/ Jf和yvwC 合成的任何红色素。
通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将这些实施例理解为对本发 明范围的限制。
实施例 DNA测序
DNA观'J序寸吏用 Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA， USA)用染料终止剂化学(dye terminator chemistry) (Giesecke等，1992, /owma/ o/Wra/. Me^oA 38: 47-60)进行。使用 phred/phrap/consed (University of ^Vashington， Seattle, WA， USA)用序列特异 性引物来组装序列。
菌抹
在枯草芽孢杆菌168A4中构建了芽孢杆菌属质粒。枯草芽孢杆菌168A4 源自枯草芽孢杆菌典型菌抹168 (BGSC 1A1， Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH， USA)并且在s/ o/"C、 a; r五、和am_y￡基因中具有缺失。 这四个基因的缺失基本上如针对枯草芽孢杆菌A164A5所描述的来进行，其 在美国专利No. 5,891,701中详细描述。培养基
LB培养基每升由10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g NaCl组成。 LB平板由LB培养基和每升15 gBacto琼脂组成。 LB氨苄青霉素培养基由LB培养基和每毫升100叫氨苄青霉素组成。 LB氨千青霉素平板由LB氨苄青霉素培养基和每升15 g Bacto琼脂组成。
VY培养基每升由25 g小牛肉浸出物(veal infosion) (BD Diagnostics,
Franklin Lakes, NJ， USA)和5 g酵母提取物组成。
2XYT培养基每升由16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5gNaCl组成。 2X YT氨千青霉素培养基由2X YT培养基和每毫升100 pg氨苄青霉素组成。
2X YT氨苄青霉素平板每升由2X Y,T氨千青霉素培养基和15 gBacto琼 脂组成。
TBAB培养基由 Difco Tryptose Blood Agar Base (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA)组成。
TBAB氯霉素平板由TBAB培养基和每毫升5 ng氯霉素组成。 TBAB新霉素平板由TBAB培养基和每毫升6 新霉素组成。 TBAB红霉素/林可霉素平板由TBAB培养基和每毫升1 红霉素和25 林可霉素组成。
TBAB牛奶培养基由用牛奶覆层覆盖的TBAB培养基组成，所述覆层由 0.6 ml溶于去离子水的无菌10%奶粉溶液添加至6 ml融化的TBAB琼脂组成。
PS-l培养基每升由100g蔗糖、40g大豆粉、3.96g磷酸氢二钠(无水)、 5 g CaC03和100 |dl Plu賜ic酸组成。
实施例1:构建共有c/j//Z4启动子
构建了 c^y///^启动子的共有形式，其中将天然的-35和-10区变为共有a A依赖性启动子的-35和-10区。共有co^/" (co^4)启动子是通过退火两个 互补的97个核苷酸的寡聚物999555和999556来构建的。
寡聚物999555:
5'-CGGGCCTTAAGGGCCCTCGAAACGTAAGATGAAACCTTAGATAAGG画3'(SEQ ID NO: 7) 寡聚物999556:
5'隱CCTTAATTAATTATAACATTAATAATTCTTCAATGTCAACAAAAA
CCG-3' (SEQ ID NO: 8)
进行两个20 |il退火反应，其分别含有10 ^ (500 pmol)和5 ^ (250 pmol) 的每种寡聚物。将两个反应在95。C温育5分钟，然后将试管逐渐冷却至室温。
和-10启动子区、5'端的胡I限制位点和3'端的尸"cl位点。
将每个退火产物通过PCR扩增，所述PCR使用2 jal (25或12.5 pmol)
退火产物作为模板连同引物999557和999558，按照制造商的说明书使用
EXPAND High Fidelity PLUS PCR System (EXPAND 高保真PLUS PCR系
统)(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)。 引物999557:
5'-CGGGCCTTAAGGGCCCTCGAA-3' (SEQ ID NO: 9) 引物999558:
5'-CCTTAATTAATTATAACATT-3' (SEQ ID NO: 10)
将两个PCR反应的产物(它们是相同的)汇集，通过使用50mMTris碱-50 mM硼酸-l mM EDTA 二钠(TBE)缓沖液的2.0%琼脂糖电泳分析，并使用 QIAQUICK Gel Extraction Kit (QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒)(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)纯化。
然后使用TOPO TA Cloning Kit (TOPO TA克隆试剂盒)(Invitrogen， Carlsbad, CA, USA)将纯化的97 bp PCR产物克隆入pCR2.1中，再按照制造 商的说明书转化入ONE SHOT TOP10化学感受态的大肠杆菌细胞 (Invitrogen， Carlsbad， CA， USA)。使用BIOROBOT 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA,USA)从几个转化体纯化了质粒DNA，再通过用五coRI消化继 之以在TBE緩冲液中进行0.8%琼脂糖电泳来测验克隆的PCR片段的存在。 将一个具有大约3.94 kb和115 bp的￡co RI片段的质粒命名为pCR2.1-共有 c^///A通过DNA测序确认了克隆的PCR片^殳的DNA序列。
将质粒pCR2.1-共有用斩I和尸ac I消化，并且通过在TBE緩冲 液中进行2.0。/o琼脂糖电泳来分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了含有共有启动子的大约82 bp的片段。将质粒pNBT2 (pDG268A-PC[yIIIA/cryIIIAstab/SAV,美国专利No. 6，255，076)用斩I和尸"c I 消化，并且通过在TBE缓沖液中进行2.0%琼脂糖电泳来分析，再使用 QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了含有共有启动子的大约7162 bp的载体片段。将pNBT2载体片段和共有c^y//"启动子片段用T4 DNA连 接酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)按照制造商的说明 书连接起来，并且将大肠杆菌XL 10-GOLD Ultracompetent (超感受态)细胞 (Stratagene Corporation, La Jolla, CA, USA)用所述连接物(ligation)按照制造商 的说明书转化。使用BIOROBOT 9600从几个转化体纯化了质粒DNA,并 且通过用五coRI和^/H消化继之以在TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行 了测试。将一个具有大约5799 bp和1446 hp的预期片段的质粒命名为 pGME079 (图2)。
将质粒pGME079通过用I消化来线性化。将枯草芽孢杆菌168A4 用所述线性化的质粒"l安照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961, / Sac^n'o/. 81: 741-746的步骤转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉 素抗性。将一个在am少丄基因座插入了 P共有^瓜乂co^/" stab/a;^/f表达盒的 转化体命名为枯草芽孢杆菌GME201。
实施例2:构建修饰型trj/JX4 mRNA加工/稳定化序列
构建了》，饰型mRNA加工/稳定化序歹'J,其除了天然co^/WmRNA加工 /稳定化序列还包含第二 Shine-Dalgarno序列。
通过PCR从质粒pNBT3 (pDG268ANeo-PCI7lIIA/cryinAstab/SAV,美国专 利No. 6,255,076)扩增了包含c^//L4 mRNA加工/稳定化序列的大约524 bp 的片段，所述PCR使用下文所示的引物999255和999254。引物999254的 5'端并入了賓页夕卜的Shine-Dalgarno序歹'J的4卜体(complement)。
引物999255:
5'-AGCTTAATTAAAGATAATAT-3' (SEQ ID NO: 11) 引物999254:
5 '-GGCTGGATC ACCTCCTTTCTATCC ATTAGACGGTGC AAAT画3' (SEQIDNO: 12)
从质粒pNBT3使用下文所示的引物999253和999256扩增了大约596 bp的片段，该片段包含克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(^r/f)的N-末端编码 区。引物999253的5'端并入了额外的Shine-Dalgamo序列并且与引物999254 的5'端互补。
引物999253:
5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTATGAAAAATCATTTTAT C-3'(SEQIDNO: 13) 引物999256:
5'-AAGCTTGCGCCACCACGAAT-3' (SEQ ID NO: 14)
两个PCR都使用50 ng质粒pNBT3模板DNA,每种？ 1物各0.4 pM, dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各200 ^M,含2.5 mM MgCl2的IX PCR緩冲 液II,以及2.5单位的％《DNA聚合酶在50 |Lil反应体积中进行。将反应在 ROBOCYCLER 40热循环仪(Stratagene Corporation, Lo Jolla, CA， USA)中 进行，程序设定为1个循环的95°C 2分钟；30个循环，每个为95°C 1分钟， 55°C 1分钟和72°C 2分钟；和1个循环的72°C 5分钟。
通过在TBE緩沖液中的0.8。/。琼脂糖电泳分析了两个PCR反应，并且使 用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了产物。将两个纯化的PCR产物用作 模板DNA进行第三PCR,其使用引物999255和999256，藉由引物999593 和999594的序列提供的互补端将两个片段融合。
使用每种纯化的PCR片段50 ng， dATP、 dCTP、dGTP和dTTP各200 |LiM, 含2.5 mM MgCl2的IX PCR緩冲液II,以及2.5单位的DNA聚合酶进 行了 PCR。反应在ROBOCYCLER 40热循环仪中进行，程序设定为1个 循环的95。C 2分钟；5个循环，每个为95°C 1分钟，55°C 1分钟和72°C 2 分钟；然后向反应中加入每种引物各0.4 (iM，再进行25个循环，每个为95°C 1分钟，55°C 1分钟和72°C 2分钟；和最终1个循环的72°C 5分钟。通过在 TBE緩冲液中进行0.8%琼脂糖电泳使PCR产物显影(visualize)。
将获得的大约1080 bp的PCR产物使用TOPO TA Cloning Kit克隆入 pCR2.1,再按照制造商的说明书转化入ONE SHOT TOP10化学感受态大 肠杆菌细胞。使用BIOROBOT 9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且 通过DNA测序进行了分析以鉴定含有期望的修饰型mRNA加工/稳 定化序列的那些。将一个具有预期的DNA序列的质粒命名为pCR2.1-stabx2。实施例3:构建质粒pNBT48
将质粒pNBT3 (pDG268MCSAneo-P一^4/co^" stab/SAV;美国专利 5,955，310)用胡I和Bam ffl消化，并且通过在TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖 电泳进行了分析，再使用QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒纯化了大约6704 bp 的载体片段。将质粒pNBT8 (pDG268MCS-P,2/SAV;美国专利No. 5,955,310) 用和Bam HI消化，并且通过在TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行
该片段包含解淀粉芽孢杆菌启动子和克劳氏芽孢杆菌a/^/7编码序列。 将pNBT3载体片段和P。my2-a/^//片段使用T4 DNA连接酶如制造商说明书 所述连接起来，并且将大肠杆菌DH5a细胞(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)用所述连接物按照制造商的说明书转化，在2X YT氨千青霉素平板上 在37。C选择氨爷青霉素抗性。
使用QIAPREP 8 Plasmid Kit (质粒试剂盒)(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)从一个转化体纯化了质粒DNA,并且通过〗吏用Wcol的限制酶消化继之 以在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析。鉴定了一个产生了大约 6802 bp和1304 bp的预期DNA片段大小的质粒并将其命名为pNBT48 (图3)。
实施例4:构建fl附3;g启动子-修饰型c/jJ/L4 mRNA加工/稳定化序列
构建了与修饰型cr>;//L4 mRNA加工/稳定化序列连接的awyg启动子。 将质粒pCR2.1-stabx2用尸ac I消化，并使用标准方法用T4 DNA聚合酶和 dNTPs将末端平端化。然后将平端化的质粒用7//^/III消化并且通过在TBE 緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约1067 bp的片段，该片段含有修饰型mRNA加工/稳定 化序列和a卩// N-末端编码区。
将质粒pNBT48用五c/ 136II和///"J III消化，并且通过在TBE緩冲液 中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 纯化了大约7601 bp的载体片段。将pNBT48载体片IS:和^f',饰型 mRNA加工/稳定化序列使用T4 DNA连接酶按照制造商的说明书连接起来， 并且将大肠杆菌DH5a细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化，在2X YT氨苄青霉素平板上在37。C选择氨苄青霉素抗性。使用BIOROBOT 9600 从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用iVcoI的限制酶消化继之以在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳进行了分析。鉴定了一个产生了大约 1800 bp的预期DNA片段大小的质粒并将其命名为pNBT55 (pDG268ANeo-P鹏^/mod. c7/tt4 stab/a/ r/7)(图4)。
实施例5:构建flmy2启动子-修饰型c/^/J/J mRNA加工/稳定化序列
构建了与修饰型mRNA加工/稳定化序列连接的amyG启动子。将 质粒pNBT55通过用Sea I消化来线性化。将枯草芽孢杆菌168A4用所述线性 化的质粒按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，见上文的方法转化，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落贴片 (patch)到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋 白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37。C篩选其新霉素壽丈 感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的flm少五基因中。鉴 定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在"mj^基因座插 入的P，e/mod. stab/apr/f表达盒)并将其命名为枯草芽孢杆菌BW199。
实施例6:构建"mj;^启动子-野生型c/y//L4 mRNA加工/稳定化序列
构建了与野生型mRNA加工/稳定化序列连接的启动子。 将质粒pNBT3用Pac I消化，并使用T4 DNA聚合酶和dNTPs将末端平端 化。然后将平端化的质粒用/f/"Jin消化，并且通过在TBE緩冲液中的0.8% 琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约 1067 bp的片段，该片段含有野生型a7j7/j mRNA加工/稳定化序列和克劳 氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(q/^/T) N-末端编码区。
将大约7601 bp的pNBT48载体片段(实施例4)和大约1067 bp的野生型 c^//L4 mRNA加工/稳定化序列片段使用T4 DNA连接酶按照制造商的说明 书连接起来，并且将大肠杆菌DH5a细胞用所述连接物按照制造商的说明书 转化，在2X YT氨千青霉素平板上在37。C选择氨苄青霉素抗性。使用 BIOROBOT 9600从几个转化体纯化了质粒DNA,并且通过使用iVco I的 限制酶消化继之以在TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析。鉴定了 一个生成了大约1800 bp的预期DNA片段大小的质粒并将其命名为pNBT56 (pDG268ANeo-P。^e/co^/" stab/a; r//)(图5)。实施例7:构建fl附j;2启动子-野生型cfy//" mRNA加工/稳定化序列
构建了与野生型c^//" mRNA加工/稳定化序列连接的启动子。将 质粒pNBT56通过用5ba I消化来线性化。将枯草芽孢杆菌168A4用所述线性 化的质粒按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961,见上文的方法转化，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落贴片到 TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋白酶生 产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37。C筛选其新霉素敏感性， 从而确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的am少五基因中。鉴定 了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在am;;五基因座插入 的P^e/cw//" stab/a/^7/表达盒)并将其命名为枯草芽孢杆菌BW198。
实施例8:评估flmj^启动子"务饰型c/jZr/X mRNA加工/稳定化序列
将枯草芽孢杆菌菌抹BW199的克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)生产 与釆用野生型co///" mRNA加工/稳定化序列的同基因##草芽孢杆菌菌林 BW198比较。将两种菌抹在含有25 ml PS-1培养基的250 ml摇瓶中在37°C 培养， 一式四份。在第3天(T1)、第4天(T2)和第5天(T3)取1 ml样品；并 且测定了澄清上清液的蛋白酶活性。
按照以下步骤测量蛋白酶活性。将培养物上清液在样品緩冲液(0.01% TWEEN , 100mMTRISpH8.5)中适当地稀释，其后对稀释的样品进行从1 倍到1/3倍再到1/9倍的系列稀释(seriesdilution)。将克劳氏芽孢杆菌碱性蛋 白酶标准品(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark; 4,260 NPU/g)相应地在样品 緩沖液中稀释以建立线性标准曲线。将总共20 pl的每种稀释品(包括标准品) 转移至96孔平底平板。向每孔加入200 (il Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA底物溶 液(每毫升DMSO 100 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA,按l:55.6稀释在100 mM TRISpH8.5中)，并且将平板在环境温度温育10分钟。在温育过程中，使用 BIOMEK 3000 (Beckman Coulter, Inc， Fullerton CA， USA)在405 nm测量反 应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。
相对结果示于图6。含有修饰型c^y/7L4 mRNA加工/稳定化序列的枯草 芽孢杆菌细胞到第5天为止平均产生了比含有野生型c^y//Z4 mRNA加工/稳 定化序列的细胞多大约65%的克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶。因此，与野生型 cry//" mRNA加工/稳定化序列相比，修饰型c 7i7" mRNA加工/稳定化序列使生产力得到显著的增加。
实施例9:构建co^JI4启动子4务饰型cij丌L4 mRNA加工/稳、定化序列
构建了与修饰型mRNA加工/稳定化序列连接的co^/"启动子。 将质粒pCR2.1-stabx2用尸gc I和I消化，并且通过在TBE緩沖液中的 0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了 大约568 bp的片段，该片段含有修饰型ctj//" mRNA加工/稳定化序列。将 质粒pNBT2用尸ac I和Sac I消化，并且通过在TBE緩沖液中的0.8°/。琼脂 糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6704 bp的载体片段。将pNBT2载体片段和修饰型mRNA加工/稳定化序 列片段使用T4 DNA连接酶按照制造商的说明书连接起来，并且将大肠軒菌 XLIO-Gold Ultracompetent细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化，在 2X YT氨千青霉素平板上在37-C选择氨节青霉素抗性。使用BIOROBOT 9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用Pac I和￡co RI的消化 继之以在TBE緩沖液中的0.8°/。琼脂糖电泳进行了测验。将一个具有大约 5882 bp和1388 bp的预期片段的质粒命名为pGME085 (图7)。
将质粒pGME085通过用I和5ba I消化来线性化，并且通过在TBE 緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6851 bp的载体片段。将枯草芽孢杆菌168A4用所述纯化的 质粒片,殳按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961，见上文的方法转孑匕，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗性。将一个在基 因座插入了 P一Wmod. co;//L4 stab/opr/7表达盒的转化体命名为枯草芽孢杆 菌GME202。
实施例10:构建共有启动子"务饰型c/j/iX4 mRNA加工/稳定化序列
构建了与修饰型C0;///」mRNA加工/稳定化序列连接的包含共有-35和 -10区的启动子。将质粒pGME079用尸ac I和&c I消化，并且通过 在TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6704 bp的载体片段。将pGME079载体片段和大 约568 bp的修饰型c^y//Z4 mRNA加工/稳定化序列片段(实施例9)使用T4 DNA连接酶按照制造商的说明书连接起来，并且将大肠杆菌XL 10-GOLD Ultracompetent细胞用所述连接物按照制造商的说明书转4匕，在2X YT氨千 青霉素平板上在37。C选择氨苄青霉素抗性。使用BIOROBOT 9600从几个 转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用户ac I和五co RI的消化继之以在TBE 緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了测验。将一个具有大约6704 bp和566 bp 的预期片段的质粒命名为pGME080(图8)。
将质粒pGME085通过用I和Sea I消化来线性化，并且通过在TBE 緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6851 bp的载体片段。将枯草芽孢杆菌168A4用所述纯化的 质粒片段按照Anagnostopouos和Spizizen, 1961,见上文的方法转化，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗性。将一个在amy丄基 因座插入了 P共有^,似/mod. stab/fl/ ri/表达盒的转化体命名为枯草芽孢 杆菌GME203。
实施例ll:评估枯草芽孢杆菌菌抹GME201、 GME202和GME203
创造了含有野生型c^y/ffi4启动子和未修饰的(野生型)mRNA加 工/稳定化序列的枯草芽孢杆菌菌抹充当基线对照用于与枯草芽孢杆菌菌抹 GME201、 GME202和GME203比较。按照Pitcher等，1989，^ ; /. M/cra&o/. 8: 151-156的方法，从包含插入在cwn)必基因座的Pco^>^/tt4 stab/apri/盒的枯草芽孢杆菌PL1801 wo/ffi::TnW7 (美国专利No. 5,955,310) 分离了基因组DNA。将枯草芽孢杆菌168A4用所述基因组DNA按照 Anagnostopoulos和Spizizen， 1961,见上文的方法转化，并且在TBAB氯霉 素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗性。将一个这样的转化体命名为枯草 芽孢杆菌GME200。
将枯草芽孢杆菌菌抹GME200、 GME201、 GME202和GME203在含有 25 ml PS-1培养基的250 ml摇瓶中在37。C培养， 一式三份。在第3天(T1)、 第4天(T2)和第5天(T3)取1 ml样品并且测定了澄清上清液的蛋白酶活性， 如实施例8中所述。
关于上述培养物的平均相对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶产值示于图9。 所述结果证明，从包含共有c^7/"启动子和/或i奮饰型mRNA加工/ 稳定化序列的构建体表达蛋白酶的菌抹(枯草芽孢杆菌GME201、 GME202 和GME203)全都产生了比枯草芽孢杆菌GME200更多的蛋白酶，在枯草芽孢杆菌GME200中蛋白酶是从与未修饰的mRNA加工/稳定化序列连 接的野生型c^y//"启动子表达的。枯草芽孢杆菌GME202与枯草芽孢杆菌 GME200提供了 73%的增加，同时枯草芽孢杆菌GME203相对于枯草芽孢杆 菌GME201提供了 13%的增加。枯草芽孢杆菌GME201与枯草芽孢杆菌 GME200相比提供了 133%的增加，而枯草芽孢杆菌GME203相对于枯草芽 孢杆菌GME202 4是供了 53%的增加。最高生产力来自启动子变体枯草芽孢 杆菌GME203,其包含共有P^脳和修饰型c^y//" mRNA加工/稳定化序列， 与枯草芽孢杆菌GME200相比其提供了 164%的增加。
实施例12:构建地衣芽孢杆菌宿主菌林MDT283
将地衣芽孢杆菌SJ1904 (WO 94/014968)用C-组分基因缺失质粒 (C-component deletion plasmid) pNBT38 (美国公开申请20050221446)按照 Xue等，1999, / Mz'craWo/. Me决o^y 34(3): 183-191的方法通过电穿孔转化。 简言之，使用1-5 ml在LBS中培养的地衣芽孢杆菌过夜培养物接种50 ml 新鲜LBS培养基，并且在37。C和250 rpm温育所述培养物。使培养物生长 至稳定期，并且在緩慢生长期之后培养物经历生长速率的增加时(指数生长 结束之后1-3小时)，通过在6500xg离心收获细胞。将细胞用50ml冰冷的 MSG(0.5M甘露醇，0.5M山梨糖醇，10%甘油)洗涤2次，并且重悬在大约 750 MSG中。如下转化细胞或将细胞储存在-20。C。将60 pl电感受态细胞 与质粒DNA在具有l-mm电极间隙的电穿孔杯中混合，并使用GENE PULSER⑧进行电脉沖，将GENE PULSER⑧设定为25 200 Q和1.0 kV。 然后将电穿孔的细胞转移至每毫升含有0.2 jig红霉素的950 piLBSM培养基 中来i秀导红霉素抗性。将转化体在34。C和250 rpm温育2.5-3小时，然后在 TBAB红霉素/林可霉素平板上在34。C选择红霉素抗性。
将一个这样的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50。C培养， 以选择pNBT38向染色体中C-组分基因处的整合。然后将一个这样的整合体 在不带选择性的VY培养基中在34。C培养，以使整合的质粒切下并丟失。将 培养物铺板在LB平板上，在37。C筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质粒 的丢失。如实施例2中所述，通过PCR,使用引物991173和991176测试了 几个红霉素敏感性克隆。
引物991173:5'-GAATTCGACGGCTTCCCGTGCGCC-3， (SEQ ID NO: 15) 引物991176:
5'-AAGCTTCCATTCAAACCTGGTGAGGAAG-3， (SEQ ID NO: 16) 将一个用PCR扩增了大约606 bp的片段的克隆(说明C-组分蛋白酶基因 从染色体缺失)命名为地衣芽孢杆菌MDT283。
实施例13:构建质粒栽体pMDT131和pMDT160
构建了质粒pMDT131和pMDT160以创建赋予氯霉素抗性的温度敏感
质粒o
通过将氯霉素抗性基因插入质粒pMRT074 (美茵公开申请20030175902) 构建了质粒pMDT131。将质粒pMRT074用五coRI消化，并且通过在U。C与 T4 DNA聚合酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN， USA)和每种 dNTPs各25 pM—起温育20分钟将末端平端化，其后通过在75。C温育10分 钟对聚合酶进行热灭活。然后将质粒用I消化，通it^TBE缓冲液中的0.8% 琼脂糖电泳进行分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约 4355 bp的载体片段。将质粒pNBTl (pDG268MCS;美国专利No. 6,255,076) 用￡co 47III和I消化，通# TBE緩冲液中的0.8°/。琼脂糖电泳进行分析， 并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约1222 bp的片段，该片段 含有caf基因和多克隆位点。将pMRT074载体片段与c^片l殳使用T4DNA连 接酶按照制造商的说明书连接，并且将枯草芽孢杆菌168A4用所述连接物按照 Anagnostopoulos和Spizizen, 1961,见上文的方法转化，在TBAB氯霉素平板 上在34。C选择氯霉素抗性。使用Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc.， Valencia, CA, USA)从一个转化体分离了质粒DNA,并且通过用HI消化继之以在TBE 缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了确认，其生成了大约3779 bp和1802 bp的 预期的片段。将所得质粒命名为pMDT131(图10)。
通过去除pMRT074的5aw ffl、 5Vwa I和Ap 718限制位点构建了质粒 pMDT159。将质粒pMRT074用BamHI和v^p718消化，并且通过在11。C与 T4 DNA聚合酶和每种dNTPs各25 , —起温育20分钟将末端平端化，其后 通过在75。C温育10分钟对聚合酶进行热灭活。通过在TBE緩沖液中的0.8% 琼脂糖电泳对消化的质粒进行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6022bp的载体片段。将纯化的片段用T4DNA连接酶按照制造商的说明书处理，并按照Anagnostopoulos和Spizizen ， 1961 ，见上文的方 法用所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌抹168A4,在TBAB红霉素/林可霉素平 板上在34。C选择红霉素抗性。将所得质粒命名为pMDT159 (图11)。通过限 制酶消化确i/v了 5awH、 5"mal和^sp718位点的丟失。
通过将氯霉素抗性基因引入pMDT159构建了质粒pMDT160。将质粒 pMDT159用￡co RI消化，并且通过在11。C与T4 DNA聚合酶和每种dNTPs 各25 |jM —起温育20分钟将末端平端化，其后通过在75。C温育10分钟对聚 合酶进行热灭活。然后将质粒用M f I消化并且通itt TBE緩冲液中的0.8% 琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约 4354 bp的载体片段。将质粒pNBTl用&o47III和A^I消化，通过在TBE 缓冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约1222 bp的片段，该片段含有基因和多克隆位点。 如上所述^吏用T4 DNA连接酶将pMRT074载体片段与pNBTl 片段连接， 并且将枯草芽孢杆菌168A4用所述连接物按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，见上文的方法转化，在TBAB氯霉素平板上在34。C选择氯霉素抗性。 使用Plasmid Midi Kit /人一个转化体分离了质粒DNA,并且通过用I消化 继之以在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了确认，其生成了大约2193 bp、 1817bp和1566bp的预期的片段。将所得质粒命名为pMDT160 (图12)。
实施例14:构建质粒pHyGe204
通过将pMRT044 (美国公开申请20030175902)的地衣芽孢杆菌am少丄片段 插入质粒载体pMDT160构建了质粒pHyGe203。将质粒pMDT160用Sma I 和历w/ III消化并且通过在TAE (40 mM Tris-20 mM乙酸钠-1 mM EDTA pH7.2)緩冲液中的1.0%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约5531 bp的载体片段。将质粒pMRT044使用Sma I 和历"dm消化并且通过在TAE緩冲液中的1.0%琼脂糖电泳进行了分析，再 使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约1072bp的片段，该片段含有 amy丄上游和下游片革殳。将pMDT160载体片,殳和pMRT044 awy丄片段使用 Rapid Ligation Kit (快速连接试剂盒)(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)按照制造商的说明书连接起来，并4姿照Anagnostopoulos 和Spizizen, 1961,见上文的方法用所述连接物转化枯草芽3包杆菌菌^朱168A4,在TBAB氯霉素平板上在34'C选择氯霉素抗性。将所得质粒命名为pHyGe203 (图13)。通过用iVcoI消化继之以在TAE緩冲液中的1,0%琼脂糖电泳确认了 所述质粒，其生成了大约5343 bp和1260 bp的预期的片段。
通过将c^/Z/J mRNA加工/稳定化序列和pNBT18 (pDG268MCSAneo-long co^/" stab/SAV,美国专利No. 6,255，076)的克劳氏芽孢杆菌a; /^基因 插入pHyGe203的a附y丄上游和下游片段之间构建了质粒pHyGe204。将质粒 pHyGe203用136II和Bam ffl消化并且通过在TAE緩沖液中的1.0%琼脂 糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6586 bp的载体片段。将质粒pNBT18用尸ac I消化，并且通过在irC与T4 DNA 聚合酶和每种dNTPs各25 |oM —起温育20分钟将末端平端化。然后将所述 消化的质粒用^W7HI消化并且通过在TAE緩沖液中的1.0%琼脂糖电泳进行 了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约1768bp的片段， 该片段含有mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌a/^7/基因。使 用Rapid Ligation Kit按照制造商的说明书将pHyGe203载体片段和mRNA加 工/稳定化序列/apr//片段连接，并按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961， 见上文的方法用所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌抹168A4,在TBAB氯霉素 平板上在34。C选择氯霉素抗性。将所得质粒命名为pHyGe204。通过用iVcoI 和用历"din的消化继之以在TAE緩冲液中的1.0%琼脂糖电泳确认了所述质 粒，对于iVcoI其生成了大约6249bp和2103bp的预期的片段，且对于/f/w/ III其生成了大约6743 bp和1609 bp的预期的片段。
实施例15:构建质粒pHyGe205
通过将修饰型c^//" mRNA加工/稳定化序列和pGME080的克劳氏芽 孢杆菌apr/Z基因插入pHyGe203的上游和下游片段之间构建了质粒 pHyGe205。将质粒pGME080用尸ac I消化，并且通过在11。C与T4 DNA聚 合酶和每种dNTPs各25 pM —起温育20分钟将末端平端化。然后将消化的 质粒用Bam HI消化并且通过在TAE緩冲液中的1.0°/。琼脂糖电泳进行了分 析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约1793 bp的片段，该 片段含有修饰型cry//Z4 mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌op^基 因。使用Rapid Ligation Kit按照制造商的说明书将pHyGe203 ￡c/ 136II/^wz HI载体片段(上文所述)和修饰型mRNA加工/稳定化序列/fl/^/f片段连接，并按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961,见上文的方法用所述连接物转化枯 草芽孢杆菌菌株168A4,在TBAB氯霉素平板上在34。C选择氯霉素抗性。 将所得质粒命名为pHyGe205 (图14)。通过用ATco I和用///"^III的消化继之 以在TAE緩冲液中的1.0%琼脂糖电泳确认了所述质粒，对于iVco I其生成 了大约6274 bp和2103 bp的预期的片段，且对于III其生成了大约6743 bp和1634 bp的预期的片段。
实施例16:构建质粒pHyGe206
通过PCR从地衣芽孢杆菌菌抹MDT220 (美国公开申请20050221446) 克隆了含有三联启动子的片段。按照Pitcher等，1989，见上文的方法从地 衣芽孢杆菌菌抹MDT220分离了基因组DNA。使用寡核苦酸引物994112和 060762 ， 用Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN， USA)按照制造商的说明书，从地衣芽孢杆菌MDT720基因
组DNA用PCR扩增了含有P呵L4!99/P短共有呵Q/PcrymA三联启动子的片段。所
述PCR在Eppendorf Mastercylcer梯度热循环仪中进行，程序设定为1个循 环的94°C 2分钟；11个循环，每个为94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 1分15 秒；15个循环，每个为94。C 30秒，58°C 30秒，72°C 1分15秒(对每个连 续的循环加5秒)；和1个循环的72°C 7分钟。 引物994112:
5'-GCGGCCGCTCGCTTTCCAATCTGA-3' (SEQ ID NO: 17) 引物060762:
5'-ATCGATAATAATTTATACACTATTCTATTGG-3， (SEQ ID NO: 18) 使用QIAQUICK PCR Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA)按 照制造商的说明书纯化了获得的大约991 bp的PCR产物，使用TOPO TA Cloning Kit将所述产物克隆入pCR2.1,再按照制造商的说明书转化入ONE SHOT TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将所得质粒命名为pHyGe201 (图 15)。通过DNA测序确认了 pHyGe201中的三联启动子序列。
通过将来自质粒pHyGe201的三联启动子插入质粒载体pMDT131构建 了质粒pHyGe206。将质粒pMDT131用C7a I和I消化并且通过在TAE 緩沖液的1.0%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约5568 bp的载体片段。将质粒pHyGe201用C7a I和iVof I消化并且通过在TAE缓冲液的1.0°/。琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约983 bp的载体片段，该片段含有三联启动子。 使用Rapid Ligation Kit按照制造商的说明书将pMDT131载体片^殳和三联启 动子片段连4娄，并按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961，见上文的方法用 所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌林168A4,在TBAB氯霉素平才反上在34°C 选择氯霉素抗性。将所得质粒命名为pHyGe206 (图16)。通过用尸ac I消化 继之以在TAE緩沖液中的1.0%琼脂糖电泳确认了质粒，其产生了大约3187 bp、 2490 bp和874 bp的预期的片段。
实施例17:构建在基因座插入了 mRNA加工/稳、定化序列
和克劳氏芽孢杆菌fl/w必基因的地衣芽孢杆菌茵株
将地衣芽孢杆菌菌抹MDT283如实施例12中所述用质粒pHyGe204转 化。然后将电穿孔的细胞转移至含有0.2 ng/ml红霉素的950 |il LBSM培养 基中来诱导红霉素抗性。将转化体在34。C和250 rpm温育2.5-3小时，然后 在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34。C选择红霉素抗性。
将一个这样的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50。C培养， 以选择pHyGe204向染色体中基因座处的整合。然后将一个这样的整 合体在不带选择的VY培养基中在34。C培养，以使整合的质粒切下并丟失。 将培养物铺板在LB平板上，在37。C筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质 粒的丢失。筛选在含有0.5。/。淀粉天青(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的 琼脂上不能形成澄清区域的红霉素敏感性菌落，这说明am^基因已经由 mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌印r/7基因代替。通过PCR 确认了在amj/￡基因座处c^/ZW mRNA加工/稳定化序列和qpr/Z基因的插 入，所述PCR使用结合上游的引物950872和结合在编码区内的 引物950984。将一个这样的菌抹命名为地衣芽孢杆菌HyGe208。
引物950872:
5'-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3' (SEQ ID NO: 19)
引物950984:
5'-CGACTTCCTCTTCCTCAGAG隱3' (SEQ ID NO: 20) 将地衣芽孢杆菌菌株MDT283用质粒pHyGe205通过电穿孔如上所述转化，在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34。C选择红霉素抗性。将一个这样 的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50。C培养，以选择pHyGe205 向染色体中"my丄基因座处的整合。然后将一个这样的整合体在不带选择的 VY培养基中在34。C培养，以使整合的质粒切下并丢失。将培养物在37。C铺 板在LB平板上，筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质粒的丟失。筛选在 含有0.5%淀粉天青的琼脂上不能形成澄清区域的红霉素敏感性菌落，这说 明am_y￡基因已经由修饰型mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆 菌qpr/Z基因代替。通过PCR确认了在amy丄基因座处c^y//" mRNA加工/ 稳定化序列和"/wW基因的插入，所述PCR使用上文所示的引物950872和 950984。将一个这样的菌抹命名为HyGe209。
实施例18:构建在fl/wj丄基因座插入了三联启动子和克劳氏芽孢杆菌 印rH基因的地衣芽孢杆菌菌林
将地衣芽孢杆菌菌抹HyGe208和HyGe209如实施例12中所述用质粒 pHyGe206转化，在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34。C选择红霉素抗性。 将一个这样的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50。C培养，以选
择pHyGe205向染色体中基因座处的整合。然后将一个这样的整合体 在不带选择的VY培养基中在34。C培养，以使整合的质粒切下并丟失。将培 养物在37。C铺板在LB平板上，筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质粒的 丢失。筛选在含有1%脱脂奶粉的琼脂上能够形成大的澄清区域的红霉素敏 感性菌落，这说明三联启动子已经插入到克劳氏芽孢杆菌ap^基因上游。 通过PCR确认了在基因座处a/ r//表达盒的存在，所述PCR使用上文
个这样的源自地衣芽孢杆菌HyGe208并且具有大约3094 bp的预期PCR产 物的菌抹命名为地衣芽孢杆菌HyGe210;将一个源自地衣芽孢杆菌HyGe209 并且具有大约3119 bp的预期PCR产物的菌抹命名为地衣芽孢杆菌 HyGe211。地衣芽孢杆菌菌抹HyGe210在am少丄基因座含有ajw7/表达盒，
该表达盒包含PamyL4199/P短共有amyQ/PcryllIA/cO^" Stab启动子。地衣芽孢杆菌菌
抹HyGe211在a附y丄基因座含有a/ r//表达盒，该表达盒包含PamyL4i99/P短共有 呵Q/PcryiiiA/mod. c^/7L4 stab启动子。通过对PCR产物进行DNA测序确认了 HyGe210和HyGe211中的opr//表达盒的序列。实施例19:评估三联启动子变体
将地衣芽孢杆菌菌抹HyGe210和HyGe211在适合于劳氏芽孢杆菌碱性 蛋白酶(AprH)产生的条件下在标准小发酵罐中培养，使用的培养基包含水解 马铃薯蛋白和矿物盐，及蔗糖补料(with a sucrose feed)。在发酵过程中的多 个时间点测定整体培养液样品的蛋白酶活性。
按照以下步骤测量蛋白酶活性。将培养物上清液在样品緩冲液(O.01 % TWEEN , 100 mM TRIS pH 8.5)中适当地稀释，其后对稀释的样品进行从1 倍到1/3倍再到1/9倍的系列稀释。将克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)标 准品(Novozymes A/S, Bagsvaerd， Denmark)在样品緩沖液中使用2倍步骤稀 释，起始于0.625 NPU/ml的浓度，并以0.078 NPU/ml的浓度结束。将总共 20 pl的每种稀释品(包括标准品)转移至96孔平底板。向每孔加入200 [il Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 底物溶液(每毫升 DMSO 100 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA,按1:55.6稀释在100 mM TRIS pH 8.5中)，并且 将平板在环境温度温育10分钟。在温育过程中，使用BIOMEK 3000在405 nm测量反应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。
结果示于图17。所述结果证明，从包含修饰型co^/Z4mRNA加工/稳定 化序列的三重启动子构建体表达蛋白酶的地衣芽孢杆菌HyGe211产生了比 地衣芽孢杆菌HyGe210更多的蛋白酶，在地衣芽孢杆菌HyGe210中蛋白酶 是从包含未修饰的co^tt4 mRNA加工/稳定化序列的三重启动子构建体表达 的。72小时的发酵之后，地衣芽孢杆菌HyGe211与地衣芽孢杆菌HyGe210 相比提供了 61%的增加。
实施例20:构建pMDT100
质粒pMDT100是一种含有P呵L4w/P短共有抓yQ/PcrymA/crylIIAstab三联启 动子的大肠杆菌复制子，所述三联启动子驱动克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基 因Op^0的表达。这种a/^7/表达盒和pC194 (Horinouchi和Weisblum, 1982, / Ba"m'o/. 150: 804-814)的o /基因的两侧翼为枯草芽孢杆菌a-淀粉酶(amy^) 基因的片段，这允许a卩//表达盒和基因藉由两个片段通过双同源 重组插入枯草芽孢杆菌染色体的am;^基因座。用另一基因替代pMDT100 中的a/^7/基因，这允许该基因在枯草芽孢杆菌中插入染色体并表达。pMDT100的构建在下文描述。
质粒pNBT51。使用QIAGEN Plasmid Kit (质粒试剂盒)(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)按照制造商的说明书从作为宿主的大肠杆菌DH5a分离 了质粒pNBTIO (pDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV ; 美国专利No. 6,255,076)，并且将该质粒用C7a I和Sea I消化。切割发生在ap^/编码序列 中大约在第326密码子处的C/a I位点，而非在大约第23密码子处的C7a I 位点，其因大肠杆菌Dam DNA曱基转移酶导致的曱基化而封闭。使用 Klenow片段(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA)和dNTPs按照制 造商的说明书将Cto I末端平端化。将消化的质粒通过在TBE緩沖液中的 0.8%琼脂糖电泳进行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化 了大约6615 bp的载体片段。将质粒pOS4301 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, OH， USA)用I和Sea I消化，并且将1 末端使用Klenow片段和dNTPs平端化，如上所述。将消化的质粒通过在 TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约840 bp的片段，该片段含有大肠杆菌n77万转录终 止子。同样的840 bp IASca I片段可以从载体pKK223-3 (GE Healthcare, Piscataway, NJ， USA)(图18)分离。使用T4 DNA连接酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)按照制造商的说明书将pNBT10载体片段 和含终止子的片段连接起来，并且将大肠杆菌DH5a细胞用所述连接物按照 制造商的说明书转化，在2X YT氨千青霉素平板上在37。C选择氨节青霉素 抗性。将所得质粒命名为pNBT51 (pDG268-PciyIIIA/crymAstab/SAVA)(图19)。
质粒pNBT52。将质粒pNBT51用斩I消化，并且通过在11°C与T4 DNA 聚合酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和每种dNTPs各 25 —起温育20分钟将末端平端化，其后通过在75。C温育10分钟对聚合 酶进行热灭活。然后将平端化的质粒用Dra III消化，并且通过在TBE緩沖 液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 纯化了大约5920 bp的载体片段。将质粒pNBT20 (pDG268MCS画P短共有 amy( /SAV;美国专利No. 6，255，076)用￡>ra III和￡c/ 136II消化，并且使用 QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约1641 bp的片段，该片段含有短
共有a附y2启动子(P短共有呵Q)。如上所述将pNBT51载体片段和P短共有amyQ片
段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌DH5a细胞，在2X YT氨苄青霉素平板上在37。C选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Minipr印 Kit (小量制备试剂盒)从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用
I消化，并且通过在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析。将一 个具有大约4873 bp和2688 bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT52 (pDG268-P短共有呵Q/Pcry脆/crylIIAstab/SAVA)(图20)。
质粒。NBT53。将质粒pNBT6 (pHP13amp-SAV;美国专利No. 6,255,076) 用S/ I和Sac I消化，并且通过在TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行了 分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6438 bp的载体片 段。将质粒pNBT52用胡I和&c I消化，并且通过在TBE緩冲液中的0.8% 琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约 727bp的片,殳，该片段含有P短共有卿Q/PcrymA/crymAstab串联启动子。如上所 述将pNBT6载体片段和P短共有呵Q/P一nA/crylIIAstab片段连接，并且如上所 述用所述连接物转化大肠杆菌DH5a细胞，在2X YT氨千青霉素平板上在 37°C选择氨节青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit从几个转化体分 离了质粒DNA，将所述质粒DNA用尸w II消化，并且通过在TBE緩沖液 中的0.8。/。琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有大约4卯3bp、 1320 bp和942 bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT53 (pHP13amp-P短共有 amyQ/PcryI1IA/cryIIIAstab/SAV)(图21)。
质粒pNBT54。将质粒pNBTl (pDG268MCS;美国专利No. 6,255,076) 用^S刀I和Bam HI消化，并且通过在TBE緩沖液中的0.8°/。琼脂糖电泳进行 了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6040 bp的载体 片段。将质粒pNBT53用S刀I和Bam HI消化，并且通过在TBE緩冲液中的 0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了 大约1953 bp的片段，该片段含有P短共有呵Q/P一nA/crylIIAstab/SAV表达盒。 如上所述将pNBTl载体片段和P短共有呵Q/PcrymA/crylIIAstab/SAV片段连接， 并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌DH5a细胞，在2XYT氨千青霉素 平板上在37。C选择氨千青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit从几个 转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用邻I和Btwz HI同时消化，其 后在TBE緩沖液中进行0.8。/。琼脂糖凝胶电泳。将一个具有大约6040 bp和 1953 bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT54 (pDG268MCS-P短共有 amyQ/PcrymA/crymAStab/SAV)(图22)。质粒pNBT35。将质粒pNBT2 (pDG268MCSA-PreryIIIA/cryniAstab/SAV; 美国专利No. 6，255,076)用邻I和Saw HI消化，并且通过在TBE緩冲液中 的0.8%琼脂糖凝胶电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 纯化了大约5394 bp的载体片段。将质粒pNBT54用胡I和HI消化， 并且通过在TBE緩冲液中的0.8。/。琼脂糖凝胶电泳进^f亍了分析，再使用
共有amyQ/PcrymA/cryniAstab/SAV表达盒。如上所述将pNBT2载体片段和P短共有 amyQ/PcryiiiA/cryinAstab/SAV片段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠 杆菌DH5a细胞，在2X YT氨节青霉素平板上在37。C选择氨爷青霉素抗性。 使用QIAPREP 8 Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA,将所述质粒 DNA用iVco I消化，并且通过在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳进行 了分析。将一个具有大约5492 bp和1855 bp的预期限制片段的质粒命名为 pNBT35 (pDG268MCSA國P SMamyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(图23)。
质粒pNBT30。将质粒pNBT30构建成含有am_y￡基因启动子(美国专利 No. 6，100，063)的amyL4199变体的PCR克隆。按照Pitcher等，1989,见上 文的方法分离了地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA。 ^使用下文所示的引物 950872和991151通过PCR从地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA扩增了 amj^W卯启动子(P咖yL，9)基因。引物950872并入了胡I限制位点，而引物 991151并入了 &^1限制位点和？咖^4199的变体核苷酸。
引物950872:
5'-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT画3' (SEQ ID NO: 21)
引物991151:
5'誦GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3' (SEQ ID NO: 22) 使用AMPLITAQ Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems， Foster City, CA,USA)按照制造商的推荐进行了 PCR，只是MgCl2浓度是3mM,而非标 准的1.5mM。扩增反应(50^I)由10mMTris-HCl(pH8.3), 50mMKCl， 3.0 mM MgCl2,每种dNTP各200 (iM,每种引物各0.5 (iM， 0.25单位的 AMPLITAQ Gold DNA聚合酶和大约200 ng模板DNA组成。所述PCR在 ROBOCYCLER 40 Temperature Cycler中进行，程序设定为1个循环的95°C 9分钟；30个循环，每个循环95°C 1分钟，55°C 1分钟和72°C 1分钟；和1个循环的72 °C 3分钟。
将获得的大约625 bp的PCR产物使用TOPO TA Cloning Kit克隆入载 体pCR2.1 ，再按照制造商的说明书转化入ONE SHOT TOP10化学感受态 大肠杆菌细胞。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒 DNA，并且通过用￡co RI消化继之以在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳分 析了克隆的PCR片段的存在。将一个具有大约3913 bp和640 bp的预期的 限制片段的质粒命名为pNBT30 (pCR2.1-amyL4199)(图24)。通过DNA测序 确认了克隆的PCR片段的DNA序列。
质粒pNBT31。将质粒pNBT3 (pDG268MCSAneo-PrcryIIIA/cryinAstab/SAV; 美国专利No. 6，255,076)用邻I和&c I消化，并且通过在TBE緩冲液中的 0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了 大约7931 bp的载体片段。将质粒pNBT30用S/H和Sac I消化，并且通过 在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约612 bp的片段，该片段含有P咖yL4199。如上所述将 pNBT3载体片段和P呵i^99片段连接，并且按照制造商的说明书用所述连接 物转化大肠杆菌XL 1-Blue细胞(Stmtagene Corporation, La Jolla, CA, USA), 在2XYT氨节青霉素平板上在37。C选择氨千青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，将所迷质粒DNA用iVco I消 化，并且通过在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有 大约6802 bp和1741 bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT31 (图25)。
质粒pNBT36。将质粒pNBT35用胡I消化，并且使用T4 DNA聚合酶 和dNTPs将末端平端化，如上所述。然后将平端化的质粒用￡>ra III消化并 且通过在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析。使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约5808 bp的载体片段。将质粒pNBT31用Dra III 和￡c/ 136II消化，通过在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，并 且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约2150 bp的片段，该片段
含有P呵L4W。如上所述将pNBT35载体片段和P加yL4,99片段连接，并且按
照制造商的说明书用所述连接物转化大肠杆菌SURE⑧细胞(Stratagene Corporation, La Jolla, CA, USA)，在2X YT氨千青霉素平板上在37°C选择氨 千青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒 DNA,将所述质粒DNA用TVco I消化，并且通过在TBE緩冲液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有大约5492 bp和2466 bp的预期限制片 段的质粒命名为pNBT36 (图26)。
质粒pMDT100。将质粒pNBT13 (pDG268Aneo-P咖yL/P一nA/crylIIAstab/ SAV;美国专利No. 6,255,076)用Dra III和Sgc I消化，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约6395 bp的载体片段。将质粒pNBT36用Z>a III 和&c I消化，并且通过在TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分析，再 使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了大约2873 bp的片段，该片段含
有P呵L4199/P呵Q(sc/PcrylIIA三联启动子。如上所述将pNBT13载体片段和
PamyL4199/PamyQ(sc/PcrymA片段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌 SURE⑧细胞，在2XYT氨千青霉素平板上在37。C选择氨节青霉素抗性。使 用QIAPREP 8 Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA,将所述质粒 DNA用I消化，并且通过在TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行了分 析。将一个具有大约4974 bp和4294 bp的预期限制片^R的质粒命名为 pMDT100 (图27)。
将质粒pMDT100通过用5ba I的消化线性化。按照Anagnostopoulos和 Spizizen， 1961,见上文的方法用所述线性化的质粒转化枯草芽孢杆菌168A4, 并且在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落 贴片到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋 白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37。C篩选其新霉素 敏感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的amj;五基因中。 鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在amj必基因座 插入的PamyL4i99/P短共有amyQ/PcrymA/co^/" stab/a;^//盒)并将其命名为枯草芽孢 杆菌MDT130。
实施例21:构建pMDT174
将质粒pMDT100和pGME080用户ac I和Sac I消化。将消化的质粒通 过在TBE緩沖液中的0.8%琼脂糖电泳进行分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化了含有修饰型稳定物的pGME080的大约566 bp 的片段和pMDT100的大约8727 bp的载体片段。如上所述使用T4 DNA连 接酶将纯化的片段连接起来，并且将大肠杆菌XL10-GOLD Ultracompetent 细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化。使用BIOROBOT 9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过用F肌4HI消化继之以在TBE緩沖液 中的0.8%琼脂糖电泳进行了测试。预期对期望的连接产物进行消化将产生 大约36个片段，包括一个预期不从pMDT100产生的大约912 bp的片段， 并且排除一个预期从pMDT100产生的大约1045 bp的片段。将一个具有这 样的限制图型的质粒命名为pMDT174 (图28)，其含有包含三联启动子的 a^7/表达盒，及修饰型c^//" mRNA加工/稳定化序列(P呵L4^9/P短共有 amyQ/PcryiiiA/mod. c^y/7Z4 stab)。
将质粒pMDT174通过用Sea I消化来线性化。按照Anagnostopoulos和 Spizizen, 1961,见上文的方法用所述线性化的质粒转化枯草芽孢杆菌168A4， 并且在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落 贴片到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋 白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37°C筛选其新霉素 敏感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的基因中。 鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在"my五基因座
插入的PamyL4199/P短共有amyQ/PcrylIlA/mod. C^y/7L4 Stab/a; r//盒)并将其命名为冲古草
芽孢杆菌MDT131。
实施例22:评估枯草芽孢杆菌中的三联启动子变体
将质粒pMDT100和pMDT174通过用5Wc I消化来线性化。按照 Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，见上文的方法用所述线性化的质粒转化 枯草芽孢杆菌168A4,并且在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯 霉素抗性。通过将菌落贴片到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯 霉素抗性转化体的蛋白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在 37°C筛选其新霉素敏感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色 体的am;^基因中。鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体；
将一个源自pMDT100的转化体(具有在基因座插入的P抓yL4!99/P短共有
amyQ/PcryiiiA/c7//Z4 stab/a/^i/盒)命名为枯草芽孢杆菌MDT130,并且将一个源
自pMDTl74的转化体(具有在"m)必基因座插入的P呵L4199/P短共有呵Q/PcrylIIA/
mod. cry//" stab/a^7/盒)命名为枯草芽孢杆菌MDT131。
按照Pitcher等，1989,见上文的方法从枯草芽孢杆菌菌林MDT130和 MDT131分离了基因组DNA。将枯草芽孢杆菌A164A5 (美国专利No.5,891,701)用所述基因组DNA按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961,见上 文的方法转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37。C选择转化体的氯霉素抗 性。将一个源自MDT130 DNA的转化体(具有在基因座插入的 P,L4i99/P短共有呵Q/PcryiiiA/co^/" stab/q^T7盒)命名为MDT134;将一个源自 MDT131 DNA的转化体(具有在基因座插入的P呵L4,99/P短共有 amyQ/PcryiiiA/mod. C7y/tt4 stab/a; r//盒)命名为MDT135。
将枯草芽孢杆菌菌林MDT134和MDT135在含有50 ml PS-1培养基的 250 ml摇瓶中在37。C培养， 一式三份。在第3天、第4天和第5天取样， 并且如上所述测定了整体培养液的蛋白酶活性。
结果示于图29。所述结果证明，从包含修饰型co^/Z4mRNA加工/稳定 化序列的三重启动子构建体表达蛋白酶的枯草芽孢杆菌MDT135，.产生了比 枯草芽孢杆菌MDT134更多的蛋白酶，在枯草芽孢杆菌MDT134中蛋白酶 是从包含未修饰的co^/" mRNA加工/稳定化序列的三重启动子构建体表达 的。与枯草芽孢杆菌MDT134相比，枯草芽孢杆菌MDT135在3天之后提 供了 87%的增加，在4天之后提供了 100%的增加，并且在5天之后提供了 58%的增力口。
在本文描述并且提出权利要求的发明的范围不受本文公开的多个具体 方面的限制，因为这些方面旨在例举本发明的几个方面。本发明的范围意图 包括任何等同的方面。事实上，除了本文明示和描述的那些之外，本领域技 术人员根据前文的描述显然能想到本发明的各种修改形式。随附权利要求书 的范围也意图包括这样的修改形式。如有沖突，当以包括定义在内的本申请 公开内容为准。
本申请引用了多篇参考文献，在此通过引用将它们的公开内容完全并入 本申请。
权利要求
1.一种在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包括(a)在有益于产生具有生物学活性的多肽的培养基中培养细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码所述具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高表达；(b)从培养基分离具有生物学活性的多肽。
2. 权利要求1的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列获得自 cr_y//Z4 mRNA加工/稳定化序列或SP82 mRNA加工/稳定^<序列。
3. 权利要求1的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO: 6或其保留mRNA稳定化功能的部分。
4. 权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。
5. 权利要求l的方法，其中所述细菌宿主细胞含有一个或多个(几个)拷 贝的核酸构建体。
6. 权利要求1的方法，其中所述核酸构建体还包含选择标记基因。
7. 权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞不含外源选择标记基因。
8. —种包含核酸构建体的细菌细胞，该核酸构建体包含与编码具有生物 学活性的多肽的多核苦酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子 区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苦酸序列核糖体结合位点 上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定 化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更 高表达。
9. 权利要求8的细菌细胞，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列获 得自co;//" mRNA加工/稳定化序列或SP82 mRNA加工/稳定化序列。
10. 权利要求8的细菌细胞，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列 是SEQ ID NO: 6或其保留mRNA稳定化功能的部分。
11. 权利要求8的细菌细胞，其是芽孢杆菌属细胞。
12. 权利要求8的细菌细胞，其中所述细胞含有一个或多个(几个)拷贝 的核酸构建体。
13. 权利要求8的细菌细胞，其中所述核酸构建体还包含选择标记基因。
14. 权利要求8的细菌细胞，其中所述细菌宿主细胞不含外源选择标记基因。
15. —种用于产生不含选择标记的细菌细胞突变体的方法，包括缺失细 菌细胞的选择标记基因，其中所述细菌细胞包含核酸构建体，该核酸构建体 包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子 区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核香酸 序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰 型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所 述多核普酸序列的更高表达。
16. 权利要求15的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列获得 自mRNA加工/稳定化序列或SP82 mRNA加工/稳定化序列。
17. 权利要求15的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳、定化序列是 SEQIDNO: 6或其保留mRNA稳定化功能的部分。
18. 权利要求15的方法，其所述细菌宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。
19. 权利要求15的方法，其中所述细菌细胞含有一个或多个(几个)拷贝 的核酸构建体。
20. 权利要求15的方法，其中所述核酸构建体还包含选择标记基因。
21. 权利要求15的方法，其中所述细菌细胞不含外源选择标记基因。
22. —种通过权利要求15的方法获得的不含选择标记的芽孢杆菌属细 胞突变体。
23. —种用于获得细菌宿主细胞的方法，包括向细菌宿主细^^导入核酸 构建体，该核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可 操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活 性的多肽的多核香酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化 序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳 定化序列相比促使所述多核苷S吏序列的更高表达。
24. 权利要求23的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列获得 自co^/" mRNA加工/稳定化序列或SP82 mRNA加工/稳定化序列。
25. 权利要求23的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列是 SEQ ID NO: 6或其保留mRNA稳定化功能的部分。
26. 权利要求23的方法，其所述细菌宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。
27. —种包含修饰型mRNA加工/稳定化序列的分离的核酸，其中所述 修饰型mRNA加工/稳定化序列经过重組修饰包含至少一个额外拷贝的 Shine-Dalgamo序列，并且其中在将所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与启 动子区和编码生物学物质的多核苷酸可操作地连接时，所述修-饰型mRNA 加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸 序列的更高表达。
28. 权利要求27的分离的核酸，其中所述饰型mRNA加工/稳定化序列 获得自mRNA加工/稳定化序列或SP82 mRNA加工/稳定化序列。
29. 权利要求27的分离的核酸，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序 列是SEQ ID NO: 6或其保留mRNA稳定化功能的部分。
30. —种核酸构建体，其包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸 可操作地连接的启动子区和权利要求27的包含修饰型mRNA加工/稳定化序 列的核酸，所述核酸位于启动子区的下游和所述编码具有生物学活性的多肽 的多核苷酸核糖体结合位点的上游。
31. —种重组表达载体，其包含权利要求30的核酸构建体。
全文摘要
本发明涉及在细菌细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的培养基中培养细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码所述多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达；和(b)从培养基分离具有生物学活性的多肽。本发明还涉及这样的修饰型mRNA加工/稳定化序列，核酸构建体，和细菌宿主细胞，以及获得这些细菌宿主细胞的方法。
文档编号C12N15/75GK101611145SQ200780051650
公开日2009年12月23日 申请日期2007年12月19日 优先权日2006年12月21日
发明者威廉·威德纳, 格洛丽亚·埃里克森, 迈克尔·托马斯 申请人:诺维信股份有限公司