专利名称：：具有新的底物特异性的laglidadg归巢核酸内切酶变体及其用途的制作方法具有新的底物特异性的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体及其用途本发明涉及改造出具有新的底物特异性的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体的方法。本发明还涉及可通过所述方法获得的变体，编码所述变体的载体，经所述载体修饰的细胞、动物或植物，以及所述归巢核酸内切酶变体及衍生产品用于遗传工程、基因组治疗和抗病毒治疗的用途。大范围核酸酶(meganuclease)的定义是具有大(1245bp)切割位点的序列特异性核酸内切酶，该酶可以在活细胞中的特定基因座处引起DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB)(Thierry,A和DujonB.,NucleicAcidsRes.，1992,20,5625-5631)。大范围核酸酶已用于在培养细胞和植物中在其乾序列附近引发同源重组(Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14,8096-8106;Choulika等，Mol.Cell.Biol"1995，15，1968-1973;Donoho等，Mol.Cell.Biol，1998，18,4070-4078;Elliott等，Mol.Cell.Biol"1998，18，93-101;Sargent等，Mol.Cell.Biol"1997,17,267-277;Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996，93，5055-5060;Chiurazzi等，PlantCell,1996,8,2057-2066),这使得大范围核酸酶所诱导的重组成为基因组工程中高效且有力的方法。长久以来，大范围核酸酶所诱导重组的应用受到天然大范围核酸酶种类的限制，当前技术的主要限制是需要在目标基因座中预先引入大范围核酸酶切割位点。因此，改造出切割选定乾标的重新设计的大范围核酸酶正在深入研究中。这样的蛋白质可用于切割天然染色体序列，并为基因组工程的广泛应用开辟了新的前景。例如，大范围核酸酶可用于在染色体中敲除内源基因或敲入外源序列。它还可用于在原位精确修正与单基因遗传病相关的突变，从而避免由于当前基因治疗方法中使用的随机插入转基因所面临的风险(Hacein醒Bey-Abina等，Science,2003，302，415-419)。最近，将Cys2-扭s2型锌指蛋白(ZFP)的锌指DNA结合结构域与/^tl核酸内切酶的催化结构域融合，用以在多种细胞类型中诱导重组，所述细胞类型有哺乳动物培养细胞(包括人淋巴样细胞)、植物和昆虫细胞(Smith等，NucleicAcidsRes,1999，27,674-81;Pabo等，Annu.Rev,Biochem，2001，70，313-40;Porteus,M.H.和Baltimore,D.,Science,2003,300，763;Urnov等，Nature,2005，435，646-651;Bibikova等，Science,2003,300，764;Durai等，NucleicAcidsRes"2005，33，5978-59卯；PorteusM.H.，Mol.Ther.,2006，13,438-446)。ZFP的结合特异性相对易于操作，并且现在可得到能结合许多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的多种新型人工ZFP(Pabo等，前文引用；SegalD.J.和Barbas，C.F.,Curr.Opin.Biotechnol"2001，12，632-637;Isalan等，Nat.Biotechnol"2001，19，656-660)。然而，基因组工程应用的一个主要问狄保留非常窄的特异性，而目前尚不清楚ZFP是否满足治疗性应用中极其严格的要求。另外，这些融合蛋白已证实在果蝇(Bibikova等，Science,2003，300，764;Bibikova等，Genetics,2002,161，1169-1175)和哺乳动物NIHT3细胞(Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617;Porteus，M.H.和Baltimore,D.，Science,2003，300，763;Porteus，M.H.和Carroll,D.，Nat.Biotechnol.,2005，967-973)中具有高毒性，这是可能由于频繁的异位切割(off-sitecleavage)所致的基因毒性效应(Porteus,M.H"Mol.Ther.，2006,13，438-446)。在自然界中，大范围核酸酶基本上以归巢核酸内切酶(homingendonuclease,HE)为代表，所述归巢核酸内切酶是由可移动遗传元件编码的核酸内切酶家族，其功能是在称作"归巢"的过程中起始DNA双链断裂(DSB)所诱导的重组事件(Chevalier,B.S.和Stoddard,B丄.，NucleicAcidsRes"2001，29，3757-3774;Kostriken等，Cell;1983，35,167-174;Jacquier,A.和Dujon,B.，Cell,1985,41，383-394)。已在细菌、真核生物和古细菌中鉴定出数百种HE(Chevalier,B.S.和Stoddard,B丄.，NucleicAcidsRes.,2001，29,3757-3774);然而在选t基因中发现HE切割位点的概率却极低。由于HE的生物学功能以及就效率和特异性而言出色的切割特性，HE提供了衍生出用于基因组工程的新核酸内切酶的理想平台。另外，除了其精巧的特异性以外，已显示归巢核酸内切酶的毒性低于ZFP，这可能是由于更高的特异性导致(Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617;Porteus,M.H.和Baltimore,D.，Science,2003，300，763;Porteus,M.H.和Carroll,D.，Nat.Biotechnol.,2005，23，967-973)，上述两个特征在治疗性应用中是必要的。过去十年中已积累了允许相对好地表征四个HE家族中最大的LAGLIDADG家族的数据(Chevalier,B.S.和Stoddard,B丄.，NucleicAcidsRes.，2001，29，3757-74)。LAGLIDADG是指在整个家族中事实上保守的唯一序列，并发现其在蛋白质中以一个或两个(更经常)拷贝存在。具有单个基序的蛋白质(如I-OeI)(Wang等，NucleicAcidsRes.，1997,25，3767-3776)形成同二聚体并切割回文或假回文DNA序列，而较大的双基序蛋白质(如Mcel)(Jacquier，A.和Dujon，B.，Cell"1985,41，383-394)或I國D附oI(Dalgaard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993，卯，5417-5417)是单体，并切割非回文靶标。已将九种不同的LAGLIDADG蛋白(结合或未结合DNA)结晶，它们的核心结构表现出非常显著的保守性，这与其在一级序列水平缺少相似性相反(Heath等，NatureStruct.Biol.,1997，4,468-476;Duan等，Cell,1997，89，555-564;Silva等，J.Mol.Biol"2003，286,1123-1136;Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001，8，312-316;Jurica等，Mol.Cdl.，1998，2，469-476;Chevalier等，J.Mol.Biol"2003，329，253-269;Moure等，J.Mol.Biol"2003,334,685-695;Moure等，Nat.Struct.Biol"2002，9,764-770;Ichiyanagi等，J.Mol.Biol"2000，300，889-卯1;Gimble等.J.Biol.Chem.，1998，273,30524-30529;Bolduc等，GenesDev.2003，17，2875-2888;Silva等，J.Mol.Biol"1999，286，1123-1136;Nakayama等，J.Mol.Biol"Epub2006年9月29日；Spiegel等，Structure,2006，14，869-880)。与其结合DNA的结晶结构(Jurica等，Mol.Cell"1998，2,469-476;Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001，8，312-316;Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)相反，未与DNA结合的I-Oel结构(Heath等，NatureStruct.Biol.，1997,4,468-476)显示在不对称单元中只有一个单体。结构比较表明，LAGLIDADG蛋白采用类似的活性构象，并且其自我结合形成两个堆积的a-螺旋，所述a-螺旋使两个单体或表观结构域分隔开。在此核心结构(图1)中，两个单体中或者双LAGLIDAG蛋白的两个结构域中的两个特征性appa即a折叠彼此相对，具有双重对称性(two-foldsymmetry)。在LAGLIDADGa-螺旋的任一侧上，4条链的p片层形成DNA螺旋大沟上的鞍部(saddle)，这提供了使该蛋白质与耙DNA序列之半位点相互作用的DNA结合界面(Chevalier等，Nat.Struct.Biol,2001，8,312-316;Jurica等，Mol.Cell,1998，2，469-476)。催化位点位于中央，由两个单体中的螺旋形成。就在催化位点上方，两个LAGLIDADGa-螺旋在二聚化界面也发挥关键作用。除了该核心结构以外，还可发现其它结构域，例如PU"I(—种内含肽)，其具有蛋白质剪接结构域以及另外的DNA结合结构域(Moure等，Nat.Struct.Biol"2002，9，764-770;Pingoud等，Biochemistry,1998，37，8233-8243)。通过诱变和筛选/选择来改变DNA结合蛋白的底物特异性是一项困难的任务(Lanio等,ProteinEng.,2000,13，275-281;Voziyanov等，J.Mol.Biol"2003，326，65-76;Santoro等，P.N.A.S"2002，99，4185-4190;Buchholz,F.和Stewart,A.F.,Nat.Biotechnol.,2001，19，1047-1052)。由于HE的主要特征是具有大的DNA识别位点，这项任务甚至更加困难。对I-Od/DNA晶体结构的分析表明，在每个单体中，9个残基(S32、Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68和R70)与归巢位点中的8个碱基(位于士3、4、5、6、7、9、10和11位)直接相互作用(Jurica等，Mol.Cell"1998，2，469-76;Chevalier等，J.Mol.Biol"2003，329，253-269)，其随机化导致出现209种组合，该数目超出当前任何筛选的能力。此外，总共28个(左侧单体)或24个(右侧单体)水分子介导了蛋白质/DNA界面中核苷酸与蛋白质侧链的额外接触(Chevalier等，J.Mol.Biol.,2003，329，253-269)。为此，几个实验室已依靠半推理性方法(semi-rationalapproach)(Chica等，Curr.Opin.Biotechnol.，2005,16,378-384)来限制4处理的突变体文库的多样性，根据结构数据来选择一小部分相关氨基酸残基。这一部分M酸一般由HE/DNA复合体结构中4链p-片层中的M酸^l^组成，所述氨基酸残基与归巢位点中的核苷酸碱基直接接触或由水介导接触。这种半推理性方法用于局部改变Seligman等，Genetics,1997，147,1653-64;Seligman等，NucleicAcidsRes"2002，30，3870-3879;Sussman等,J.Mol.Biol"2004，342，31-41;Rosen等,NucleicAcidsRes.，2006,34，4791-4800;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355，443-458;国际PCT申请WO2006/097853和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes"Epub2006年11月27日)、I國&el(Doyon等，J.Am.Chem.Soc,2006，128,2477-2484)、PI-SceI(Gimble等，J.Mol.Biol"2003，334，993-1008)和(Ashworth等，Nature,2006,441,656-659)蛋白的特异性。通过将所述半推理性方法和高通量筛选(HTS;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355，443-458;国际PCT申请WO2006/097853和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes.，Epub2006年11月27日)结合，有可能获得识别多种靶标的大量局部改变I-Oel大范围核酸酶变体，并且有可能通过组合方法将它们组装以获得具有选定特异性的完全重新设计的突变体。然而，由于HEDNA结合界面非常紧密，而且负责几乎所有碱基特异性相互作用的两个不同PP发夹是单个折叠的一部分，所以该方法并不容易。因此，对邻近位置的若干氨基酸进行突变可能会破坏结合界面的结构，所述突变是与与其中若干位置已被突变的靶标结合所需的。为此，为了得到大量的序列，能够在LAGLIDAG核酸内切酶中鉴定可被改造而产生新底物特异性的其它区域是极其有价值的。此外，由于非常高剂量的归巢核酸内切酶有时可能是有害的(Gouble等，J.GeneMed.,2006，8，616-622)，因此改造出毒性较低的LAGLIDADG核酸内切酶是极其有价值的。本发明人已经解出了无DNA之I-Orl二聚体的结构；其与结合DNA之晶体结构(PDB编号lgz9;Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001,8，312-316)的比较显示，C端环和最后一个螺旋a6的构象不同，这提示其参与DNA结合。对该区域的位点特异性诱变研究表明，尽管C端螺旋对于DNA结合来i兌是无关紧要的，然而最后一个C端环不M于结合和切割而且对于靶标特异性来说是4艮重要的，所述C端环在LAGLIDADG家族的同二聚体蛋白质中高度保守(图2),并且与DNA磷酸骨架形成许多非特异性接触(Jurica等，Mol.Cell.,1998,2，469-76;Chevalier等，J.Mol.Biol"2003，329,253-269)。此外，与野生型I-OeI相比，所述C端环中的某些突变体具有显著更低的毒性。该区域使得改造出具有新底物特异性的新归巢核酸内切酶(从而提高可被大范围核酸酶靶向的DNA序列数)有了新的可能。因此，可通过将先前鉴定的突变(如上所述)(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;国际PCT申请WO2006/097853，WO2006/097854和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes.,Epub2006年11月27日)与最后一个C端环中的突变相组合，从而改造出切割目的基因中选定的基因组靶标的重新设计的大范围核酸酶。此外，该区域还允许改造出毒性较低的归巢核酸内切酶。可能的应用包括基因工程、基因组工程、基因治疗和抗病毒治疗。本发明涉及改造出具有新底物特异性之LAGLIDADG归巢核酸内切酶的方法，该方法包括至少以下的步骤(a)对亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶的最后一个C端环中的至少一个氨基酸残基(除I-Od的140位苏氨酸(T140)以夕卜)进行突变，以及(b)在来自步骤(a)的变体中选择具有与亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶不同的DNA靶标切割模式的变体。定义-在本文中，多肽序列中的氨基酸残基根据单字母代码命名，其中，例如，Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，D表示Asp或天冬氨酸残基。-疏水氨基酸是指亮氨酸(L)、翔氨酸(V)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。-核苷酸以如下方式命名使用单字母代码来命名核苷中的碱基a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸而言，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c,w代表a或t,m代表a或c，y代表t或c(嘧咬核普酸)，d代表g、a或t,v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，n代表g、a、t或c。-"大范围核酸酶"意指具有12~45pb的双链DNA靶标序列的核酸内切酶。-"亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶"意指野生型LAGLIDADG归巢核酸内切酶或其功能性变体。所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶可以是单体、在功能性核酸内切酶中包含相结合的两个LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域的二聚体(同二聚体或异二聚体)，所述功能性核酸内切酶能够切割22~24bp的双链DNA靶标。-"同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶"意指具有单个LAGLIDADG基序并切割回文DNA乾序列的野生型同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶，例如I-Oel或I-Msol或其功能性变体。-"LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体"或"变体"意指通过将LAGLIDADG归巢核酸内切酶序列中的至少一个氨基酸替换为不同的氨基酸而获得的蛋白质。-"功能性变体"意指能够切割DNA靶标的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体，所述DNA耙标优选为不被野生型LAGLIDADG归巢核酸内切酶所切割的新DNA靶标。例如，这些变体在其与DNA乾序列接触或者与所述DNA靶标直接或间接相互作用的位置上包含氨基酸变更。—"具有新特异性的归巢核酸内切酶变体"意指具有不同于亲本归巢核酸内切酶之靶标切割模式(切割谦)的变体。所述变体可以比亲本归巢核酸内切酶切割更少的靶标(限制型镨)或更多的靶标。优选地，所述变体能够切割至少一个不被亲本归巢核酸内切酶所切割的靶标。术语"新特异性"、"改变的特异性"、"新切割特异性"、"新底物特异性"是指所述变体对DNA乾序列中核苷酸的特异性，它们是等同的并且不加区别地j吏用。-"I-OgI"意指具有SWISSPROTP05725或pdb登录号lg9y之序列的野生型I-Oel。-"结构域"或"核心结构域"意指"LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域"，其为LAGLIDADG家族归巢核酸内切酶的特征性o^^2a2(33l34a3折叠，对应于约一百个氛基酸残基的序列。所述结构域包含折叠成反向平行P片层的4个P链(^、p2、p3、卩4)，所述P片层与DNA靶标的一半相互作用。该结构域能够与跟DNA靶标之另一半相互作用的另一LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域相结合，以形成能够切割所述DNA靶标的功能性核酸内切酶。例如，对于二聚体归巢核酸内切酶I-Od(163个M酸)的情形，LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域对应于6至94位残基。对于单体归巢核酸内切酶的情形，在该核酸内切酶序列中存在两个这样的结构域；例如在I-D附oI(194个氨基酸)中，第一结构域(7至99位残基)和第二结构域(104至194位残基败短的连接子(linker)(100至103位残基)所分隔。—"亚结构域"意指LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域中与归巢核酸内切酶DNA靶标半位点的独特部分发生相互作用的区域。两个不同的亚结构域独立地起作用，并且在一个亚结构域中的突变不改变另一亚结构域的结合和切割特性。因此，两个亚结构域各自结合归巢核酸内切酶DNA靶标半位点中的不同部分。—"(3-发夹"意指LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域的反向平行P片层中通过环或者转角相连的两个连续P链(p^2或者p3p4)。-"DNA耙标"、"DNA乾序列"、"耙序列"、"乾位点"、"乾标"、"位点"、"识别位点"、"识别序列"、"归巢识别位点"、"归巢位点"、"切割位点"意指被LAGLIDADG归巢核酸内切酶识别并切割的22~24bp双链回文、部分回文(假回文)或者非回文多核苷酸序列。这些术语均指所述核酸内切酶诱导双链断裂(切割)的独特的DNA位置，优选基因组位置。所述DNA靶标通过双链多核苷酸中一务涟的5，至3，序列来定义。例如，图8所示的被野生型I-Od切割的回文DNA乾序列定义为以下序列对DNA靶标的切割发生在+2和-2位(分别针对有义链和反义链)核普酸处。除非另有指明，发生I-Od大范围核酸酶变体切割DNA乾标的位置均对应于DNA靶标有义链中的切割位点。-"DNA乾标半位点"、"半切割位点"或"半位点"意指DNA靶标中与每个LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域结合的部分。-"嵌合DNA靶标"或"杂合DNA靶标"意指两种亲本大范围核酸酶乾序列彼此不同之半序列的融合物。此外，所述靼标的至少一个半序列中可包含与各自亚结构域结合的核香酸组合(组合DNA靶标)。-"载体"意指能够运送与其相连的另一核酸的核酸分子。—"突变"意指对核酸/氨基酸序列中一个或多个核苷酸/氨基酸进行的替换、缺失和/或添加。-"同源的"意指序列与另一序列之间具有足以使所述序列发生同源重组的同一性，更特别地具有至少95%同一性，优选地97%同一性以及更优选地99%。_"同一性"是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可通过比较每个序列中的位置来确定同一性，所述序列可为了比较的目的而进行比对。当所比M列中的位置由相同a占据时，则所述分子在该位置是一致的。核酸或Jl^酸序列之间的相似性或同一性程度是在核酸序列共有位置上一致或匹配的核苷酸数目的函数。可使用多种比对算法和/或程序来计算两个序列之间的同一性，包括作为GCG序列分析软件包(UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)之一部分提供的FASTA或BLAST,其可使用例如默认i殳置。-"个体，，包括哺乳动物以及其它脊推动物(例如，鸟类、鱼类和爬行类)。本文使用的术语"哺乳动物"是指任何哺乳喂养其幼仔的胎生(真兽亚纲(eutharian)或有胎盘哺乳动物)或者卵生(后兽亚纲(metatharian)或无胎盘哺乳动物)脊推动物，包括单孔目动物、有袋动物类和胎盘动物。哺乳动物物种的实例包括人类及其它灵长类(例如，猴子、黑猩猩)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)和反刍动物(例如，牛、猪、马)。-"遗传病"是指部分或完全、直接或间接地由于一个或几个基因中的异常所导致的任何疾病。所述异常可以是突变、插入或缺失。所述突变可以是点突变(punctualmutation)。所述异常可影响基因的编码序列或其调节序列。所述异常可影响基因组序列的结构或者所编码mRNA的结构或稳定性。所述遗传病可以是隐性的或显性的。这些遗传病可以是(但不限于)嚢性纤维化、亨廷顿舞蹈症、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊病、先天性肝卟啉症、肝代谢遗传病、莱-尼综合征、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范科尼贫血、视网膜色素变14性、毛细血管扩张性共济失调、布卢姆综合征、视网膜母细胞瘤、杜兴氏肌营养不良症以及f萨病。根据本发明，最后一个C端环的氨基酸对应于氨基酸序列SEQIDNO:2或SwissprotP05725中的137至143位。了解中最后一个C端环的位置后，使用公知的蛋白质结构分析软件(例如Pymol)，本领域技术人员可容易地推出另一同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶中的对应位置。例如，对于I-M5d来说，最后一个C端环对应于143至149位。根据所述方法的一个有利的实施方案，步骤(a)包括对最后一个C端环中的氨基酸残基进行突变，所述最后一个C端环与亲本LAGLIDADG核酸内切酶DNA切割位点(野生型LAGLIDAG核酸内切酶归巢位点)中的磷酸骨架接触。优选地，所述残基参与结合以及切割所述DNA切割位点。更优选地，所述残基位于138、139、142或143位，这是参考I-CVeI氨基酸序列(SEQIDNO:2;图2)的编码。可以在一个变体中对两个残基进行突变，只要每个突变位于选自以下的不同残基对中即可138和139位的残基对，142和143位的残基对。根据本发明的方法，所引入的突变改变了最后一个C端环中所述氨基酸与亲本LAGLIDADG核酸内切酶DNA切割位点之磷酸骨架的相互作用。根据所述方法的另一有利的实施方案，步骤(a)中的突变是将所述最后一个C端环中的至少一个氨基酸替换为不同的氨基酸。优选地，138位或139位的残基被替换为疏水氨基酸，以避免与DNA切割位点中的磷酸骨架形成氢键。例如，138位的残基被替换为丙氨酸，或者139位的残基被替换为甲硫氨酸。142位或143位的残基有利地被小氨基酸(例如甘氨酸)替换，以降低这些氨基酸残基的侧链大小。根据本发明的方法，步骤(a)中的突变被引入野生型LAGLIDADG归巢核酸内切酶或其功能性变体中。所述野生型LAGLIDADG归巢核酸内切酶有利地是同二聚体。野生型同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶的实例示于Lucas等,NucleicAcidsRes.,2001,29，960-969的表1中。所述野生型同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶可以有利地选自I-Oel、I-Owl、I-Af^I和I-QflI，优选I-OrI。所述功能性变体包含最后一个C端环以外的额外突变，其优选位于与DNA靶标半位点相互作用的氨基酸残基处。所述LAGLIDADG归巢核酸内切酶中的DNA相互作用残基是本领域公知的。所突变的残基可与DNA骨架或与核苷酸碱基直接相互作用或者通过水分子发生相互作用。优选地，所述突变改变了所述大范围核酸酶的切割特异性，并得到能够切割来自目的基因之DNA靶标的具有新特异性的大范围核酸酶。更优选地，所述突变是对第一功能性亚结构域(对应于I-Orl氨基酸序列的26至40位)中一个或多个氨基酸的替换(其改变了针对DNA靶标±8至10位之核苷酸的特异性)，和/或对第二功能性亚结构域(对应于I-Oel氨基酸序列的44至77位)的替换(其改变了针对DNA靶标±3至5位之核苷酸的特异性)，如先前所述(国际PCT申请WO2006/097784和WO2006/097853;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355,443-458;Smith等，NucleicAcidsRes.，2006)。所述替换有利地对应于I-Oel氨基酸序列的26、28、30、32、33、38和/或40、44、68、70、75和/或77位。为了切割DNA靶标(其中n-4是t或者n+4是a)，所述变体有利地在44位具有谷氨酰胺(Q);为了切割DNA靶标(其中n_4是a或者n+4是t)，所述变体在44位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺；为了切割DNA靶标(其中11_9是g或者11+9是c)，所述变体有利地在38位具有精氨酸(R)或赖氨酸(K)。才艮据所述方法的一个最优选实施方案，所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶是在I-Oel的26至40位和44至77位中含有突变并且切割回文DNA序列的I-Oel变体，其中所述DNA序列的一半中至少+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核普酸对应于目的基因DNA乾标的一半中+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核苷酸。根据本领域公知并以商品提供的标准诱变方法引入步骤(a)中的突变。如上所述，根据熟知的重叠PCR技术，可有利地通过扩增包含突变位点的重叠片段而产生所述突变。可根据标准方法来产生在最后一个c端环中含有氨基酸变更之变体的文库。步骤(a)可包括在与DNA靶序列接触或者与所述DNA靶标直接或间接相互作用的其它位置处引入额外的突变，如上所述。该步骤可通过以下来实现产生组合文库(如国际PCT申请WO2004/067736，Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355,443-458以及Smith等，NucleicAcidsRes.，Epub2006年11月27日中所述)，并最终才艮据>^知的重叠PCR技术，通过扩增包含每个突变的重叠片段而在将所述突变在分子内组合。另外，还可在整个变体或部分变体(特别是变体的C端一半，即I-Orf氨基酸序列SEQIDNO:2的80至163位)中引入随机突变，从而改善该变体针对目的基因DNA靶标的结合和/或切割特性。可同时或依次引入所述最后一个C端环中的突变以及(随机或定点的)额外的突变。此外，可在变体单体/结构域的NH2端和/和COOH端插入一个或多个残基。例如，在NH2端引入甲硫氨酸残基，在NH2端和/和COOH端引入标签(表位或多聚组氨酸序列)；所述标签可用于检测和/或纯化所述大范围核酸酶。步骤(b)中的选择和/或筛选可通过在体外或体内使用切割测定来进行，如国际PCT申请WO2004/067736中所述。根据所述方法的另一有利的实施方案，步骤(b)在体内在一定条件下进行，其中在所述条件下该变体在突变DNA乾序列中产生双链断裂，这通过所述DNA双链断裂的重组介导修复而导致正选择标记或报告基因的活化，或者负选择标记或才艮告基因的失活。例如，本发明变体的切割活性可在酵母或哺乳动物细胞中使用报告载体通过同向重复重组测定进行测量，如PCT申请WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes"2003,31，2952-2962;Chames等，NucleicAcidsRes"2005，33,e178以及Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458所述。所述报告载体包含报告基因的两个截短的无功能拷贝(同向重复)以及位于间插序列(interveningsequence)内部的嵌合DNA乾序列，将它们克隆至酵母或哺乳动物表达载体中。所述DNA乾序列衍生自亲本归巢核酸内切酶位点，其通过将至少一个核香酸替换为不同的核普酸来实现。优选地，测试一组回文或非回文DNA靶标，其代表在DNA切割位点中一个或多个位置上4种碱基(g、a、c、t)的不同组合(对于n个突变位置来说为411种回文靶标)。所述变体的表达产生能够切割所述DNA乾序列的功能性核酸内切酶。这样的切割诱导同向重复之间的同源重组，得到功能性报告基因，其表达可通过适当的测定进行监测。根据所述方法的另一有利的实施方案，步骤(b)包括选择和/或筛选来自步骤(a)的能够切割至少一个不被亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶所切割的DNA靶序列的变体，所述DNA乾序列源自亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶切割位点，其用将所述切割位点之一半中的至少一个核苷酸替换为不同的核苷酸而得到。根据本发明的方法，所述亲本DNA耙标可以是回文、非回文或假回文的。优选地，所述DNA靶序列源自具有序列SEQIDNO:1的I-Od回文位点。更优选地，所述DNA乾标在土1至2、±6至7、±8至10和/或±11至12位具有核苷酸突变，更加优选在±1至2、±6至7和/或±11至12位具有核苷酸突变。根据所述方法的另一有利的实施方案，其包括表达步骤(b)中所得一个变体的再一个步骤(c),以允许形成同二聚体。所述同二聚体能够切割回文或假回文的靶序列。根据所述方法的另一有利的实施方案，其包括再一个步骤(c，)，其中将步骤(b)中得到的一个变体与野生型LAGLIDADG归巢核酸内切酶或其功能型变体共表达，以允许形成异二聚体。通过共表达两种不同的LAGLIDADG核酸内切酶单体来组装功能性异二聚体已在先前有所描述Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355,443-458;国际PCT申请WO2006/097853，WO2006/097854和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes"Epub2006年11月27日。优选地，共表ii^L步骤(b)中得到的两种不同变体。所述异二聚体能够切割非回文的嵌合靶标。例如，可利用编码所述变体的一种或两种重组表达载体来修饰宿主细胞。然后，在允许所述变体表达的条件下培养所述细胞，随后从细胞培养18物中回收所形成的同二聚体/异二聚体。根据本发明的方法，可通过将步骤(b)中得到的一个变体与归巢核酸内切酶结构域/单体融合来构建单链嵌合大范围核酸酶。所述结构域/单体可来自野生型LAGLIDADG归巢核酸内切酶或其功能性变体。优选地，所述两个结构^/单体通过肽连接子来连接。更优选地，所述单链大范围核酸酶包含步骤(b)中得到的两种不同变体；所述单链大范围核酸酶能够切割非回文的嵌合乾标，所述嵌合乾标包含每种变体DNA耙标中不同的一半。构建源自归巢核酸内切酶的单链嵌合大范围核酸酶的方法是本领域熟知的(Epinat等，NucleicAcidsRes"2003，31,2952-62;Chevalier等，MolCell.,2002,10，895-卯5;Steuer等，Chembiochem.,2004，5，206-13;国际PCT申请WO03/078619和WO2004/031346)。可使用任意这些方法来构建源自本发明所述之变体的单链嵌合大范围核酸酶。本发明还涉及可通过上述方法得到的同二聚体或异二聚体的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体，除了SEQIDNO:3和4的同二聚体变体以及包含SEQIDNO:5单体的同二聚体或异二聚体变体以外；本发明的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体也称作"变体"、"大范围核酸酶变体"或"大范围核酸酶"。根据所述变体的一个有利的实施方案，它是包含如下单体的异二聚体，所述单体来自可通过上述方法得到的两种不同变体。根据所述变体的另一有利的实施方案，它是含有一个或两个突变的I-Oel变体，其中每个突变来自选自以下的不同突变对S138A和K139M对，K142G和T143G对。这样的变体的实例包括SEQIDNO:6至9。更优选地，所述I-Od变体是异二聚体，其包含两个单体，并且能够切割目的基因的基因组DNA靶标，其中每个单体还包含I-Oel的26至40位和44至77位的不同突变。本发明的主题还包括源自上述变体的单链嵌合大范围核酸酶；本发明的单链嵌合大范围核酸酶也称作"单链衍生物"、"单链大范围核酸酶"、"单链大范围核酸酶衍生物"或"大范围核酸酶"。本发明的大范围核酸酶包括大范围核酸酶变体和单链大范围核酸酶衍生物。本发明的主题还包括编码上述变体或单链衍生物的多核普酸片段；所述多核苷酸可编码同二聚体或异二聚体变体中的一个单体，或者单链衍生物中的两个结构域/单体。本发明的主题还包括用于表达本发明的变体或单链衍生物的重组栽体。所述重组载体包含至少一个编码所述变体或单链大范围核酸酶的多核苷酸片段。在一个优选的实施方案中，所述载体包含两个不同的多核苷酸片段，其中每个片段编码异源二聚变体的单体之一。本发明中可使用载体包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体或者线性或环状的DNA或RNA分子，其可由染色体的、非染色体的、半合成的或者合成的核酸组成。优选的载体是能够自我复制(附加型载体)和/或表达与其相连的核酸(表达载体)的那些。本领域技术人员已知大量合适的市售载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如船目关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(rhabdovirus)(例如狂犬病毒和疱渗性口腔炎病毒)、副粘病毒(例如麻渗病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒包括腺病毒、疱療病毒(例如1型和2型单纯疱务病毒、EB病毒、巨细胞病毒)，以及痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒)。其它病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽类造白细胞组织增生肉瘤病毒(avianleukosissarcoma)、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.，Retroviridae:Thevirusesandtheirreplication,InFundamentalVirology,第三版,B.N.Fields等编著,Lippincott國RavenPublishers,Philadelphia,1996)。优选的栽体包括慢病毒载体，特别是自失活的慢病毒载体。栽体可包M择标记，例如用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱療病毒胸苦激酶、腺普脱氨酶、谷氨酰胺合成酶以及次黄嘌呤-鸟噪呤转磷酸核糖基转移酶；用于酿酒酵母"^vi's/"e)的TRP1;用于大肠杆菌(￡.的四环素、利福平或氨节青霉素抗性。优选地，所述载体是表达载体，其中编码本发明所述变体/单链衍生物的序列置于适当的转录和翻译控制元件的控制下，从而允许产生或合成所述大范围核酸酶。因此，所述多核普酸包含在表达盒内。更具体地，所述载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸有效连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点(当使用基因组DNA时)、多腺苷酸化位点以及转录终止位点。它还可包含增强子。启动子的选择将取决于表达该多肽的细胞。优选地，当所述变体为异二聚体时，编码其中每个单体的两个多核苷酸被包含在一个载体中，该载体能够同时驱动两个多核苷酸表达。合适的启动子包括组织特异性和/或诱导型的启动子。诱导型启动子的实例包括由重金属水平提高诱导的真核金属疏蛋白启动子、应答于异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而被诱导的原核lacZ启动子以及由温度升高诱导的真核热休克启动子。组织特异性启动子的实例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特异性抗原(PSA)、a-抗胰蛋白S^白酶、A^面活性蛋白(SP)A和B、P-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。根据所述栽体的另一有利的实施方案，其包括靶向构建体，所述构建体包含与上述基因组DNA靶标切割位点附近区域具有同源性的序列。或者，编码所述大范围核酸酶的载体和包含所述耙向DNA构建体的载体为不同的载体。更优选地，所述靶向DNA构建体包含(a)与上述基因组DNA切割位点附近区域具有同源性的序列，和(b)待引入序列，其侧翼为a)中的序列。优选地，使用至少50bp、优选多于100bp以及更优选多于200bp的同源序列。事实上，共有的DNA同源序列位于断裂位点上游和下游侧翼的区域，待引入的DNA序列应位于所述两臂之间。所述待引入的序列优选为修复目的基因中的突变的序列(功能基因的基因修正或复原)，用于基因组治疗的目的。或者，它可以是用于以某种特定方式改变染色体DNA的任何其它序列，包括用于修饰特定基因的序列、用于弱化或激活内源目的基因的序列、用于失活或缺失内源性目的基因或其部分的序列、用于将突变引入目的位点的序列或者用于引入外源基因或其部分的序列。本发明还涉及经上述多核苷酸或载体(优选表达载体)^务饰的原核或真核宿主细胞。本发明还涉及非人转基因动物或转基因植物，其特征在于它们的所有细胞或部分细胞经上述多核香酸或载体修饰。本文使用的"细胞"是指原核细胞(例如细菌细胞)或真核细胞(例如动物、植物或酵母细胞)。本发明的主题还包括以下各项用于分子生物学、体内或体外基因工程以及体内或体外基因组工程的非治疗性目的的用途如上定义的大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、一种或两种衍生的多核苷酸(优选包含在表达载体中)、细胞、转基因植物、非人转基因哺乳动物。非治疗性目的包括例如(i)对包装细胞系中特定基因座的基因靶向，用于生产蛋白质，(ii)对农作物中特定基因座的基因靶向，用于品系改良和代谢工程，(iii)靶向重组，用于在经遗传修饰的农作物中除去标记，(iv)靶向重组，用于在经遗传修饰的微生物菌林(例如用于生产抗生素的菌林)中除去标记。根据所述用途的一个有利的实施方案，其用于在包含DNA耙序列的目的位点处诱导双链断裂，从而诱导DNA重组事件、DNA丢失或细胞死亡。根据本发明，所述双链断裂用于修复特定的序列、修饰特定的序列、在原位将突变基因恢复为功能基因、削弱或激活目的内源基因、将突变引入目的位点、引入外源基因或其部分、失活或检测内源基因或其部分、使染色体臂易位或者使DNA不被修复和降解。本发明的主题还包括遗传工程方法，其特征在于它包括以下步骤通过将包含如前所述之DNA靶标的载体与前述大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)接触而在所述载体上的目的位点处引起双链核酸断裂，从而诱导与另一栽体的同源重组，所述另一载体与所述大范围核酸酶的切割位点附近的序列具有同源性。本发明的主题还包括基因组工程方法，其特征在于它包括以下步骤1)通过将大范围核酸酶的至少一个DNA靶标与所述大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)接触使包含所述靶标的基因座发生双链断裂；2)在适于与靶向DNA构建体发生同源重组的条件下维持所述断裂的基因座，所述靶向DNA构建体包含待引入所述基因座的序列，所述序列的两侧是与乾基因座具有同源性的序列。本发明的主题还包括基因组工程方法，其特征在于它包括以下步骤1)使包含前述大范围核酸酶的至少一个DNA耙标的基因座发生双链断裂，这通过将所述切割位点与所述大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)接触来实现；2)在适于与染色体DNA发生同源重组的条件下维持所述断裂的基因座，所述染色体DNA与该切割位点附近的区域具有同源性。本发明的主题还包括前述至少一种大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、前述一种或两种衍生多核普酸(优选包含在表达载体中)用于制备药物的用途，所述药物用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗遗传病，所述药物旨在通过任意方式向所述个体施用。本发明的主题还包括用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗遗传病的方法，所述方法包括通过任意方式向所述个体施用含有上述至少一种大范围核酸酶的组合物的步骤。在这种情形中，上述大范围核酸酶的使用包括至少以下步骤(a)在个体的体细胞组织中诱导基因中目的位点处的双链切割，所述基因包含至少一个所述大范围核酸酶的识别和切割位点，以及(b)将靶向DNA引入该个体，其中所述靶向DNA包含(1)与所述切割位点周围的区域具有同源性的DNA，和(2)基于所述把向DNA与染色体DNA之间的重组来修复所述目的位点的DNA。所述耙向DNA在适于将靶向DNA引入目的位点的M下引入个体中。根据本发明，通过以下方式诱导所述双链切割通过向个体施用所述大范围核酸酶来整体(intoto)诱导；或者通过将所述大范围核酸酶引入体细胞来离体诱导，所述体细胞从个体中取出并在修饰后返回该个体中。在所述用途的一个优选实施方案中，所述大范围核酸酶与靶向DNA构建体组合，所述构建体包含修复基因中突变的序列，所述序列的两侧是与上述大范围核酸酶之基因组DNA切割位点周围的基因区域具有同源性的序列。所述修复突变的序列是具有正确序列的基因片段或外显子敲入构建体。就修正基因而言，基因切割发生在突变附近，优选地在突变的500bp范围内。靶向构建体包含在基因组DNA切割位点两侧具有至少200bp之同源序列的基因片段(最小修复基质)用于修复所述切割，并包含所述基因的正确序列用于修复突变。因此，用于基因修正的耙向构建体包含所述最小^修复基质，或由其组成；其优选为200pb至6000pb，更优选为1000pb至2000pb。就恢复功能性基因而言，基因切割发生在突变的上游。优选地，所述突变是该基因序列中已知的第一个突变，以使该基因中所有下游突变均可以同时被修正。所述靶向构建体包含基因组DNA切割位点下游的框内融合(像在cDNA中一样)的外显子，并且带有多腺苷酸化位点以在3，端终止转录。待引入序列(外显子敲入构建体)的两侧是所述切割位点周围的内含子或外显子，从而使经改造基因(外显子敲入基因)转录成能够编码功能性蛋白质的mRNA。例如，所述外显子敲入构建体的两侧是上游和下游序列。本发明的主题还包括如上所述的至少一种大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、上述一种或两种衍生多核苷酸(优选包含在表达载体中)用于制备药物的用途，所述药物用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗由带有DNA中间体(DNAintermediate)的传染原所引起的疾病，所述药物通过任意方式向所述个体施用。本发明的主题还包括用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗由带有DNA中间体的传染原所引起的疾病的方法，所述方法至少包括通过任意方式向所述个体施用上述组合物的步骤。本发明的主题还包括如上所述的至少一种大范围核酸酶、上述一种或两种多核苷酸(优选包含在表达载体中)用于在体外在生物来源的产品或者旨在用于生物用途的产品中抑制带有DNA中间体的传染原增殖、使其失活或清除它们的用途，或者用于对物品消毒的用途。本发明的主题还包括用于从产品或材料中去除带有DNA中间体的传染原的方法，所述方法至少包括将生物来源的产品或者旨在用于生物学用途的产品或者物品与上述组合物接触足以抑制所述传染原增殖、使其失活或消除的时间。在一个具体的实施方案中，所述传染原是病毒。例如，所述病毒是腺病毒(Adll、Ad21)、疱渗病毒(HSV、VZV、EBV、CMV、疱渗病毒6、7或8)、嗜肝DNA病毒(HBV)、乳多空病毒(HPV)、痘病毒或逆转录病毒(HTLV、HIV)。本发明的主题还包括组合物，其特征在于包含上述至少一种大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、一种或两种衍生多核苷酸(优选包含在表达载体中)。在所述组合物的一个优选实施方案中，其包含乾向DNA构建体，该构建体包含修复目的位点的序列，该序列两侧是与上述把基因座具有同源性的序列。优选地，所述靶向DNA构建体被包含在重组载体中，或者其被包含在含有编码所述大范围核酸酶之多核苷酸的表达载体中，如本发明中所述。本发明的主题还包括作为组合制剂用于同时、分别或依次用于预防或治疗遗传病的至少含有以下的产品上述大范围核酸酶(除SEQIDNO:5以外)或者一种或两种编码所述大范围核酸酶的表达载体，以及包含靶向构建体的载体。就治疗目的而言，以治疗有效量来施用所述大范围核酸酶和可药用赋形剂。如果所施用的量有生理意义的话，则这样的组合称为是以"治疗有效量"施用的。如果药剂的存在导致受者生理上发生可检测的变化，则该药剂是有生理意义的。在本文中，如果药剂的存在导致目标疾病的一种或多种症状的严重程度降低并导致该损伤或异常的基因组修正，则该药剂是有生理意义的。在本发明之用途的一个实施方案中，所述大范围核酸酶基本上是非免疫原性的，即不引起或几乎不引起有害的免疫应答。可以根据本发明使用多种改善或消除此种有害免疫应答的方法。在一个优选的实施方案中，所述大范围核酸酶几乎不含N-甲酰甲硫氨酸。另一避免不期望的免疫应答的方法是将大范围核酸酶与聚乙二醇("PEG")或聚丙二醇("PPG")(优选平均分子量(MW)500至20，000道尔顿)缀合。例如Davis等(US4,179,337)所述，与PEG或PPG缀合可提供具有抗病毒活性的非免疫原性的、具有生理活性的水溶性核酸内切酶缀合物。类似的方法还使用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物，其描述于Saifer等(US5,006,333)中。所述大范围核酸酶可作为多肽或作为编码所述多肽的多核苷酸构建体/载体来使用。通过本领域公知适用于特定细胞类型的任何方便的方法将其在体外、离体或在体内(单独地或与至少一种合适的栽体和/或与乾向DNA—起)引入细胞中。一旦进入细胞，所述大范围核酸酶以及(如果存在的话)含有乾向DNA和/或编码大范围核酸酶之核酸的载体被细胞从胞质输入或转移至核中的作用位点。所述大范围核酸酶(多肽)可有利地与脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和/或膜易位肽(membranetranslocatingpeptide)(Bonetta,TheScientist;2002，16,38;Ford等，GeneTher"2001，8，l隱4;Wadia和Dowdy，Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13，52-56)联合；在后一情形中，所述大范围核酸酶的序列与膜易位肽的序列融合(融合蛋白)。可通过多种方法(例如，注射、直接摄入、生物射弹轰击、脂质体、电穿孔)将包含靶向DNA和/或编码大范围核酸酶之核酸的载体引入细胞。可使用表达载体在细胞中稳定或瞬时表达大范围核酸酶。在真核细胞中的表达技术是本领域公知的(参见CurrentProtocolsinHumanGenetics:第12章"VectorsForGeneTherapy"&第13章"DeliverySystemsforGeneTherapy")。可选地，可优选将核定位信号整合进重组蛋白质中以确保其在核内表达。本发明的大范围核酸酶的用途以及使用所述大范围核酸酶的方法还包括上述使用编码所述大范围核酸酶的多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物。根据本发明的用途和方法的另一有利的实施方案，所述大范围核酸酶、多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物与上述耙向DNA构建体联合。优选地，所述编码大范围核酸酶单体的栽体包含如上所述的靼向DNA构建体。本发明还涉及用于改造出I-Od变体的第一种方法，所述变体能够切割来自目的基因的基因组DNA靶序列，该方法包括至少以下步骤(aj构建第一系列的变体，所述变体在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域(位于I-OeI的26至40位)中含有至少一个替换，(bj构建第二系列的变体，所述变体在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域(位于I-Od的44至77位)中含有至少一个替换，(d)从步骤(aj的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-Oel位点的变体，其中(i)I-OeI位点中-lO至-8位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中-10至-8位的核苷酸三联体，并且(ii)+8至+10位的核香酸三联体已替换为所述基因组靶标中-10至-8位所存在核苷酸三联体的反向互补序列，(dj从步骤(bj的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-Od位点的变体，其中(i)I-Orl位点中-5至-3位的核苷酸三联体已被替换为所述基因组靶标中-5至-3位所存在的核苷酸三联体，并且(ii)+3至+5位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中-5至-3位所存在核苷酸三联体的反向互补序列，(ei)从步骤(ai)的第一系列选择和/或筛选能够切割突变体位点的变体，其中(i)I-Oel位点中+8至+10位的核普酸三联体已被替换为所述基因组靶标中+8至+10位的核苷酸三联体，以及(ii)-10至-8位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中+8至+10位所存在核苷27酸三联体的反向互补序列，(&)从步骤(b)的第二系列选择和/或筛选能够切割突变体位点的变体，其中(i)I-Orl位点中+3至+5位的核苷酸三联体已被替换为所述基因组靶标中+3至+5位存在的核苷酸三联体，以及(ii)-5至-3位的核苷酸三联体已被替换为所述基因组靶标中存在的+3至+5位核苷酸三联体的反向互补序列，(gi)在一个变体中组合来自步骤(Cl)和步骤(dj的两种变体中26至40位和44至77位的突变，以得到切割如下序列的新的同二聚体I-CVeI变体，在所述序列中(i)-10至-8位的核苷酸三联体与所述基因组靶标-10至-8位存在的核苷酸三联体一致，(ii)+8至+10位的核普酸三联体与所述基因组靶标中-10至-8位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，(m)-5至-3位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中-5至-3位存在的核苷酸三联体一致，(iv)+3至+5位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中-5至-3位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，(hj在一个变体中组合来自步骤(ei)和步骤(fj的两种变体中26至40位和44至77位的突变，以得到切割如下序列的新的同二聚体变体，在所述序列中(i)+3至+5位的核香酸三联体与所述基因组靶标中+3至+5位存在的核苷酸三联体一致，(ii)-5至-3位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中+3至+5位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，(iii)中+8至+10位的核香酸三联体与所述基因组靶标中+8至+10位存在的核苷酸三联体一致，(iv)-10至-8位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中+8至+10位存在的核普酸三联体的反向互补序列一致，(ij在来自步骤(gl)和/或(h》的变体中在最后一个C端环中引入至少一个突变，优选为如前所述的中138、139、142或143位的替换。(jj将步骤(gj、(hj和/或(h)中得到的变体相组合，以形成异二聚体，以及(kj选择和/或筛选来自步驟(h)的能够切割所述位于目的基因中的基因组DNA靶标的异二聚体。或者，可通过用于改造出I-Orf变体的第二种方法来获得本发明的变体，所述变体能够切割来自目的基因的基因组DNA靶序列，该方法包括至少以下步骤(a2)构建第一系列的I-Oel变体，所述变体在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域(位于I-OeI的26至40位)中含有至少一个替换并在最后一个C端环中含有一个突变(如上所述，优选I-OeI中138、139、142或143位的替换)，(b2)构建第二系列的I-Oel变体，所述变体在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域(位于I-OeI的44至77位)中含有至少一个替换并在最后一个C端环中含有一个突变(如上所述，优选I-C^1之138、139、142或143位的替换)，其条件是所述两个系列的变体中至少一个系列在所述最后一个C端环中含有至少一个突变，(c2)从步骤(a2)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变的I-CVd位点的变体，在所述位点中(i)I-Orl位点中-10至-8位的核苷酸三联体被替换为所述基因组靶标中-10至-8位存在的核苷酸三联体，位点中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一处核苷酸二联体最终被替换为所述基因组靶标中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二联体，(ii)+8至+10位的核苷酸三联体替换为所述基因組靶标-10至-8位存在的核苷酸三联体的反向互补序列，+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中至少一处核苷酸二联体最终替换为所述基因组乾标中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位所存在核苷酸二联体的反向互补序列，(d2)从步骤(b2)的第二系列选择和/或筛选能够切割突变的位点的变体，其中(i)位点中-5至-3位的核苷酸三联体被替换为所述基因组靶标中-5至-3位存在的的核苷酸三联体，并且I-Orl位点的-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一处核苷酸二联体最终被替换为所述基因组靶标中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二联体，(ii)+3至+5位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标-5至-3位存在的核苷酸三联体的反向互补序列，并且+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中至少一处核苷酸二联体最终被替换为所述基因组靶标-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中存在的核苷酸二联体的反向互补序列，其条件是步骤(c)和(d)中两个突变I-OeI位点中的至少一个在-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的至少一个核苷酸二联体以及对应于位点中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的至少一个核苷酸二联体处含有突变，(e2)从步骤(a2)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变的I-Oel位点的变体，在所述位点中(i)I-Oel位点中+8至+10位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中+8至+10位存在的核苷酸三联体，并且I-Oel位点中+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位的至少一处核苷酸二联体最终被替换为所述基因组靶标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二联体，(ii)-10至-8位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中+8至+10存在的核苷酸三联体的反向互补序列，并且-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一处核普酸二联体最终被替换为所述基因组耙标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中存在的核苷酸二联体的反向互补序列，(f2)从步骤(b2)的第二系列选择和/或筛选能够切割突变的位点的变体，在所述位点中(i)I-Od位点中+3至+5位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中+3至+5位存在的核苷酸三联体，并且I-Oel位点中+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位中至少一处核普酸二联体最终被替换为所述基因组靶标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二联体，(ii)-5至-3位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标+3至+5位存在的核苷酸三联体的反向互补序列，并且-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一处核苷酸二联体最终被替换为所述基因组靶标+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中存在的核苷酸二联体的反向互补序列，其条件是步骤(e)和(f)中两个突变I-OeI位点中的至少一个在+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的至少一个核普酸双链体以及对应于I-Oel位点中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的至少一个核苷酸二联体处含有突变，(g2)在一个变体中组合来自步骤(c2)和步骤(d2)的两种变体中26至40和44至77位以及最后一个C端环中的突变，以得到切割如下序列的新的同二聚体I-Od变体，所述序列中(i)-10至-8位的核苷酸三联体与所述基因组靶标-10至-8位存在的核苷酸三联体一致，-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二联体与所述基因组耙标-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二联体一致，(ii)+8至+10位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中-10至-8位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二联体与所述基因组靶标中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二联体的反向互补序列一致，(iii)-5至-3位的核苷酸三联体与所述基因组耙标中-5至-3位存在的核苷酸三联体一致，(iv)+3至+5位的核苷酸三联体与所述基因组乾标中-5至-3位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，(h2)在一个变体中组合来自步骤(e2)和步骤(f2)的两种变体中26至40和44至77位以及最后一个C端环中的突变，以得到切割如下序列的新的同二聚体I-Od变体，所述序列中(i)+3至+5位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中+3至+5位存在的核苷酸三联体一致，+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二联体与所述基因组靶标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二联体一致(ii)-5至-3位的核苷酸三联体与所述基因组靶标+3至+5位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二联体与所述基因组靶标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二联体的反向互补序列一致，(iii)中+8至+10位的核苷酸三联体与所述基因组耙标+8至+10位存在的核苷酸三联体一致，(iv)-10至-8位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中+8至+10位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，(i2)将步骤(g2)和(h2)中得到的变体相组合，以形成异二聚体，以及(h)选择和/或筛选来自步骤U2)的能够切割所述位于目的基因中的基因组DNA靶标的异二聚体。根据另一替代方案，可通过用于改造出I-Od变体的第三种方法来获得本发明的变体，其中所述变体能够切割来自目的基因的基因组DNA靼序列，该方法包括至少以下步骤31(a3)构建第一系列的变体，所述变体在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域(位于I-Od的26至40位)中含有至少一个替换，(b3)构建第二系列的变体，所述变体在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域(位于I-OeI的44至77位)中含有至少一个替换，(c3)构建第三系列的变体，如上所述变体在所迷最后一个C端环中含有至少一个突变，优选在I-OeI的138、139、142或143位含有替换，(d3)从步骤(a3)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变位点的变体，所述位点中(i)I-Oel位点中-10至-8位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中-10至-8位的核苷酸三联体，并且(ii)+8至+10位的核普酸三联体已替换为所述基因组靶标中-10至-8位存在的核苷酸三联体的反向互补序列，(e3)从步骤(b3)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变位点的变体，所述位点中(i)位点中-5至-3位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中-5至-3位存在的核苷酸三联体，并且(ii)+3至+5位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中存在的-5至-3位核苷酸三联体的反向互补序列，(f3)从步骤(c3)的第三系列中选择和/或筛选能够切割突变位点的变体，所述位点中(i)位点中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二联体已分别替换为所述基因组靶标中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二联体，并且(ii)+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二联体已分别替换为所述基因组靶标中存在的-2至-1、-7至-6和/或-12至-11位核普酸二联体的反向互补序列，(g3)从步骤(a3)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变位点的变体，所述位点中(i)I-Od位点中+8至+10位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中+8至+10位的核苷酸三联体，并且(ii)画10至-8位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标+8至+10位存在的核32苷酸三联体的反向互补序列，(h3)从步骤(b3)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CVd位点的变体，所述位点中(0I-Od位点中+3至+5位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中+3至+5位存在的核苷酸三联体，并且(ii)-5至-3位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中存在的+3至+5位核苷酸三联体的反向互补序列，(i3)从步骤(c3)的第三系列中选择和/或筛选能够切割突变位点的变体，所述位点中(i)I-Orl位点中+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二联体已分别替换为所述基因组靶标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二联体，并且(ii)-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二联体已分别替换为所述基因组靶标中存在的+11至+12、+6至+7和/或+1至+2位核苷酸二联体的反向互补序列，(J3)在一个变体中组合来自步骤(d3)、(e3)和(f3)的三种变体中26至40、44至77位以及最后一个C端环中的突变，以得到切割如下序列的新同二聚体I-CVd变体，所述序列中(i)-10至-8位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中-10至-8位存在的核苷酸三联体一致，(ii)+8至+10位的核普酸三联体与所述基因组靶标中-10至-8位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，(m)-5至-3位的核苷酸三联体与所述基因组耙标中-5至-3位存在的核苷酸三联体一致，(iv)+3至+5位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中-5至-3位存在的核普酸三联体的反向互补序列一致，(v)-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二联体与所述基因组把标中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核香酸二联体一致，(vi)+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二联体分别与所述基因组靶标中-2至-1、-7至-6和/或-12至-11存在的核苷酸二联体的反向互补序列一致，(k3)在一个变体中组合来自步骤(g3)、(h3)和(i3)的三种变体中26至40和44至77位以及最后一个C端环中的突变，以得到切割如下序列的新型同二聚体I-OeI变体，所述序列中(i)+3至+5位的核苷酸三联体与所述基因组靶标中+3至+5位存在的核普酸三联体一致，(ii)-5至-3位的核苦酸三联体与所述基因组靶标中+3至+5位存在的核香酸三联体的反向互补序列一致，(iii)中+8至+10位的核苷酸三联体已替换为所述基因组靶标中+8至+10位存在的核苷酸三联体，(iv)-10至-8位的核普酸三联体与所述基因组靶标中+8至+10位存在的核苷酸三联体的反向互补序列一致，(v)+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二联体分别与所述基因组靶标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核香酸二联体一致，(vi)-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二联体分别与所述基因组靶标中+11至+12、+6至+7和/或+1至+2存在的核苷酸二联体的反向互补序列一致，(13)将步骤(J3)和(k3)中得到的变体相组合，以形成异二聚体，以及(mj选择和/或筛选来自步骤(13)的能够切割所述位于目的基因中的基因组DNA乾标的异二聚体。步骤(ai)、(a2)、(lh)、(b2)、(a3)、(b3)、(c3)、(gl)、(g2)、(hj、(h2)、(ij、(j3)和(k3)中可包括引入另外的突变从而改进突变体的结合和/或切割特性，尤其是在与DNA靶序列接触或者与所述DNA靶标直接或间接相互作用的其它位置。这些步骤可通过形成组合文库来实现，如国际PCT申请WOO2004/067736;Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355，443-458以及Smith等，NucleicAcidsResearch,Epub2006年ll月27日中所述。步骤(gj、(g2)、(hj、(h2)、U)、(j3)和(k3)还可包括在整个变体上或部分变体中引入随机突变，尤其是在变体的C端一半(80-163位)。这可通过根据本领域公知且市售的标准诱变方法形成基于大量变体的随机诱变文库来实现。步骤(h)还可包括选择和/或筛选能够切割如下序列的同二聚体，所述序列中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二联体分别与所述基因组乾标中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核普酸二联体一致，并且-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苦酸二联体分别与所述基因组耙标中存在的+11至+12、+6至+7和/或+1至+2位核普酸二联体的反向互补序列一致。可通过扩增含有两个亚结构域中各一个的重叠片段而对步骤(gj、(g2)、(lh)、(h2)、(j3)和(k3)中的突变进行(分子内)组合，其才艮据众所周知的重叠PCR技术来实现，如例如Smith等，NucleicAcidsRes.，Epub2006年11月27日中所述。通过将来自步骤(gl)、(g2)或(ij、(j3)的一种变体与来自步骤(lu)、(h2)或(h)、(k3)中的一种变体分别进行共表达而对步骤(h)、(12)和(13)中的变体进行(分子间)组合，从而形成异二聚体。例如，可利用编码所述变体的一种或两种重组表达栽体对宿主细胞进行修饰。然后，在允许表达所述变体的条件下培养所述细胞，从而在该宿主细胞中形成异二聚体，如先前在Arnould等，J.Mol.Biol.,2006，355，443-458;国际PCT申请WO2006/097853、WO2006/097854和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsResearch,Epub2006年11月27日中所述。可通过使用体外或体内的切割测定来实施选择和/或筛选步骤，如上所述。优选地在体内在以下条件下进行，在所述条件下，所述变体产生的突变DNA耙序列中的双链断裂通过对所述DNA双链断裂的重组介导寸务复，而激活阳性选择标记或报告基因，或者失活阴性选择标记或才艮告基因，如上文所定义。本发明的主题还包括如上所述的至少一种大范围核酸酶作为平台用于制备其它大范围核酸酶的用途。例如，可以制名^新型归巢核酸内切酶为目的对该变体进行另外多轮的诱变和选择/筛选。本发明的主题还包括降低亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶的毒性的方法，该方法包括对所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶的最后一个C端环中至少一个氨基酸进行突变。根据所述方法的一个有利的实施方案，所述亲本核酸内切酶是I-Od或其功能性变体。优选地，对K139和/或T143残基进行突变。更优选地，将K139突变成疏xl^i^酸例如甲硫氨酸(K139M)，和/或将T143突变成小氨基酸例如T143G(T143G)。本发明中所述的含有靶向DNA构建体之序列或编码大范围核酸酶变体或单链大范围核酸酶衍生物之序列的多核苷酸可通过本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，使用特异性引物通过聚合,式反应将35其从DNA模板扩增。优选地，将编码大范围核酸酶或单链大范围核酸酶衍生物之cDNA中的密码子选择成有利于在期望的表达系统中表达该蛋白质。可通过公知的重组DNA和遗传工程技术获得包含所述多核普酸的重组栽体并将其引入宿主细胞。通过表达如上所述的多肽来制备本发明中所述的大范围核酸酶变体或单链大范围核酸酶衍生物；优选地，所述多肽在宿主细胞或转基因动物/植物中在适于表达或共表达该多肽的条件下表达或共表达(仅在变体的情形中)，所述宿主细胞或转基因动物/植物经一种表达载体或两种表达载体(仅在变体的情形中)所修饰，然后从宿主细胞培养物或者从所述转基因动物/植物中回收大范围核酸酶或单链大范围核酸酶衍生物。除非另有指明，否则本发明的实施将应用本领域技术人员已知的常规的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术。这些技术在文献中均有详尽解释。参见，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(FrederickM.AUSUBEL,2000，WileyandsonInc,LibraryofCongress,USA);MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，(Sambrook等,2001,ColdSpringHarbor,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984);Mullis等，美国专利No.4,683,195;NucleicAcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins编著1984);TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984);CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney,AlanR.Liss，Inc"1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);theseries,MethodsInENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon,eds.-in-chief,AcademicPress,Inc.,NewYork),特别是第154和155巻(Wu等编著)以及第185巻,"GeneExpressionTechnology"(D.Goeddel编著)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Calos编著,1987,ColdSpringHarborLaboratory);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker编著,AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,第I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著,1986)以及ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1986)。除了前述的特征以外，本发明还包含从以下说明以及附图中得出的其它特征，所述说明参考展示本发明的I-Od大范围核酸酶变体及其用途的实施例，其中-图1表示I-Oel和I-O^I-DNA结构中的Ca条带的叠加图。为清M见，省略了DNA。-图2表示I-Oel家族成员(Lucas等，NucleicAcidsRes.，2001，29，960-969)的C端区域的序列比对。SKTRKTT基序中突变戎基的位置用灰色三角形标示(http:〃espript.ibcp.fr/ESPript/cgi画bin/ESPript.cgi)。-图3表示S138、K139、K142和T143与DNA骨架接触的详细视图(a)，以及结合与未结合DNA的结构中S138、K139、K142和T143之位置的比较(b)。—图4示意I-OdC端区域突变体的生物物理特征。a)圆二色性热变性。b)—维H-HNMR镨。-图5示意通过分析型超速离心测量的I-OdC端区域突变体的二聚体形成。在20。C和42,000rpm下I-Oel蛋白(1mg/ml,在PBS緩沖液中)的沉降速度分布。小图，在20。C和11,000rpm下I-Oel蛋白(4mg/ml，在PBS緩沖液中)的沉降平衡梯度。空心圓團代表实验数据，两条实线代表I-OeI单体(20,045)和二聚体(41,000)的理论梯度。-图6表示C端截短、双突变和单突变体在Mg"和Ca"存在下的电泳迁移率改变测定。-图7是c端截短、双突变和单突变体的:^体外切割测定的总结。-图8示意用于对单突变体进行模式分析的体内切割测定以及单突变体之IONNN一PDNA靶标切割模式。a)酵母筛选测定的原理。将包含编码单突变体^^达栽体的菌林与包含报告质粒的菌林^^。在所述报告质粒中，LacZ报告基因被含有一个目的乾位点的插入片段打断，所述插37入片段两侧是两个同向重复。M后，大范围核酸酶(灰色椭圆)在目的位点产生双链断裂，使得通过所述两个两侧同向重复之间的单链退火(single-strandannealing,SSA)而'恢复成有功能的LacZ基因。通过蓝染来显现该有功能的LacZ基因。b)DNA靶标。C1221靶标(顶部)是被I-Orl切割的回文靶标。^Mf究中使用的所有靶标均为通过替换士8、±9和±10位的6个核苷酸而从C1221衍生而来的回文乾标(SEQIDNO:l和10至16)。显示了几个实例(下部)。10GGG—P靶标与C1221把标的不同在于-10、-9、-8位的GGG三联体和+8、+9和+10位的CCC三联体。c)突变体靶标的模式。基于一系列64种回文把标(10NNN_P)，在酵母中对每种突变体进行模式分析。显示了单突变体(K139M)i之I-OelD75N在酵母中的切割活性的实例。蓝染指示切割。此外，显示了所有单突变体与D75N和I-Od相比的10NNN—P切割模式。^JL水平反映了信号的强度。I-Orl在酵母中具有毒性，分^f由37'C改为30'C下进行。所有其他突变体均在37匸下进行研究。-图9示意单突变体的5NNN一PDNA耙标切割模式。所述耙标(64)均为在±3至5位发生变化的回文把;示。-图10示意单突变体的2NNDNA乾标切割模式。所述耙标(16x16)均为在±1至2位发生变化的回文靶标。-图11示意单突变体的12NN—PDNA靶标(A)和7NN_PDNA耙标(B)切割模式。A(16)和B(16)中的靶标分别为在土11至12位和±6至7位发生变化的回文耙标。实施例1:结合与未结合DNA的之间的结构差异1)材料和方法a)蛋白质的表达、纯化和结晶如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中所述进行蛋白质表达和纯化。在96孑U1中利用蒸汽扩散法对结晶条件进行初步筛选，其中利用Hampton晶体筛选，使用含有1pl蛋白质溶液(7mg/ml，在20mMHEPES(pH7.5)中)和1pl沉淀溶液(其以50pl结晶液(reservoirsolution)在20。C进行平衡)的液滴。在若干条件(结晶筛38选1中的条件10、22、33、40、41以及结晶筛选2中的条件32)下获得结晶。通过使用VDX板的悬滴蒸汽扩散法来形成结晶；优化实验得出以下用于结晶的条件1nl蛋白质(7mg/ml，在20mMHEPES(pH7.5)中)和1jil沉淀溶液(含有20%PEG4000、0.1MHEPES(pH7.5)、10%异丙醇、10。/。乙二醇和0.01M乙酸镁，其以500fil沉淀緩冲液在20'C进行平衡)。使棒状结晶生长4-8天，并直接收集且冷冻在液氮中。b)数据收集、结构解析、模型构建和细化在低温下以100K使用同步辐射收集所有数据。封装(mount)结晶并进行防冻处理。采用ESRF(Grenoble)的ID14-4光束和SLS(Villigen)的PX光束，4吏用同步辐射收集数据组。利用ADSC-Q4或Mar225CCD检测器(取决于光束)记录衍射数据。使用HKL2000((MW"歸sA:/，Z和Af/wor，iVocessi"g</Jt"-niyD(^hi"iVwD她7VewIWA:)完成加工和定标。使用在MOLREP程序中实施的分子置换法(Vagin，A.和Teplyakov，A.ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr"2000,56Pt12，1622-1624)来解析结构。2)结果利用分子置换来解析的结构并细化到2.0A分辨率。使用A(p-1。和0.97A的波长收集最佳数据组(表I)。表I中汇总了晶体学数据的总结。检索模型是基于蛋白质数据库(ProteinDataBank)中PDBlgz9衍生而来的多丙氨酸骨架。在检索模型中去掉了DNA的坐标。经细化的2Fo-Fc图显示了蛋白骨架和许多侧链的清楚连续的电子密度。应用ARP/wARP和REFMAC5用于自动模型构建并细化到2.0A(表I)。表I:数据收集和细化统计<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>无DNA的二聚体使得可以在与蛋白质-DNA复合物(PDB代码lgz9)进行比较之后观察在DNA结合后的蛋白质构象改变(图1)。最显著的不同是C端区域的构象。在与DNA结合的结构中C-螺旋和C-环与DNA贴合在一起，而在未结合的结构中这两个元件均位于DNA所结合的腔的顶部，这提示该环和C-螺旋可能作为开闭DNA结合沟的锁钥来起作用。该区域在先前在不对称单元中仅含有一个单体的结构中并未观察到(Heath等，NatStructBiol，1997，4,468-476)。并且，I-Oel的C端结构域在LAGLIDADG家族的同二聚体蛋白质中非常保守(Lucas等，NucleicAcidsRes.,2001,29，960-969),这表明其在这一大范围核酸酶家族的工作机理中发挥重要作用(图2)。所述C端区域中蛋白质-DNA相互作用的详细视图显示，SKTRKTT基序中的Serl38、Lysl39、Lysl42和Thrl43参与与DNA骨架形成的氢键(图3a)。这些残基的位置与未结合DNA的状态完全不同(图3b),表明结合核酸需要构象变化。尽管这些相互作用在之前已有描述(Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329,253-269)并且所述氨基酸是保守的，但是有关它们在大范围核酸酶作用中之作用的信息尚不清楚。实施例2:生物物理分析1)材料和方法a)I-Oel突变体的构建利用PCR从野生型(I-O^ID75)cDNA模板上扩增I-Orf缺失突变体(A1和A2)，两种突变体的正向引物均为5，gatataccatggccaataccaaatataac3，(SEQIDNO:18)，△1突变体的反向引物为ICreldeltaCter-R:5，ttatcagtcggccgcatcgttcagagctgcaatotgatccacccagg3,(SEQIDNO:19)，△2突变体的反向引物为Creh2:5，gagtgcggccgcagtggttttacgcgtcttagaatog3，(SEQIDNO:20)。使用Quickchange⑧试剂盒(STRATAGENE#200518)、合适的谦变寡聚物和作为模板的野生型I-Oel(I-OrlD75)cDNA，采用"round-the-world，，PCR来扩增I-Oel单突变体和双突变体。b)圓二色热分析使用Jasco810型圆二色光镨仪获得数据，其先前用d-10-樟脑磺酸校准，并配有JascoPeltier热电温度控制计CDF-426S型。实验在PBS中以rC/分钟的间隔进行。蛋白质浓度为10nM。跟踪在2mmHellma110-QS光池中从5至95匸在222nm下椭圆+。c)分析型超速离心在20°C,在配有UV-可见光光学元件的OptimaXL-A(Beckman-Coulter)分析型超速离心机中进行沉降平衡实验，其使用An50Ti转子以及Epon木炭(Eponcharcoal)的3mm双扇形杯中心部件(doublesectorcenterpiece)。PBS緩冲液中的蛋白质浓度为200pM。以先后三种速度(11,000、13,000和15,000)进行短柱(23pi)l氐速沉降平衡，当先后的扫描发生重叠并在280nm波长处获得平衡扫描时，认为该系统处于平衡状态。在高速离心(5h，42，000rpm)之后测量基线信号。4吏用EQASSOC程序(Minton,A.P.,In:ModernAnalyticalUltracentrifugation,1994,BirkhauserBoston,Inc.,Cambridge,MA)得到蛋白质的全光池表观分子量。使用SEDNTERP程序(从RASMB服务器获得；Laue，T.M.S.,B.D.,Ridgeway,T.M.，Pelletier，S丄.,In:Computer-aidedinterpretationofanalyticalsedimentationdataforproteins,1992，RoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK)由^J^酸纟且成计算出I-Orl在20。C下的部分比容为0.7436ml/g。使用An50Ti转子和1.2mm双扇形杯中心部件，在20。C下以42,000rpm在XL-A分析型超速离心机(Beckman-CoulterInc.)中进行沉降速度实验。在280nm处检效，J吸光度。蛋白质在PBS中的浓度为50nM。利用以SEDFIT程序进行的连续分布c(s)Lamm平^^型(Schuck,P.,Biophys.J"2000,78,1606-1619)来计算沉降系数。使用SEDNTERP程序(Laue,T.M.S.，B.D.，Ridgeway,T.M.,Pelletier,S丄.，In:Computer-aidedinterpretationofanalyticalsedimentationdataforproteins,1992,RoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK)将这些实验性沉降值修正为标准条件，以得到相应的s20，w值。使用SEDFIT程序进行进一步的流体动力学分析(即计算摩擦系数比)以获得dec(M)分布(Schuck，P.,Biophys.J"2000，78，1606-1619)。d)醒R数据获取在25。C下，在配有超低温探头的BrukerAVANCE600分光光度计中记录NMR镨。蛋白质样品在PBS緩冲液(137mMNaCl,10mMNa2HP04-2H20，2.7mMKC152mMKH2P04,pH7.4)加5%2H20中为50042HM。使用DSS(2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠盐)作为质子化学位移的内参。2)结果为了揭示的C端结构域的作用，基于与DNA结合或未结合结构之间的差异设计了一系列截短、双突变体和单突变体。设计两种截短突变体用以阐明C端区域的作用。Al(氨基酸编号1-137)缺少C环和C螺旋，而I-OdA2(氨基酸编号1-144)则包含C环。基于SKTRKTT基序中与DNA骨架的接触，产生了双突变体AM(S138A,K139M)和I-OrIGG(K142G，T143G),以及它们的单突变体I-OelS138A、I-OelK139M、I國OdK142G、T143G。为了证明对大范围核酸酶活性的影响是由所述突变所致，研究了它们对蛋白质稳定性、结构和寡聚状态的影响。进行热变性圆二色性以证实所有突变体均发生了折叠。确实，所有突变体均显示出与野生型类似的S形曲线，Tm根据突变的不同而不同(图4a)。此外，一维H-HNMR证实了热变性实验，在酰胺区域中的明显的峰离M明所有突变体均发生了折叠(图4b)。众所周知，I-OeI家族大范围核酸酶作为同二聚体与DNA结合，因此为了分析突变体的寡聚化状态，对其进行分析型超速离心。实验显示，无论突变为何，所有突变体均以二聚体起作用，仅有与其分子量相应的极小变化(图5)。所有这些实验表明，所述突变体都发生了折叠，并且使I-OrI骨架仍参与大范围核酸酶活性。实施例3:C端突变体的DNA结合活性1)材料和方法条带迁移测定M条带迁移测定在室温孵育1h的10mMTris-HCl(pH8)、50mMNaCl、10mMCaCl2ilMgCl2、1mMDTT中进行，使用5^M(0.0793ng/pl)6誦FAM二体(duplex)(SEQIDNO:21;参见图6)和20^M(0.463吗/pl)蛋白质，并在15。/。丙烯酰胺-TBE凝胶中进行电泳。432)结果在Mg"和Ca"存在下使用电泳迁移率变动测定(EMSA)来分析DNA结合中C端突变体的表现(图6)。虽然Ca"的存在使DNA结合发生，但Mg2+对于结合和切割DNA是不可缺少的(Chevalier等，Biochemistry,2004,43，14015-14026)。△1突变体中I-Orl的结合能力净皮破坏，但A2突变体能够结合经标记的DNA探针，这表明C环对于DNA结合是必需的。此外，像在野生型中那样在上述两种阳离子存在下检测结合。另一方面，无论所述阳离子存在与否，AM和GG双突变体的DNA结合特性均受到严重影响，这表明Serl38、Lysl39、Lysl42和Thrl43与DNA骨架的接触对于与核酸的结合是关键性的。因此，SKTRKTT基序中的这些残基构成了对于结合DNA所必需的两个新的"热点"。为了明确C环中每个位点的不同特性，在相同条件下利用EMSA测定所述单突变体。与双突变体不同的是，所有单突变体均能够结合经标记的探针；然而，它们根据测定中存在的阳离子而表现出差异。可以观察到Serl38-Lys139位点明显依赖于Mg，而Lysl42-Thr143位点中的单突变体可结合DNA而与迁移测定中存在的阳离子无关。因此，破坏DNA结合需要同时突变每个位点中的两个残基，il^明每个热点中两个残基之间的协同作用对于DNA结合来说是必需的。实施例4:C端突变体在体外的DNA切割活性1)材料和方法体外切割测定M在37。C下在10mMTris誦HCl(pH8)、50mMNaCl、10mMMgCl2(或CaCl2)和1mMDTT中进行切割测定。浓度为100ng被X附wl线性化的把标底物(pGEM-TEasyC1221GTC)，40-0.25ng的I-Oel和螺旋突变体蛋白的稀释液，溶于最终体积25nl的反应中。所述线性化的靶标质粒为3kb，切割后产生两个较小的条带(2kb和1kb)。在1小时后通过加入5pi的45%甘油、95mMEDTA(pH8)、1.5%(重量/体积)SDS、1.5mg/ml蛋白酶K和0.048%(重量/体积)溴酚蓝(6x终止緩冲液)来终止反应，在37。C孵育30分钟并在1%琼脂糖凝胶中进行电泳。使用SYBRSafeDNA^J^染色(INVITROGEN)对片段进行定量。使用ImageJ软件(http:〃rsb.info.iiih.ROv/ij/)来分析凝胶，以根据(2kb+lkb)/(3kb+2kb+lkb)x100的公式计算切割百分比。2)结果在DNA结合测定中对不同突变体进行的分析明确暗示了DNA的切割活性，因此，对它们进行了对野生型DNA序列的切割活性实验。图7显示代^j"一定量HE的切割百分比的图(带有原始数据的皿可^^为支持信息)。可以基于与野生型HE切割活性的比较而将突变体分成两组；第一组由截短突变体I-OeIAl和I-OeI厶2以及双突变体I-OeIAM和I-OeIGG组成，而单突变体I-OeIS138A、K139M、T142G和I-OdT143G构成第二组。第一组中的成员显示了与野生型I-Oel相比降低的切割活性。厶l和I-OelGG的切割活性被完全破坏，而I-Od厶2和I-CVelAM显示出活性的降低，该活性在使用更高的HE量时被提高。然而，构成第二组的单突变体的切割活性不仅与野生型相似，还在某些情形中增强(图7)。这些结果表明，DNA活性被破坏或被严重影响的截短突变体和双突变体不切割DNA，或者它们需要更大的HE量来切割质粒。应注意，在I-OeIA2(保留了C环中的野生型氨基酸但缺少a6螺旋的突变体)的情形中，虽然其切割活性受到影响，但其活性模式与野生型的更为相似。另一方面，所有单突变体与野生型相比活性均略微增强。活性测定证实了DNA结合研究，表明双突变体以协同方式起作用，然而这些突变的效果不仅影响核酸结合，而且还影响DNA切割，如我们已显示的。实施例5:C端突变体在体内的DNA切割活性1)材料和方法体内切割测定(图8a)先前已描述于PCT申请WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003，31,2952-2962;Chames等,NucleicAcidsRes"2005，33，e178以及Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355,443-458中。a)靶标克隆的构建C122124bp乾序列(5，國tcaaaacgtcgtacgacgttttga—3，SEQIDNO:i)是天然I-Crel靶标(5,_tcaaaacgtcgtgagacagtttgg._3，SEQIDNO:17)半位点的回文序列。在酵母和哺乳动物细胞中，C1221与I-Crel的天然乾标在体外和离体情况下被同样有效地切割。使用Gateway方法(Invitrogen)，如前所述(Arnould等，J.MoLBiol"2006，355,443-458)将衍生自C1221的回文靶标克隆入报告载体(酵母pFL39-ADH-LACURAZ和哺乳动物细胞载体pcDNA3.1-LACURAZ-AURA,这两种载体先前均已描述过(Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003,31，2952-2962))中，并包含1-5^1靶位点作为对照。将酵母报告栽体转化进酿酒酵母(51.Omv/V^)菌林FYBL2國7B(M/4ra,ar3」S5J，"/7」63，/en2JJ,」202)中。b)在酵母中筛选筛选同二聚体突变体的方法先前已描述过(PCT申请WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes.,2003，31,2952-2962;Chamesetal.，NucleicAcidsRes"2005,33，el78;Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355，443-458)。c)在酵母中接合并筛选大范围核酸酶表达克隆使用菌落网格(QpixII，Genetix)进行接合。将突变体在覆盖在YPD培养板上的尼龙滤膜上划格，其中使用高网格密度(大约20个点/cm2)。在同样的滤膜上进行第二次划格过程，以对每种变体点样第二层，其是由64或75个不同的带有报告基因的酵母菌林组成的。将膜放在固体琼脂富含YPD培养基上，并在30。C孵育过夜，使之发生接合。然后，将滤膜转移至缺乏亮氨酸和色氨酸并以半乳糖(2%)作为碳源的合成培养基中，在37。C孵育5天(I-Od为30"C),以选择携带表达栽体和靶标栽体的二倍体。5天后，将滤膜放在固体琼脂糖培养基上，46该培养基含有在0.5M磷酸钠盐緩冲液(pH7.0)、0.1%SDS、6%二曱基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、7mM卩-巯基乙醇、1%琼脂糖中的0.02%X-Gal,并在37。C孵育，以监测P-半乳糖苷酶活性。通过使用合适的软件扫描并量化来分析结果。2)结果为了！Hi结果，对所有突变体以及I-OeI和I-OeID75N蛋白进行体内切割测定，如前所述(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355,443-458)。双突变体或截短突变体(其结合和切割能力在体外受突变的影响)对任何靶标均不表现活性。给出了AM和GG作为例子(图8c上图)。相比之下，所有单突变体均显示出对野生型靶标(C1221)的高活性。-10NNNP靶标模式分析(图8c)所有单突变体均显示出对野生型靶标(C1221)、IOAAG一P和10AAT_P的高活性。还可观察到这四个突变体针对10TCG_P和IOAAC一P的较低水平的切割。另夕卜，K139M突变体还能够切i〗另外7种耙3示(IOAGT一P、IOGAG一P、IOGAA一P、10GAT—P、10CAG—P、10CAA_P、10CAT—P)，如图8c中所示。K139M突i体的模式i非f相似(但k有其毒性)，而另外三个单突变体与I-CVeID75N更为接近。—5NNNP模式分析(图9)S138A和K139M的模式与D75N的模式相似，而K142G和T143G的模式比D75N的模式更受限制。—2NNP模式分析(图10)K142G和S138A的模式比I-OID75N的模式更受限制。与D75N相比，T143G和K139M分别切割另外6种和10种靶标，其中6种是共有的。另外，与D75N相比，至少8种靶标被K139M更为高效地切割。5种粑标(2TT_2TG、2TG—2TT、2TA—2CT、2TC_2TC、2CT2CT)不被K139M切割；这些靶标^D75N切割，尽管效率低于I-Oel。—12NNP模式分析(图11A)K142G和S138A的模式比I-OeID75N的模式更受限制，其中S138A的模式比K142G的模式更受限制。T143G的模式与I-OelD75N的模式类似。K139M的模式与的模式类似，但不具有其毒性；与D75N相比，K139M可切割另外7种耙标。-7NNP模式(图11B)K142G和S138A的模式与I-OrlD75N的模式类似。与D75N相比，K139M和T143G切割另外两种耙标(7CG—P和7TT—P);但是K139M和T143G的模式比的模式更受限制。这些结果表明，的C端区域对于HE活性是必需的。此外，SKTRKTT区域之两侧残基中的突变表明，它们不但控制核酸结合，而且还控制靶标特异性。权利要求1.改造出具有新底物特异性的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体的方法，其包括至少以下步骤(a)对亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶的最后一个C端环中的至少一个氨基酸残基进行突变，I-CreI的140位苏氨酸除外，以及(b)从步骤(a)中选择和/或筛选出变体，所述变体具有与所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶不同的DNA靶标切割模式。2.权利要求l的方法，其中所述突变位于所述最后一个C端环中与所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶DNA切割位点的磷酸骨架相接触的氨基酸残基位置上。3.权利要求2的方法，其中所述突变改变了最后一个C端环中所述氨基酸残基与亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶DNA切割位点中磷酸骨架之间的相互作用。4.权利要求2或权利要求3的方法，其中参照I-Od氨基酸序列编号，所述突变位于138、139、142和/或143位。5.权利要求4的方法，其中138位和/或139位的残基替换为疏水氨基酸，和/或，142位和/或143位的残基替换为小氨基酸。6.权利要求5的方法，其中138位的残基替换为丙氨酸，139位的残基替换为甲硫氨酸，和/或142位和/或143位的残基替换为甘氨酸。7.权利要求4至6中任一项的方法，其中步骤(a)包括对两个残基进行突变，其中每一个残基各来自于选自138和139位残基以及142和143位残基的不同残基对。8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶是同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶。9.权利要求8的方法，其中所述同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶是I國OeI。10.权利要求8的方法，其中所述同二聚体LAGLIDADG归巢核酸内切酶是在I-CVd的26至40位和44至77位中含有突变并且切割回文DNA序列的变体，其中所述DNA序列的一半中至少+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核苷酸对应于目的基因的基因组DNA耙标的一半中+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核苷酸。11.权利要求I至IO中任一项的方法，其中步骤(a)包括同时或先后对第一功能性亚结构域中至少一个氨基酸残基进行突变和/或对第二功能性亚结构域中至少一个氨基酸残基进行突变，所述第一功能性亚结构域对应于位于I-Orf氨基酸序列中26至40位的亚结构域，该亚结构域中的突变改变了对DNA靶标中士8至10位核苷酸的特异性，所述第二功能性亚结构域对应于位于I-Oel氨基酸序列中44至77位的亚结构域，该亚结构域中的突变改变了对DNA靶标中土3至5位核苷酸的特异性。12.权利要求l至ll中任一项的方法，其中步骤(a)包括同时或先后对所述LAGLIDADG归巢核酸内切酶/变体氨基酸序列的全部或C端一半进行随机突变。13.权利要求1至12中任一项的方法，其中步骤(b)包括从步骤(a)中选择和/或筛选出变体，所述变体能够切割至少一个不被所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶所切割的DNA把序列，所述DNA耙序列来自于亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶切割位点，这通过将所述切割位点的一半中的至少一个核苷酸替换为不同核苷酸来实现。14.权利要求13的方法，其中所述DNA靶序列来自于具有序列SEQIDNO:1的回文位点。15.权利要求14的方法，其中所述DNA把标在土1至2、±6至7、士8至10和/或±11至12位的核苷酸中含有突变。16.权利要求11至15中任一项的方法，其中所述DNA靶序列是目的基因中存在的基因组序列。17.可通过权利要求1至16中任一项的方法获得的同二聚体或异二聚体的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体，SEQIDNO:3和4的同二聚体变体以及包含SEQIDNO:5单体的同二聚体和异二聚体变体除外。18.权利要求17的变体，所述变体是这样的异二聚体，其包含可通过所述方法获得的两种不同变体中的单体。19.权利要求17或权利要求18的变体，所述变体是含有一个或两个突变的I-OeI变体，其中每个突变各来自于选自S138A和K139M对以及K142G和T143G对的不同突变对。20.权利要求19的变体，所述变体具有SEQIDNO:6至9的序列。21.权利要求19或权利要求20的变体，所述变体是由两个单体组成的异二聚体变体，其中每个单体还包含的26至40位和44至77位中的不同突变，所述变体能够切割目的基因中的基因组DNA把标。22.单链嵌合大范围核酸酶，其包含权利要求17至21中任一项所述一种或两种变体的两个单体或核心结构域，或二者的组合。23.多核苷酸片段，其编码权利要求17至21中任一项所述变体的一个单体或者权利要求22的单链大范围核酸酶。24.重组栽体，其包含至少一个权利要求23所述多核苷酸片段。25.表达载体，其包含两个多核苷酸片段，其中每个多核瞽酸片段各编码权利要求17至21中任一项所述异二聚体变体的两个单体之一，所述片段与调节序列有效连接，以允许产生所述两种单体。26.表达载体，其包含编码权利要求22所述单链大范围核酸酶的多核苷酸片段，所述片段与调节序列有效连接，以允许产生所述单链大范围核酸酶。27.权利要求25或权利要求26的载体，其包含耙向DNA构建体，所述构建体包含与权利要求10、16和21中任一项所定义的基因组DNA乾序列周围的区域具有同源性的序列。28.权利要求27的载体，其中所述靶向DNA构建体包含(a)与权利要求10、16和21中任一项所定义之基因组DNA耙序列周围的区域具有同源性的序列，和(b)待引入序列，该待引A^列的侧翼为a)的序列。29.宿主细胞，其包含如权利要求23或权利要求25中所定义的一种或两种多核苷酸片段或者权利要求24至28中任一项的栽体。30.非人转基因动物，其包含如权利要求23或权利要求25中所定义的一种或两种多核苷酸片段。31.转基因植物，其包含如权利要求23或权利要求25中所定义的一种或两种多核苷酸片段。32.药物组合物，其至少包含权利要求17至21中任一项的变体、权利要求22的单链大范围核酸酶、如权利要求23或权利要求25所定义的一种或两种多核苷酸片段、权利要求25至28中任一项的栽体。33.权利要求32的组合物，其还包含乾向DNA构建体，所述构建体包^4务复目的基因组位点的序列，该序列的侧翼是与耙基因座具有同源性的序列。34.权利要求17至21中任一项的变体、权利要求22的单链大范围核酸酶、如权利要求23或权利要求25所定义的一种或两种多核香酸片段、权利要求25至28中任一项的载体、权利要求29的宿主细胞、权利要求31的转基因植物、权利要求30的非人转基因哺乳动物中的至少之一用于分子生物学、体内或体外基因工程以及体内或体外基因组工程的非治疗性目的的用途。35.权利要求17至21中任一项的变体、权利要求22的单链大范围核酸酶、如权利要求23或权利要求25所定义的一种或两种多核苦酸片段、权利要求25至28中任一项的栽体中的至少之一用于制备药物的用途，所述药物用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗遗传病，所述药物旨在通过任意方式向所述个体施用。36.权利要求17至21中任一项的变体、权利要求22的单链大范围核酸酶、如权利要求23或权利要求25所定义的一种或两种多核普酸片段、权利要求25至28中任一项的栽体中的至少之一用于制备药物的用途，所述药物用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗由带有DNA中间体的传染原引起的疾病，所述药物旨在通过任意方式向所述个体施用。37.权利要求17至21中任一项的变体、权利要求22的单链大范围核酸酶、如权利要求23或权利要求25所定义的一种或两种多核苷酸片段、权利要求25至28中任一项的载体中的至少之一在体外用于在生物来源产品或者旨在用于生物用途的产品中抑制带有DNA中间体之传染原的增殖、使其失活或清除的用途，或者用于对物体进行消毒的用途。38.权利要求36或权利要求37的用途，其中所述传染原是病毒。39.权利要求34至37中任一项的用途，其中所述变体、单链大范围核酸酶、多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物与权利要求27、28或33中所定义的靶向DNA构建体相关联。40.权利要求17至21中任一项的变体、权利要求22的单链大范围核酸酶、如权利要求23或权利要求25所定义的一种或两种多核苷酸片段、权利要求24至28中任一项的载体中的至少之一作为平台用于^Ut出其它大范围核酸酶的用途。41.降低亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶的毒性的方法，其包括对所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶的最后一个C端环中的至少一个M酸进行突变，正如权利要求1-7中任一项所定义。42.权利要求41的方法，其中所述亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶如权利要求8至10中任一项所定义。43.权利要求42的方法，其中所述突变是K139和/或T143G。全文摘要具有新的底物特异性的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体，所述变体可通过包括以下步骤的方法来获得(a)对亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶最后一个C端环中的至少一个氨基酸残基(除I-CreI的140位苏氨酸以外)进行突变；(b)在来自步骤(a)的变体中选择和/或筛选具有与亲本LAGLIDADG归巢核酸内切酶不同的DNA靶标切割模式的变体。文档编号C12N9/22GK101679959SQ200780051453公开日2010年3月24日申请日期2007年2月19日优先权日2007年2月19日发明者吉列尔莫·蒙托亚,弗朗切斯科·布兰科,赫苏斯·普列托申请人:赛莱克蒂斯公司