由代谢工程化酵母进行的丁醇生产的制作方法

专利名称：：由代谢工程化酵母进行的丁醇生产的制作方法200780051627.8说明书声明如下，我们(下文列出了姓名、住址、和国籍)发明了以下说明书中描述的、题为"由代谢工程化酵母进行的丁醇生产"的发明。UviniGimawardena住址帕萨迪纳，力口利福尼亚国籍斯里兰卡PeterMeinhold住址帕萨迪纳，力口利福尼亚国籍德国MatthewW.Peters住址帕萨迪纳，加利福尼亚国籍美国JfunUrano住址卡尔弗城，加利福尼亚国籍美国ReidM.RennyFeldman<主址洛杉A几，加利福尼亚国籍美国本申请要求(l)JunUrano等人于2006年12月21日提交的美国临时专利申请流水号60/871，427,"由代谢工程化酵母进行的丁醇生产"(BUTANOLPRODUCTIONBYMETABOLICALLYENGINEEREDYEAST);(2)JimUrano等人于2007年2月2日提交的美国临时专利申请流水号60/888，016,"由代谢工程化酵母进行的正丁醇生产"(N-BUTANOLPRODUCTIONBYMETABOLICALLYENGINEEREDYEAST);和(3)UviniP.Gunawardena等人于2007年5月8日提交的美国临时专利申请流水号60/928,283，"由代谢工程化酵母进行的丁醇生产，，(BUTANOLPRODUCTIONBYMETABOLICALLYENGINEEREDYEAST)的权益。在此通过述及将上述每一篇申请收入本文。发明领域本发明涉及代谢工程改造的酵母细胞，用于以高产率生产正丁醇，作为替代的且可再生的运输燃料，及用于其它应用。本发明的酵母被工程化改造成包含将诸如葡萄糖和/或其它可代谢碳水化合物的碳源以及生物质等等转化成正丁醇的代谢途径。发明背景当前，美国每年消费大约1400亿加仑汽油，而全世界每年消费大约3400亿加仑汽油。这些消费数量还在增加中。2005年能源政策法案(EnergyPolicyActof2005)规定了到2012年要在汽油中使用75亿加仑可再生燃料。在他的2007年国情咨文(2007StateoftheUnionaddress)中，总统要求提高可再生燃料标准(renewableflielstandard)(RFS)的大小和扩大可再生燃料标准的范围，要求在2017年使用350亿加仑可再生的替代燃料。能源部已经设定了到20！30年用生物燃料替换美国当前汽油消耗的30%的目标(即"30X30"提案)。在2007年5月，巴西和美国签署了"乙醇协议，，(theEthanolAgreement),以促进美洲生物燃料的开发，联合世界最大生物燃料生产商-当前占世界乙醇生产的70%。生物燃料不仅具有降低美国对外国石油输入的依赖性(这对于国土安全是至关重要的)的潜力，而且具有显著降低与全球变暖有关的温室气体排放的潜力。自基于碳的原料的转化能获得生物燃料。农业原料被认为是可再生的，原因在于，虽然它们在燃烧时释放二氧化碳，但是它们通过光合作用捕获几乎相等量的二氧化碳。在美国，乙醇日益用作标准汽油的氧化添加剂，作为曱基叔丁基醚(MTBE)的替代品，后一种化学品难以自地下水和土壤污染中收回。在10%混合物，通过提高辛烷值，乙醇降低发动机爆震(engineknock)的可能性。10%乙醇汽油的使用在有些城市是强制性的，在这些城市中有害水平的汽车排气的可能性是有可能的，尤其是在冬季的几个月里。北美车辆自大约1980年起无需改装就能以10%乙醇/90。/o汽油(即E10)运行。9然而，为了以更高浓度使用乙醇，必须专门地工程化改造或改装车辆的发动机和燃料系统。设计了可变燃料车辆(flexibleflielvehicle)(FFV)，以汽油或者以高至85。/。乙醇(E85)的混合物运行。然而，因为一加仑乙醇含有的能量比一加仑汽油少，所以FFV在以E85作为燃料时通常每加仑荻得的里程少大于20-30%。可获得转化包，用于将常规车辆转化成FFV，其通常包括电子装置以提高每个循环所注入的燃料体积(因为乙醇的能含量较低)和有些情况中的化学处理以保护发动机免于腐蚀。当前美国有超过400万辆可变燃料车辆在路上行驶，虽然2002年的研究发现这些车辆所消费的燃料中E85少于1%。丁醇作为燃料具有数项胜过乙醇的优点。虽然它能自与乙醇相同的原料来制备，但是与乙醇不同，它与汽油和柴油在任意比例相容。丁醇还能在现有汽车中无需改装用作纯燃料，而且Virgin航空公司的RichardBranson爵士小组已经提出将丁醇用作喷气发动机燃料。与乙醇不同，丁醇不吸收水，而且如此能在现有的石化基础设施中储存和配给。由于其较高的能含量，燃料经济(每加仑里程)好于乙醇。还有，丁醇-汽油混合物具有比乙醇-汽油混合物低的蒸气压，这在降低蒸气碳氢化合物排放中是重要的。这些特性为丁醇提供了以与汽油完全相同的方式使用的潜力，而无需改装车辆且消费者没有不得不更频繁补充燃料的负担。使用经由自丁酰-CoA通向正丁醇的途径而天然生成正丁醇的梭菌属(C/o欣^/m)菌抹，能生成正丁醇。梭菌属菌抹的一项缺点在于正丁醇生成以两个步骤的过程发生，其牵涉酸生成生长期和之后的溶剂生成期。还有，在这种过程中生成大量的副产物，诸如氢、乙醇、和丙酮，如此将正丁醇的化学计量产率限制为大约0.6mol正丁醇每mol消耗的葡萄糖。另外，梭菌属菌抹丧失了它们在连续培养条件下生成溶剂的能力(Comillot等，/5acten'o/.179:5442-5447，1997)。图l中显示了梭菌途径，显示了丙酮丁醇梭菌(C/ayW^maceto^O^cwm)中葡萄糖转化成酸和溶剂，包括自乙酰-CoA生成正丁醇的途径。发明概述在一个实施方案中，提供了如下代谢工程化酵母，其能够代谢碳源以生成正丁醇，至少一种途径配置成生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量，且至少一种异源基因编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶。在另一个实施方案中，提供了生产正丁醇的方法，该方法包括(a)提供如下代谢工程化酵母，其能够代谢碳源以生成正丁醇，至少一种途径配置成生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量，且至少一种异源基因编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶；并(b)培养该代谢工程化酵母，培养的时间和条件用以生成正丁醇。在又一个实施方案中，提供了使用酵母生产正丁醇的方法，该方法包括(a)代谢工程改造酵母以提高胞质乙酰-CoA生成；(b)代谢工程改造酵母以表达将碳源转化成正丁醇的代谢途径，其中该途径需要至少一种对于该酵母而言非天然的酶，其中步骤(a)和(b)可以以任一次序实施；并(c)培养该酵母，培养的时间和条件用以生成可回收量的正丁醇。在还有一个实施方案中，提供了使用酵母生产正丁醇的方法，该方法包括(a)培养代谢工程化酵母，培养的时间和条件用以生成酵母细胞生物质但不激活正丁醇生成；并(b)在另一段时间改变培养条件，培养的时间和条件用以生成可回收量的正丁醇。在另一个实施方案中，提供了如下代谢工程化酵母，其能够代谢碳源并生成相对于野生型酵母所生成的乙酰-CoA量增加的乙酰-CoA量。在又一个实施方案中，提供了提高酵母的代谢活性的方法，该方法包括酵母生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量。在还有一个实施方案中，提供了如下代谢工程化酵母，其具有至少一种途径配置成生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量。还公开了其它实施方案。附图简述附图中图示了本发明的例示性实施方案，其中图l图示了丙酮丁醇梭菌中葡萄糖、戊糖、和淀粉粒(granulose)转化成酸和溶剂中所牵涉的代谢途径。己糖(例如葡萄糖)和戊糖被转化成丙酮酸、ATP和NADH。随后，丙酮酸被丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶氧化性脱羧成乙酰-CoA。在此步骤中所生成的还原当量被只含铁的氢化酶(iron-onlyhydrogenase)转化成氢。乙酰-CoA是分支点中间产物，通向有机酸(乙酸和丁酸)和溶剂(丙酮、丁醇和乙醇)的生成。图2图示了在酵母中生成丁醇的化学途径。图3图示了酿酒酵母(Sacc/zraw;/(^scerew's/ae)生成乙酰-CoA所使用的途径。图4和5图示了可用于依照本^^开内容表达各种酶的各种例示性质粒。图4图示了可用于如表l中所描述的依照本公开内容表达各种酶的示例性质粒。图5图示了可用于如表2中所描述的依照本公开内容表达各种酶的示例性质粒。图6图示了Gevo1099和Gevo1103随时间的正丁醇生成，与只含载体的对照隔离群、Gevo1110和Gevo111l相比较，如下(,)Gevo1099;(』—)Gevo1103;(')Gevo1110;和(翌)Gevo1111。图7图示了含有来自丙酮丁醇梭菌的k^/、W/Zk和"/a基因的pGV1090质粒，所述基因插入在五coRl和S"wHI位点处和改良的噬菌体XLacO-l启动子(Pl-^)的下游。该质粒还携带pBR322的复制起点基因和氯霉素抗性基因。图8图示了用于表达来自丙酮丁醇梭菌的丁醛脱氢酶(Z^/7B)的pGV1095质粒，该丁醛脱氢酶插入在EcoRI和BawHI位点处和改良噬菌粒XLacO-1启动子(PL-bc)的下游。该质粒还携带CoIEI复制起点基因和氯霉素抗性基因。图9图示了用于表达来自丙酮丁醇梭菌的巴豆酸酶(cW)的pGVl094质粒，该巴豆酸酶插入在五coRI和5"wHI位点处和改良噬菌体iLacO-1启动子(PWac)的下游。该质粒还携带ori基因和氯霉素抗性基因。图10图示了用于表达来自丙酮丁醇梭菌的羟丁酰-CoA脱氢酶(MJ)的pGV1037质粒，该羟丁酰-CoA脱氢酶插入在EcoRI和5amHI位点处和改良噬菌体XLacO-l启动子(Pi^c)的下游。该质粒还携带ori基因和氯霉素抗性基因。图11图示了用于表达来自丙酮丁醇梭菌的硫解酶(A/)的pGVl03l质粒，该硫解酶插入在五coRI和SawHI位点处和LacZ基因的下游。该质粒还携带pBR322的复制起点基因和氨千青霉素抗性基因。图12图示了用于表达来自拜氏梭菌(C7o^WwwZ^i/m'"cM)的巴豆酸酶(cW)的pGV1049质粒，该巴豆酸酶插入在五coRI和SawHI位点处和改良噬菌体XLacO-1启动子(PWac)的下游。该质粒还携带ori基因和氯霉素抗性基因。图13图示了用于表达来自拜氏梭菌的羟丁酰-CoA脱氢酶(/^力的pGV1050质粒，该羟丁酰-CoA脱氢酶插入在五coRI和^w7HI位点处和改良噬菌体XLacO-1启动子(PWac)的下游。该质粒还携带ori基因和氯霉素抗性基因。图14图示了用于表达来自拜氏梭菌的醇脱氢酶O^")的pGV1091质粒，该醇脱氢酶插入在///w^in和SamHI位点处和改良噬菌体iLacO-1启动子(PL.huO的下游。该质粒还携带氯霉素抗性基因。图15图示了用于表达来自拜氏梭菌的醇脱氢酶(aW/0的pGV1096质粒，该醇脱氢酶插入在五coRI和BamHI位点处和改良噬菌体XLacO-l启动子(Pwac)的下游。该质粒还携带ori基因和氯霉素抗性基因。发明详述描述了被工程化改造成以高产率将碳源转化成正丁醇的重組酵母微生物。具体而言，描述了能够代谢碳源以理论值的至少5。/。的产率和有些情况中超过理论值的50%的产率生成正丁醇的重组酵母微生物。如本文中所使用的，术语"产率，，指摩尔产率。例如，当l摩尔葡萄糖被转化成l摩尔正丁醇时，产率等于100%。具体而言，术语"产率"定义为每摩尔碳源单体获得的产物摩尔数，而且可表述为百分比。除非另有说明，产率表述为理论产率的百分比。"理论产率"定义为根据用于生成产物的代谢途径的化学计量的规定，每摩尔指定底物能生成的产物最大摩尔数。例如，葡萄糖变成正丁醇的一种典型转化的理论产率为100%。因此，葡萄糖变成正丁醇的产率为95%会表述为理论产率的95%或95%理论产率。用异源表达的酶来以高产率生成正丁醇的微生物。丁醇产率取决于碳源变成乙酰-CoA的高产率转化和后续的乙酰-CoA变成丁醇的高产率转化。本发明涉及这两个方面的组合，导致以高产率生成正丁醇的微生物。如本文中所使用的，术语"微生物"包括原核的和真核的微生物物种，13其来自细菌和真核生物范畴(Domains5acten'aand￡Wao;ofe)，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类、或高等原生生物。术语"细胞"和"微生物细胞"可以与术语"微生物"互换使用。在一个优选的实施方案中，微生物是酵母(例如啤酒糖酵母/酿酒酵母(^cc/2aram少c^ce"Ws/ae)或乳酸克鲁维酵母(幻^yveram少ce/acto))或大肠埃希氏菌/大肠杆菌(￡.co//)。"酵母"指真核生物体的一个范畴，在系统发生学上位于真菌界中，在子嚢菌和担子菌门(phylaAscomycotaandBasidiomycota)下。迄今描述了大约1500种酵母物种。酵母主要是单细胞微生物，主要通过无性芽殖来繁殖，尽管描述了一些多细胞酵母和通过二元裂殖来繁殖的酵母。大多数物种被归类为需氧菌，但是兼性的和厌氧的酵母也是众所周知的。与酵母发酵性生理学有关，酵母被归类为两组Crabtree阳性的和Crabtree阴性的。简言之，Crabtree效应定义为在需氧条件下培养时由于高葡萄糖浓度(例如50克葡萄糖/L)的存在微生物的氧消耗受到抑制。如此，由于葡萄糖的存在，具有Crabtree阳性表型的酵母细胞继续发酵，不管氧的可得性，而具有Crabtree阴性表型的酵母细胞不展现葡萄糖介导的对氧消耗的抑制。通常具有Crabtree阳性表型的酵母细胞的例子包括但不限于酵母属OSacc/wraw少ce力、接合酵母属(Zygayacc/^ramyce力、有孢圆酵母属(7^"/0^0^)和德克酵母属(DeMera)的酵母细胞。通常具有Crabtree阴性表型的酵母细胞的例子包括但不限于克鲁维酵母属(尺/^veram少c")、毕赤酵母属(尸/c/z&)、汉逊酵母属(/forae"M/a)和假丝酵母属(C""^fo)的酵母细胞。在本申请中所使用"某些术语的定义之后，下文例示了本发明的某些详细方面和实施方案。术语"碳源"一般指适合用作酵母细胞生长的碳来源的底物或化合物。碳源可以是各种形式，包括，但不限于聚合物诸如木聚糖和果胶、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽等。此类碳源更具体地包括，例如，各种单糖诸如葡萄糖和果糖、寡糖诸如乳糖或蔗糖、多糖、纤维素材料、饱和的或不饱和的脂肪酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇，或其混合物和来自可再生原料的未纯化混合物，诸如干酪乳清渗透物(cheesewheypermeate)、玉米浆(cornsteepliquor)、甜菜糖蜜(sugarbeetmolasses)、禾口大麦芽。充当用于生成正丁醇产物的合适起始材料的碳源包括，但不限于，生物质水解产物、葡萄糖、淀粉、纤维素、半纤维素、木糖、木质素、右旋糖、果糖、半乳糖、玉米、液化玉米粉、玉米浆(玉米湿磨工艺的副产品，其含有浸泡期间自玉米浸出的营养物)、糖蜜、木质纤维素、和麦芽糖。光合生物体能另外生成碳源，作为光合作用的产物。在一个优选的实施方案中，碳源可选自生物质水解产物和葡萄糖。葡萄糖、右旋糖和淀粉可以来自内源的或外源的来源。应当注意，可以用其它更加易得的和/或便宜的碳源替代葡萄糖，这对宿主微生物的改动是较为微小的。例如，在某些实施方案中，使用其它可再生的和经济上可行的底物可能是优选的。这些包括农业废物、基于淀粉的包装材料、玉米纤维水解产物、大豆糖蜜、水果加工业废物、和乳清渗透物等。五碳糖只被能够加工这些糖的微生物菌林用作碳源，例如大肠杆菌B。在一些实施方案中，可以使用甘油(glycerol)(—种三碳碳水化合物)作为生物转化的碳源。在其它实施方案中，可以使用甘油(glycerin)或通过水解来自植物和动物脂肪和油的甘油三酸酯得到的不纯的甘油作为碳源，只要任何杂质不会对宿主微生物产生不利影响。术语"酶"，如本文中所使用的，指任何催化或促进一种或多种化学或生物化学反应的物质，其通常包括完全或部分由多肽构成的酶，但是可以包括由不同分子(包括多核苷酸)构成的酶。术语"多核香酸"在本文中可以与术语"核酸"互换使用，指由两个或更多个单体(包括核普酸、核苷或其类似物)构成的有机聚合物，包括但不限于单链的或双链的、有义的或反义的任何长度脱氧核糖核酸(DNA)及适当时单链的或双链的、有义的或反义的任何长度核糖核酸(RNA)，包括siRNA。术语"核苷酸"指数种由核糖或脱氧核糖与嘌呤或嘧咬i成基及与磷酸基团相连接而组成的化合物之任一，其是核酸的基本结构单元。术语"核苷"指由噪呤或嘧咬碱基与脱氧核糖或核糖相组合而组成的化合物(像鸟苷或腺苷)，其尤其见于核酸。术语"核脊酸类似物"或"核苷类似物"分别指其中一个或多个单独的原子被不同的原子或被不同的官能团替换的核苷酸或核苷。因而，术语多核苷酸包括任何长度的核酸、DNA、RNA、其类似物和片段。三个或更多个核苷酸的多核苷酸也称作核苷酸寡聚物或寡核苷酸。术语"蛋白质"或"多肽"，如本文中所使用的，指由两个或更多个氨基酸单体和/或其类似物构成的有机聚合物。如本文中所使用的，术语"氨基酸"或"氨基酸单体"指任何天然的和/或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L两种光学异构体。术语"氨基酸类似物"指其中一个或多个单独的原子被不同的原子或不同的官能团替换的氨基酸。因而，术语多肽包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长蛋白质，和肽以及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽也称作蛋白质寡聚物或寡肽。术语"异源"或"外源"，如本文中关于分子(特别是酶和多核苷酸)所使的分子，无关乎表达水平，其可以低于、等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。另一方面，术语"天然"或"内源"，如本文中关于分子(特别是酶和多核香酸)所使用的，指在它们起源的或在自然界中发现它们的生物体中表达的分子，无关乎表达水平，其可以低于、等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。在某些实施方案中，天然的、未工程化改造的微生物不能将碳源转化成正丁醇或一种或多种其代谢中间产物，因为，例如，此类野生型宿主缺乏正丁醇生成途径中所需要的一种或多种酶。在某些实施方案中，天然的、未工程化改造的微生物只能够以小于理论产率的0.1%的产率将微量的碳源转化成正丁醇。例如，樣i生物诸如大肠杆菌或酵母属菌种(6Wcc/7aram;;cay^.)—般不具有将糖诸如葡萄糖转化成正丁醇的代谢途径，但是有可能将来自生成正丁醇的菌林(例如梭菌)的正丁醇生成途径转移入细菌的或真核的异源宿主中，诸如大肠杆菌或酵母属菌种，并使用所得重组微生物来生产正丁醇。微生物，一般而言，作为宿主是合适的，如果它们拥有内在特性，诸如溶剂抗性，这会容许它们在含有溶剂的环境中代谢碳源。术语"宿主"、"宿主细胞，，和"重组宿主细胞"在本文中可以互换使用，不仅指特定的受试细胞而且指这样的细胞的后代或潜在后代。因为在后续世代中由于突变或环境影响可能发生某些修饰，所以这样的后代事实上与亲本细胞可能不是同样的，但是仍然包括在如本文中所使用的该术语的范围内。对于生产正丁醇有用的宿主可以是真核的或原核的微生物。酵母细胞是优选的宿主，诸如，但不限于酿酒酵母或乳酸克鲁维酵母。在某些实施方案中，其它合适的酵母宿主微生物包括，但不限于毕赤酵母属(尸/c/^)、西洋蓍霉属(KjroH7'")、曲霉属(y4j/e^7'〃"j)、克鲁维酵母属(《/wyver0w7c")、管嚢酵母属(尸ac/z;^o^")、纟工酵母属(i/2odoto/^/a)、"l妄合酵母属(Zygosacc/zarom7ce"、半乳糖霉属(G^/actom_yce>y)、裂殖酵母属(iSb/zizwacc/wrawj/ces)、青霉属(户em'c/〃/MW)、有孢圆酵母属(rww/as/ora)、德巴利酵母属(De6a70myce力、拟威尔酵母属(附仏'op^)、德克酵母属(De^:era)、克勒克酵母属(尺/oed^ra)、梅奇酵母属(MeKc/w汰ovWa)和假丝酵母属(Gaw/Wa)物种。具体而言，本文中所公开的重组微生物被工程化改造以活化(特别是表达)能在正丁醇生产中使用的异源酶。具体而言，在某些实施方案中，该重组微术语"活化"，如本文中关于生物学活性分子(诸如酶)所使用的，指微生物的基因组和/或蛋白质组中提高该微生物中的生物学活性分子的生物学活性的任何修饰。例示性的活化包括但不限于导致分子从生物学无活性形式变成生物学有活性形式及从生物学有活性形式变成生物学更有活性形式的转化的修饰，及导致生物学活性分子在微生物中表达的修饰，其中该生物学活性分子先前不表达。例如，生物学活性分子的活化可以如下来实施，即在微生物中表达编码生物学活性分子的天然的或异源的多核苷酸，在微生物中表达编码生物学活性分子的合成途径中所牵涉的酶的天然的或异源的多核苷酸，在微生物中表达增强生物学活性分子的表达的天然的或异源的分子。即它在天然情况中不是野生型微生物的基因组的一部分，则该基因或DNA序列对于该微生物而言是"异源的"。举例而言且不加限制，对于酿酒酵母，认为编码以下任一项的DNA是异源的。大肠杆菌蛋白质或酶、来自酿酒酵母以外的任何其它微生物的蛋白质或酶、非转录和翻译的控制序列、及突变的或其它方式修饰的酿酒酵母蛋白质或RNA，无论突变体是通过选择而产生的，或者是被工程化改造入酿酒酵母中的。另外，认为具有在异源调节元件(诱导型启动子、增强子等)的转录和/或翻译控制下的野生型酿酒酵母蛋白质的构建体也是异源DNA。当碳源的氧化反应期间所生成的NADH等于被利用来将乙酰-CoA转化成代谢终产物的NADH时，说碳源的代谢是"平衡的"。只有在这些条件下，所有NADH才是循环的。在没有循环的情况中，NADH/NAD+比变得失衡(即升高)，这能将生物体引向最终死亡，除非有替代的代谢途径来维持平衡的NAD匿AD+比。在某些实施方案中，如果微生物不使用需氧或厌氧呼吸，那么正丁醇产率最高，因为在这些情况中碳以二氧化石友的形式流失(Iost)。17醇，使得碳不以二氧化碳的形式流失。术语"需氧呼吸，，指其中氧是最终电子受体且能量通常以ATP分子的形式生成的呼吸途径。术语"需氧呼吸途径"在本文中与措词"需氧代谢"、"氧化性代谢"或"细胞呼吸"可互换使用。另一方面，术语"厌氧呼吸，，指其中氧不是最终电子受体且能量通常以ATP分子的形式生成的呼吸途径。这包括其中氧以外的有机或无机分子(例如硝酸、延胡索酸、二曱亚砜、含硫化合物诸如硫酸和金属氧化物)是最终电子受体的呼吸途径。措词"厌氧呼吸途径"在本文中与措词"厌氧代谢"和"厌氧呼吸，，可互换使用。"厌氧呼吸"必须与"发酵"区分开。在"发酵"中，NADH将其电子贡献给由生成NADH中携带的电子的同一代谢途径所生成的分子。例如，在大肠杆菌的发酵性途径之一中，通过糖酵解生成的NADH将其电子转移给丙酮酸，产生乳酸。在发酵性条件下运行的微生物只能在发酵是"平衡"的情况中代谢碳源。在碳源的氧化反应期间所生成的NADH等于乙酰-CoA转化成发酵终产物所利用的NADH时，说发酵是"平衡"的。只有在这些条件下，所有NADH才是再循环的。如果没有再循环，NADH/NAD+比会变得不平衡，这导致生物体最终死亡，除非有可用的备选代谢途径来维持平衡NADH/NAD+比。在氧化期间所生成的氢等于转移给发酵终产物的氢时，则说书面发酵(writtenfermentation)是"平衡，，的。只有在这些条件下，所有NADH和还原型铁氧还蛋白才再循环成氧化形式。重要的是要知道，发酵是否是平衡的，因为如果不是这样，那么整体书面反应是不正确的。厌氧条件是高产率地生成正丁醇的微生物所优选的。图2图示了酵母中依照本发明的实施方案将碳源转化成正丁醇的途径。此途径可视为具有两个独特部分，其包括(l)碳源转化成乙酰-CoA，和(2)乙酰-CoA转化成正丁醇。由于酵母(和其它真核生物)中代谢反应的区室化和为了确保自葡萄糖生成足量的乙酰-CoA以驱动该途径的第二部分，胞质溶胶中乙酰-CoA的生成是必要的，而且因此在本文中所公开的某些工程化变体中是升高的。关于部分(l)即碳源转化成丁醇，可以工程化改造酵母微生物以提高胞质溶胶中丙酮酸变成乙酰-CoA的通量。如图3中所示，酿酒酵母在线粒体中和在胞质溶胶中生成乙酰-CoA。因为乙酰-CoA变成正丁醇的转化发生在胞质溶胶中，所以在工程化细胞中胞质溶胶中的乙酰-CoA生成升高了。任选的是，可降低或遏制线粒体中的乙酰-CoA生成。在一个实施方案中，通过提高穿过胞质"丙酮酸脱氢酶旁路"(Prank等，(1996).Yeast12(16):1607)的通量，可以自丙酮酸生成乙酰-CoA,如图3步骤l-3所图示的。为了提高穿过此路径的通量，可以过表达丙酮酸脱羧酶(PDC)、醛脱氢酶(ALD)、和乙酰-CoA合酶(ACS)中的一种或多种酶。此提高"PDH旁路"路径的活性或通量的操作能导致超过理论最大值的5%的丁醇产率的实现。因为此乙酰-CoA生成路径生成乙醛作为中间产物，所以优选将乙醛进入远离乙酰-CoA合成的途径的分流降至最低，主要是通过醇脱氢酶(ADH)的活性将乙醛进一步还原成乙醇。因此，降低或消除ADH活性可进一步提高丙酮酸脱氢酶旁^各途径的乙醜-CoA生成。例如，Crabtree阳性酵母酿酒酵母的基因组含有7种已知的ADH基因。其中，力D/Z7是胞质ADH活性的主要来源，而且删除了爿D/77的细胞不能够厌氧生长(Drewke等，(1990)./細^油gy172(7):3909)。如此，可能优选删除^D/^以将乙醛变成乙醇的转化降至最低。然而，其它ADH同等型可催化乙醛变成乙醇的还原，而且本发明也涵盖它们的降低或删除。此降低乙醛变成乙醇的转化的操作单独地或与上文所述"PDH旁路"通量升高组合地能导致超过理论最大值的10%的丁醇产率的实现。另外，丙酮酸脱氬酶催化丙酮酸变成乙酰-CoA和C02的直接转化，同时将NAD+还原成NADH。如此在某些实施方案中，在酵母胞质溶胶中过表达丙酮酸脱氢酶。或者，将丙酮酸转化成曱酸和乙酰-CoA,并且通过曱酸脱氢酶(其也将NAD+还原成NADH)的活性将所得曱酸进一步代谢成C02。因为上述乙酰-CoA生成路径利用丙酮酸作为底物，所以优选将丙酮酸进入其它代谢途径的分流降至最低。丙酮酸脱羧酶(PDC)活性代表了丙酮酸代谢的主要细胞质路径。因此，降低或消除PDC活性可进一步提高上述路径的乙酰-CoA生成。与消除PDC活性(如此消除"PDH旁路"路径)组合地，对将丙酮酸转化成乙酰-CoA的代谢途径的操作可实现超过理论最大值的50%的丁醇产率。此改善是对酵母细胞天然代谢途径的三项重要操作的结果(l)消除经由乙醇生成的碳流失；(2)消除细胞中在消耗大量能量的乙酰-CoA合成酶活性；和(3)平衡葡萄糖变成丁醇的转化中所牵涉的整个途径的辅因子(例如NAD+ZNADH)的生成和消耗(葡萄糖变成乙酰-CoA生成4个NADH，而乙酰-CoA变成丁醇的转化消耗4个NADH)。通过提高宿主酵母细胞的整体代谢适NAD"/NADH比失衡来促进丁醇途径功能，后两种操作会对产率升高贡献最大。关于部分(2)，即碳源变成丁醇的转化，可工程化改造酵母以将乙酰-CoA转化成丁醇。在一个所例示的实施方案中，乙酰-CoA-乙酰转移酶将乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA，羟丁酰-CoA脱氬酶将乙酰乙酰-CoA转化成羟丁酰-CoA,巴豆酸酶将羟丁酰-CoA转化成巴豆酰-CoA，丁酰-CoA脱氢酶(bcd)将巴豆酰-CoA转化成丁酰-CoA。为了偶联巴豆酰-CoA的还原与NADH的氧化，Bed需要电子转移蛋白(etfA和etffi)的存在和活性。然后丁醛脱氢酶/丁醇脱氢酶将丁酰-CoA转化成丁醛并将丁醛转化成丁醇。该酶可来自丙酮丁醇梭菌。2007年12月3日提交的美国专利申请流水号11/949,724(在此通过述及收入本文)中记载了使用异源表达的途径及来自产溶剂细菌(例如梭菌属物种)的基因将乙酰-CoA转化成正丁醇的途径的第二部分的例子。在一些实施方案中，重组微生物可表达一种或多种异源基因，其编码赋予生成正丁醇的能力的酶。例如，重组微生物可表达编码厌氧活性丙酮酸脱氬酶(Pdh)、丙酮酸曱酸裂合酶(Pfl)、NADH依赖性曱酸脱氢酶(Fdh)、乙酰-CoA-乙酰转移酶(硫解酶)、羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氬酶、正丁醇脱氢酶、双功能丁醛/正丁醇脱氢酶中的一种或多种的异源基因。此类异源DNA序列优选是自异源微生物(诸如丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌)获得的，而且可以使用常规分子生物学技术将这些异源基因中的一种或多种导入适宜宿主。这些异源DNA序列使得重组微生物能够生成正丁醇，至少以比野生型对应孩i生物所生成的量大的量生成正丁醇或其代谢中间产物。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物表达异源硫解酶或乙酰-CoA-乙酰转移酶，诸如由来自梭菌属的&/基因所编码的。^i解酶(E.C.2.3丄19)或乙酰-CoA乙酰转移酶是催化乙酰基缩合到乙酰-CoA分子上的酶。该酶在丙酮丁醇梭菌中由基因A/编码(GenBank登录号U08465,蛋白质IDAAA82724.1),在其它酶中，该酶在大肠杆菌中在其用于丙酮生成的天然启动子下过表达(Bermejo等，y4;p/.￡>vz>o".Mz'ra6z'o/.64:1079-1085,1998)。同源酶也已经鉴定，而且通过实施针对上文蛋白质序列的BLAST搜索能容易地鉴定。这些同系物(homolog)也能充当异源表达的正丁醇途径中的合适硫解酶。仅举几例，这些同源酶包括，但不限于那些来自以下各项的丙酮丁醇冲炎菌(例如，蛋白质IDAAC26026.1)，巴氏梭菌(C./7aWewn'a"Mm)(例如，蛋白质IDABA18857.1)，拜氏4炎菌(例如，蛋白质IDEAP599041或EAP59331,1),产气荚膜梭菌(C/oWnWwm;e/^/"ge"力(例如，蛋白质IDABG86544.1,ABG83108.1)，艰难梭菌(C/a^z'cZ/wwt/骄"7e)(例如，蛋白质IDCAJ67900.1或ZP—01231975.1),热解糖热厌氧杆菌(772e/"woawaera6ofc/e〃'Mm//^/"way"cc/z"ra/;^CMW)(例长口，蛋白质IDCAB07500.1)，腾冲热厌氧杆菌(77^m7oawaeraki!cfer^"gco"gera/s)(例如，AAM23825.1),生氢氧化碳嗜热菌(Ca^oxy(iw/2em7附/z;^rage"q/^W(my)(例^口，蛋白质IDABB13995.1)，Z)esw//otomacw/MWredwce"sMI-1(例》口，蛋白质IDEAR45123.1),热带假丝酵母(C朋(iWa^rap/ca/h)(例如，蛋白质IDBAA02716.1或BAA02715.1)，酿酒酵母(例如，蛋白质IDAAA62378.1或CAA30788.1),芽孢杆菌属菌种，埃氏巨球形菌(Mega;y^aerae/Wem7),和溶纤维丁酸弧菌(^^n'vz^7'oy^^o/vms)。另外，内源酿酒酵母硫解酶在异源表达的正丁醇途径(ScERGIO)中也可以是有活性的。根据NCBI的BLAST的计算，共享至少约55%、60%、65%、70%、75%或80%序列同一性，或至少约65%、70%、80%或90%序列同源性的同系物是能在本发明的重组微生物中使用的合适硫解酶同系物。此类同系物包括(但不限于)拜氏梭菌NCIMB80S2(ZPJ)0卯^M.1或ZP—0090"89.1),丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP—149242.1)，破伤风才炎菌(C/oWrWwwfeto"/)E88(NP—781017.1)，产气荚膜梭菌菌林13(NP—563111.1)，产气荚膜梭菌5VWW(YP—699470.1),巴氏梭菌(ABA18857.1)，热解糖热厌氧杆菌(CAB04793.1)，艰难梭菌QCD-32g58(ZP—01231975.1)，和艰难梭菌630(CAJ67900.1)。在某些实施方案中，本发明的重组-微生物表达异源3-羟基丁酰-CoA脱氢21酶，诸如由来自梭菌属的/zZ^基因所编码的。3-羟丁酰-CoA脱氬酶(BHBD)是催化乙酰乙酰-CoA转化成3-羟基丁酰-CoA的酶。此酶存在生成3-羟基丁酰-CoA的(S)或(R)异构体的不同变体。本领域技术人员通过例如实施针对上文丙酮丁醇梭菌BHBD的BLAST搜索能容易地鉴定同源酶。所有这些同源酶能充当异源表达的正丁醇途径中的BHBD。这些同源酶包括，但不限于以下各项克氏梭菌(C/os^WwmA:/w"en'),其表达此酶的两种不同形式(Miller等，/B"c/en'o/.138:99-104,1979);和解纤维丁酸弧菌(Bw/)Ww力n'o/^^o/ve"力，其含有MM基因，其组织在其丁酸途径剩余部分的相同基因座内(Asanuma等，Cwre"fM/craWo/ogy51:91-94,2005;Asanuma等，Cwre",M/cro^.o/ogy47:203-207，2003)。编码短链酰基-CoA脱氬酶(SCAD)的基因克隆自埃氏巨球形菌并在大肠杆菌中表达。能测定体外活性(Becker等，伤oc/ze脂;^732:10736-10742，1993)。在其它梭菌属菌林中鉴定了其它同系物，诸如克氏梭菌(Hillmer等，F五5S丄e".21:351-354，1972;Madan等，五mk/5/oc&w.32:51-56,1973)、拜氏梭菌、热解糖梭菌(C./7e，osacc/2ara/,'c應)、破伤风梭菌。在某些实施方案中，其中表达BHBD,选择与上游〃琉解酶或下游巴豆酸酶起源相同的生物体的酶可能是有益的。这可避免在表达来自不同生物体的酶时对该途径中邻近蛋白质之间的潜在蛋白质-蛋白质相互作用的破坏。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物表达异源巴豆酸酶，诸如由来自梭菌属的cW基因所编码的。巴豆酸酶或烯酰-CoA水合酶是催化顺式和反式烯酰-CoA底物可逆水合成相应的(3-羟酰CoA衍生物的酶。在丙酮丁醇梭菌中，丁酸代谢的这个步骤由cw基因所编码的EC4.2.1.55来催化(GenBank蛋白质编号AAA95967，Kanehisa,Kanehisa,Mnw"他^Sy附;.247:91-101,2002;讨i仑01陽3，19-28,244-52)。来自丙酮丁醇梭菌的巴豆酸酶(Crt)已经纯化至均质并得到了表征(Waterson等，/5"/.CTzem.247:5266-5271，1972)。它在天然的和变性的状态都表现为均质的蛋白质。该酶表现出作为四聚体发挥功能，亚基分子量为28.2kDa和261个残基(Waterson等报道了分子量为40kDa和长度为370个残基)。纯化的酶在緩沖溶液中在4。C保存时或在冷冻时丧失活性(Waterson等，J5/o/.C7e肌247:5266-5271，1972)。该酶的最适pH为pH8.4(Schomburg等，7Vwc/e/c爿"'Ai仏32:D431-433，2004)。与具有广泛底物特异性的哺乳动物巴豆酸酶不同，细菌的酶只水合巴豆酰-CoA和己烯酰-CoA。为巴豆酰-CoA得到了^w和7Q值为6.5x1(^摩尔每分每摩尔和3x1(T5M。该酶在巴豆酰-CoA浓度高于7x1()5M时受到抑制(Waterson等，J所o/.C/2e附.247:5252-5257,1972;Waterson等,/历o/.C/;ew.247:5258-5265,1972)。已经解析出了巴豆酸酶家族的许多酶的结构(Engel等，《/Mo/.5"/.275:847-859,1998)。cW基因在大肠杆菌中高表达，而且展现出比在丙酮丁醇梭菌中所看到的更高的比活(187.5U/mg胜过128.6U/mg)(Boynton等，/i5a"en'o/.178:3015-3024,1996)。真核生物和原核生物中编码了巴豆酸酶的许多不同同系物，它们作为丁酸代谢、脂肪酸合成、(3-氧化和其它相关途径的一部分发挥作用(Kanehisa,Mnw"toFoM"t/5^m/7.247:91-101,2002;讨论01-3，19-28,244-52;Schomburg等，A^c/e/c^c/AA"32:D431-433,2003)。这些酶中许多已经被深入研究。来自牛肝的烯酰-CoA水合酶得到了极度深入的研究和彻底的表征(Waterson等，/B/o/.C7ze附，247:5252-5257，1972)。生成了来自细菌的巴豆酸酶的20种最亲近直向同系物的ClustalW比对。同系物的序列同一性的从40%到85%不等。根据NCBI的BLAST的计算，共享至少约45%、50%、55%、60%、65%或70%序列同一性，或至少约55%、65%、75%或85%序列同源性的同系物是能在本发明的重组微生物中使用的合适Crt同系物。此类同系物包括，但不限于破伤风梭菌E88(NP—782956.1)，产气荚膜梭菌SMW(YP_699562.1),产气荚膜梭菌菌林13(NP—563217.1),拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00909698.l或ZP—00910124.1),沃氏共养单胞菌沃氏亚种哥廷根菌抹OS^"fra//zowo"ossm6s;.wo^e/Goe"/"gew)(YP—754604.1)，Desw^btomacw/mwredwce"sA/7-7(ZP—01147473.1或ZP—01149651.1),热解糖热厌氧杆菌(CAB07495.1),和生氩氧化碳嗜热菌Z-2901(YP_360429.1)。在梭菌中进行的研究证明了编码巴豆酸酶的cW基因是作为更大的BCS操纵子的一部分编码的。然而，对溶纤维丁酸弧菌(及/ZWoso/vera)(—种来自瘤胃的生成丁酸的细菌)的研究显示了略有不同的排列。虽然I型溶纤维丁酸弧菌具有作为操纵子的部分而簇集和排列的^/、cW、ZzM、6cd、e^和e/B基因，但是II型菌抹具有类似的簇但缺少cW基因(Asanuma等，Cwr.Mfcra&o/.51:91-94，2005;Asanuma等，Cwr.M/cra&o/.47:203-207,2003)。既然该蛋白质在大肠杆菌中充分表达且彻底表征，那么丙酮丁醇梭菌酶是异源表达的正丁醇途径所优选的酶。其它可能的靶物是来自聚核梭杆菌文氏亚种(T^yo6"c/en.wwwwc/efl似wW"ce""/)(Q7P3U9-Q7P3U9—FUSNV)、艰难氺麦菌(P45361-CRTj:LODI)、巴氏梭菌(P81357-CRT—CLOPA)、和马尔他布鲁氏菌(Sr"ce〃ame/"ms/力(Q8YDG2-Q8YDG2一BRUME)的同源基因。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物表达异源丁酰-CoA脱氢酶和必要时相应的电子传递蛋白，诸如由来自梭菌属的6c么d/丄和e(/B基因所编码的。丙酮丁醇梭菌丁酰-CoA脱氢酶(Bcd)是催化巴豆酰-CoA中的碳-碳双键还原以产生丁酰-CoA的酶。此还原偶联NADH的氧化。然而，该酶需要两种电子传递蛋白，即e^4和e^/B(Bennett等，FemsMfcraWo/ogy/eWews17:241-249，1995)。丙酮丁醇梭菌ATCC824的编码酶(3-羟基丁酰-辅酶A(CoA)脱氢酶、巴豆酸酶和丁酰-CoA脱氢酶的基因在BCS操纵子上簇集，其GenBank登录号为U17110。丁酰-CoA脱氢酶(Bcd)蛋白质序列(GenBank登录号AAA95968.1)显示于SEQIDNO:3。根据NCBI的BLAST的计算，共享至少约55%、60%、65%、70%、75%或80°/。序列同一性，或至少约70%、80%、85%或90°/。序列同源性的同系物是能在本发明的重组微生物中使用的合适Bcd同系物。此类同系物包括，但不限于破伤风梭菌E88(M^782955.1或NP—781376.1)，产气荚膜梭菌菌林13(NP—563216.1)，拜氏梭菌(AF494018—2)，拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00910125.1或ZPJ)0909697.1),和热解糖热厌氧杆菌(CAB07496.1)，腾冲热厌氧杆菌M54(NP—622217.1)。根据NCBI的BLAST的计算，共享至少约45%、50%、55%、60%、65%或70°/。序列同一性，或至少约60%、70%、80%或90%序列同源性的同系物是能在本文中所描述的重组微生物中使用的合适Hbd同系物。此类同系物包括，但不限于丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP—349314.1)，破伤风梭菌E88(NP—782952.1)，产气荚膜梭菌5"M7W(YP—699558.1),产气荚膜梭菌菌林13(NP—563213.1)，糖丁酸冲炎菌(C7o"nWwmsacc/wra^O^cwm)(AAA23208.1),拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00910128.1)，拜氏梭菌(AF494018—5)，腾冲热厌氧杆菌MS4(NP—622220.1)，热解糖热厌氧杆菌(CAB04792.1),和^汰a/^H7wweto〃/mi/geweygl^MF(ZP—00802337.1)。Bcd对丁酰-CoA的尺m为5。丙酮丁醇梭菌k^和编码相应ETF的基因已经克隆入大肠杆菌-丙酮丁醇梭菌穿梭载体中。在用此质粒转化的丙酮丁醇梭菌ATCC824中检测到升高的Bed活性(Boynton等，Jowma/o/Ba"en'o/ogy178:3015-3024，1996)。丙酮丁醇梭菌P262Bcd对丁酰-CoA的^^为大约6jaM(DiezGo歸lez等，CWreWM/cra6油^34:162-166,1997)。Bcd的同系物(homologues)和相关ETF已经在生成丁酸的厌氧生物埃氏巨形菌(Williamson等，Aoc/zem/ca//owma/218:521-529，1984)、埃氏消化链球菌(尸eptoW/^ptococcz^e/scfem.0(Engel等，5/oc/zew/ca/Jowma/125:879，1971)、布氏共养生孑包菌0Syw^ra//7os/oraf6/^aw")(Dong等,^"om'eKw丄eewwew/2oeA:/w^7加'owfl/Jbw72fl/o/Gewera/朋(iMo/ecw/arM/craZn'o/ogy67:345-350，1995)、禾口5贵々虫密虫累^走体(7e/owema//zagecfewes)(George等，J0M/77a/o/Ba"eWo/ogy152:1049-1059，1982)中鉴定。埃氏巨球形菌Bcd的结构已经解析(Djordjevic等，J^oc/^w/W/j34:2163-2171，1995)。丙酮丁醇梭菌ATCC824Bed的BLAST搜索在极其多个物种中鉴定了大量同源序列，本文中上文列举了同系物中的一些。任何编码这些同系物的基因都可用于本发明。注意到，在一种微生物(诸如大肠杆菌)中异源表达这些基因时可产生表达问题和/或电子传递问题，但是在另一种微生物中则不然。另外，一种同源酶可在给定微生物中具有表达和/或电子传递问题，但是其它同源酶则可不然。不同的、大体等同的基因的可得性在工程化改造重组微生物时提供了更多设计选择。一种早已在大肠杆菌中克隆和表达的有前途的Zcd来自埃氏巨球形菌，而且所表达的酶的体外活性能测定(Becker等，5/oc/^/m;^y32:10736-10742，1993)。O'Neill等报道了e^4和e/诏基因在大肠杆菌中的克隆和异源表达及对所编码的来自埃氏巨球形菌的蛋白质的功能表征(O'Neill等，J所o/.C/zew.273:21015-21024，1998)。用ETF测定法测量了活性，该测定法将NADH氧化与巴豆酰-CoA的还原经Bcd偶联起来。含Bcd的重组ETF在ETF测定法中的活性与如Whitfield和Mayhew所报道的天然酶活性类似。因此，利用埃氏巨球形菌Bcd及其ETF蛋白提供了合成丁酰-CoA的解决方案。埃氏巨球形菌Bcd在重组表达时的Km测量为5pM,而在天然宿主中表达时为14(iM(DuPlessis等，所oc/zem&^y37:10469-77，1998)。埃氏巨球形菌Bcd表现出在极低浓度受到乙酰乙酸抑制C^为0.1uM)(Vanberkel等，五w■/B/oc/ze附.178:197-207，1988)。在含有A/、cW、/zk/、6c丄d/丄和"yB的基因簇。与丙酮丁醇梭菌相比，这些蛋白质的氨基酸序列相似性是高的(Asanuma等,Cwrew/Af/cra6/o/ogy51:91-94，2005;Asanuma等，Cwrew/M/cra^o/ogy47:203-207,2003)。在哺乳动物系统中，在线粒体中找到了牵涉短链脂肪酸氧化的类似的酶。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物表达异源"反式-2-烯酰-CoA还原酶"或"TER"。反式-2-烯酰-CoA还原酶或TER是能够催化巴豆酰-CoA转化成丁酰-CoA的蛋白质。在某些实施方案中，重组微生物表达与来自梭菌属和其它细菌物种的Bcd/EtfA/Etffl催化相同反应的TER。来自纤细眼虫(五.grac/fe)的线粒体TER已有描述，而且衍生自许多物种的许多TER蛋白和具有TER活性的蛋白质已经鉴定，形成TER蛋白质家族(美国专利申请2007/0022497,Cirpus等；Hoffmeister等，/仏o/.C7iew.，280:4329-4338，2005,在此通过提述将它们完整并入本文)。纤细眼虫基因的截短cDNA已经在大肠杆菌中功能性表达。此cDNA或来自其它微生物的同系物的基因能与正丁醇途径基因A/、ac//7￡2、和/k/一起表达，用以在大肠杆菌、酿酒酵母或其它宿主中生成正丁醇。TER蛋白还可通过普遍公知的生物信息学方法来鉴定，诸如BLAST。TER蛋白的例子包括，但不限于，来自诸如以下物种的TER:眼虫属(五wg/e"fl^p.)，包括但不限于纤细眼虫；气单胞菌属C4eramo"osw/.)，包括但不限于嗜水气单胞菌(A/7j^rap/z^);冷单胞菌属CP^c/zramo"os^;.)，包括但不限于深海冷单月包菌CP/wgra/zam");发光杆菌属(尸/zoto6a"en'wws/p.)，包括但不限于深海发光杆菌CP;ra/Mw^m);弧菌属(J^n'o^p.)，包括但不限于ra"gw/ww、霍乱弧菌(Kc/w/erae)、解藻朊酸弧菌(Ka/g/"o/y"c附)、副溶血弧菌(Kpara/wrewo/;^/cz^)、创伤弧菌(Kvw/"^cz^)、费氏弧菌(K/^c/en')、杣烂弧菌(K5p/e"(i/(iw力；希瓦氏菌属(^S7zew""e〃as/p.),包4舌4旦不卩艮于51.flwazo"e"szi,51.woot/少/，5*.yh'g/(i/man'"a,5"./ae/eaw"，51.6a//ca，反石肖4匕希瓦氏菌(5*.tie"anyca"^;海;羊虫累菌属(Ocefl"os/7/n.〃M附sp/.);黄单月包菌属(^￥13"//20附0"05W.)，包括但不限于稻黄单胞菌(Xow加e)、田野黄单胞菌(义cam/e^^);色盐杆菌属(C7zramo/za/okzcew/;.),包括但不限于需盐色盐杆菌(C.^/ex/ge"力；/(i/owan)"s/p.,包才舌4旦不卩艮于/.Zw/"cfl;交替J^单刀包菌属(尸""(ioa/fera附o"ayWP.)，包括但不限于大西洋交替假单胞菌(AW/a"&");交替单胞菌属(^4//era附。"oy5//.);iSacc/z"ra/7/zagMSsp/.,包^^旦不卩艮于51.^fegrat/am1,5".gammapro/eo6acfen'wwz，51./ro/eo6acter/ww，^艮单月包菌属(i^ewc/omowas包括但不限于铜绿假单胞菌CPaen^/woM)、恶臭假单胞菌(Ppi^&)、焚光假单胞菌CP/7womscera);伯克霍尔德菌属CSwA/zoWen'aw;.)，包括但不限于5.p/^to/^mara,新洋葱伯克霍尔德氏菌(及ce"ocepac/a)，洋葱伯克霍尔德、氏菌(5.ce;ac/"),5.<37^6^/^7'",越南伯克霍尔德、氏菌(5.v/ef"amem7》，5.mw/"wrams5.<io/as<3;曱基杆菌属(Me^y/kc/〃uss;^.)，包括4旦不卩艮于M^age/Za^s;寡养单胞菌属(5fewo/rop/zowo"as^;.),包括但不限于嗜麦芽糖寡养单胞菌OS.ma/to//2///a);聚集杆菌属(Cb"greg/k"er^;.)，包括但不限于C.//torafc;沙雷氏菌属(5fem2"a)，包括^旦不限于变形斑沙雷氏菌(S.prafea附oat/ara);;每洋单月包菌(iWlar/Mowo"as5p/.);J^e〃asp/.，包4舌^旦不卩艮于义/as"&cwa;ie/"efea5pp.;科尔韦尔氏菌属(Co/we〃/aspp.),包括但不限于C.p^c/^o^/zraea;耶尔森氏菌属(rera/m'a^sp/.)，包括但不限于鼠疫耶尔森氏菌(Z/e幼》、々i结核耶尔森氏菌(7;wew(ioft^m^/a^);曱基菌属(Me/Zi[y/c^ac/〃i^)，包括但不限于My7age〃a^s;喧纤维菌菌属(Cytop/2agaWP.)，包括4旦不限于p合氏嗟纤维菌(C/mfc/H'mom'0;黄杆菌属(F/awk"en'"wWP.)，包括但不限于Fyo/z"so"/ae;微颤菌属(肘/<^05"7/0^/^.)，包括但不限于Mman'wa;才及i也4干菌属CPo/an'6a"ers/p.)，包4舌4旦不卩艮于/！/rgera";冲炎菌属，包括但不限于丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌；柯克斯体属(Co:aW/aW/.)，包括但不限于贝氏柯克斯体(C.6ww^7)。在前述之外，术语"反式-2-烯酰-CoA还原酶"或"TER"指能够催化巴豆酰-CoA转化成丁酰-CoA且根据使用缺省参数的NCBIBLAST的计算，与截短的纤细眼虫TER或全长的嗜水气单胞菌TER之任一或二者共享至少约400/0、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列同一性，或至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列相似性的蛋白质。如本文中所使用的，"序列同一性"指所比对的序列中同一位置中完全相同核苦酸或氨基酸的存在。"序列相似性"考虑到了大致匹配，而且只在依照"差异"或"相同性"的一些量度对此类替代打分时有意义，在所述度量中保守的或高度可能的替代被赋以比非保守的或不大可能的替代更有利的得使用TER代替Bcd/EtfA/Etffi的另一个优点是TER在单体形式是有活性的，而且蛋白质表达和酶自身都对氧不敏感。如本文中所使用的，"反式-2-烯酰-CoA还原酶(TER)同系物"指来自其它生物体(例如，属于眼虫或气单胞菌类(phylum))的酶同源多肽，其具有与上文所定义的相同的TER本质特征，但是共享小于40°/。的序列同一性和50%的序列相似性标准，如上文所讨论的。突变涵盖一个或多个氨基酸残基的替代、添加、删除、倒位或插入。这容许需氧生长和正丁醇过程的表达阶段期间的酶表达，能潜在容许更加高效的生物燃料生成过程。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物表达异源丁醛脱氢酶/正丁醇脱氢酶，诸如由来自梭菌属的M/"/k//^、aa丄或^//7￡2基因所编码的。丁醛脱氬酶(BYDH)是催化丁酰-CoANADH依赖性还原成丁醛的酶。丁醛进一步被正丁醇脱氢酶(BDH)还原成正丁醇。此还原也伴有NADH氧化。丙酮丁醇梭菌含有已经显示出将丁酰-CoA转化成正丁醇的数种酶的基因。这些酶之一由a^/编码(Nair等，JBa"eWo/.176:871-885,1994)。此基因在丙酮丁醇梭菌菌林DSM792中称作a^五。该酶是犯/操纵子的一部分，而且它编码双功能BYDH/BDH(Fischer等，Jow7za/o/Sa"en'o/ogy175:6959-6969,1993;Nair等，JBac&Wo/.176:871-885,1994)。G^/的基因产物在大肠杆菌中功能性表达。然而，在需氧条件下，所得活性保持很低，指示氧敏感性。根据对丁醛的活性相对于对乙醛的活性为超过100倍高，Aad的主要作用在正丁醇的形成中而非乙醇(Hair等，Jowr"a/o/Ja"er油gy176:5843-5846,1994)。根据NCBI的BLAST的计算，共享至少约50%、55%、60%或65%序列同一性，或至少约70%、75%或80%序列同源性的同系物是能在本文中所公开的重组微生物中使用的合适同系物。此类同系物包括(但不限于):破伤风梭菌E88(NP—781989.1)，产气荚膜梭菌菌林13(NP—563447.1),产气荚膜梭菌ATCC13124(YP—697219.1),产气荚膜梭菌SM101(YP—699787.1)，拜氏梭菌NCIMB8052(ZP_00910108.1)，丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP_149199.1)，艰难梭菌630(CAJ69859.1),艰难梭菌QCD-32g58(ZP_01229976.1),和热纤维梭菌(C7o^rWwmAerwoce〃ww;)ATGC27405(ZP—00504828.1)。另外两种NADH依赖性正丁醇脱氬酶(BDHI，BDHII)已经纯化，而且它们的基因(6WAM/z5)已经克隆。BDHI的GenBank登录号是AAA23206,1,28而蛋白质序列显示于SEQIDNO:10。BDH1I的GenBank登录号是AAA23207.1,而蛋白质序列显示于SEQIDNO:11。这些基因在染色体上是相邻的，但是由它们自己的启动子转录(Walter等，GWe134:107-111，1993)。BDHI利用NADPH作为辅因子，而BDHII利用NADH。然而，注意到相对辅因子偏爱是pH依赖性的。在自质粒表达M/L4后在大肠杆菌裂解物中观察到BDHI活性(Petersen等，Jow"a/o/Bac/m'o/ogy173:1831-1834,1991)。BDHII据报道具有的对丁醛的活性是对乙醛的活性的46倍高，而且在逆方向的活性低50倍。BDHI对丁醛的活性只为对乙醛的活性约2倍高(Welch等，爿rc/z/veso/所oc/ze附/W^朋d5z'c^/z;w'c^273:309-318，1989)。如此，在一个实施方案中，在异源表达的正丁醇途径中使用BDHII或BDHII同系物。另外，这些酶在5.5的相对较低pH最有活性，在选择合适的宿主和/或工艺条件时可考虑此性状。虽然上文所述基因在产溶剂的条件下转录，一种不同的基因，aW五2在产醇的条件下转录(Fontaine等，/Ba"en'o/.184:821-830，2002,GenBank登录号AF321779)。这些条件在相对中性的pH存在。该酶已经在大肠杆菌的厌氧培养中过表达，且具有高NADH依赖性BYDH和BDH活性。在某些实施方案中，此酶是优选的酶。此酶的蛋白质序列(GenBank登录号AAK09379.1)显示于SEQIDNO:1。根据NCBI的BLAST的计算，共享至少约50%、55%、60%或65%序列同一性，或至少约70%、75%或80%序列同源性的同系物是能在本文中所公开的重组微生物中使用的合适同系物。此类同系物包括，但不限于产气荚膜梭菌SM川7(YP—699787.1)，产气荚膜梭菌菌抹13(NP_563447.1),产气荚膜梭菌ATCC13124(YP一697219.1)，破伤风梭菌E88(NP—781989.1),拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00910108.1),艰难梭菌QCD-32g58(ZP—01229976.1),艰难梭菌630(CAJ69859.1),丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP—149325.1),和热纤维梭菌ATCC27405(ZP_00504828.1)。在某些实施方案中，可以使用与任何上述多肽至少约70%、80%、90%、95%、99%同一的，或共享至少约60%、70%、80%、90%、95%序列同源性(相似的)的任何同源酶代替这些野生型多肽。这些共享必需序列同一性或相似性的酶可以是来自不同生物体的野生型酶，或者可以是人工的重组的酶。在某些实施方案中，可以使用编码具有与任何上述酶相同活性的酶的任何基因代替编码上述酶的基因。这些酶可以是来自不同生物体的野生型酶，或者可以是人工的、重组的、或工程化改造的酶。另外，由于遗传密码的内在简并性，也可以使用编码基本上相同的或功能上等同的氨基酸序列的其它核酸序列来克隆和表达编码此类酶的多核苷酸。本领域技术人员会理解，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达会是有利的。在一种物种中最常被利用的密码子称作最佳密码子(optimalcodon)，而不太经常利用的密码子归为罕见或低使用率密码子。可以替代密码子以反映宿主优选的密码子选择，即有时称作"密码子优化，，或"控制物种密码子偏好"的过程。提供了为植物中的表达而优化核苷酸序列的方法学，例如，在美国专利No.6,015，891及其中引用的参考文献中。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物具有一种或多种来自产溶剂的梭菌属，诸如丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的异源DNA序列。例示性的丙酮丁醇梭菌是菌抹ATCC824,而例示性的拜氏梭菌是菌林NCIMB8052。基因的表达可以通过常规分子生物学手段来实现。例如，异源基因可以在诱导型启动子或组成性启动子的控制下。异源基因可以整合入宿主微生物的染色体中，或者作为能稳定传递("遗传")给子细胞的染色体外遗传元件存在。此类染色体外遗传元件(诸如质粒、BAC、YAC等)可以另外含有确保此类遗传元件在子细胞中的存在的选择标志。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物还可生成正丁醇生成途径的一种或多种代谢中间产物，诸如乙酰乙酰-CoA、羟基丁酰-CoA、巴豆酰-CoA、丁酰-CoA、或丁醛，和/或其衍生物，诸如丁酸。在一些实施方案中，本文中所描述的为生成正丁醇而被工程化改造以活化一种或多种上文所述异源酶的重组微生物经异源途径生成正丁醇。如本文中所使用的，术语"途径"指包括一种或多种受酶控制的、将底物转化成产物的化学反应的生物学过程。因而，用于将碳源转化成正丁醇的途径是包括一种或多种受酶控制的、将碳源转化成正丁醇的反应的生物学过程。"异源途径"指其中至少一种或多种化学反应之至少一种由至少一种异源酶催化的途径。另一方面，"天然途径"指其中的一种或多种化学反应由天然酶催化的途径。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物被工程化改造以活化生成正丁醇的异源途径(在本文中也称作正丁醇途径)，其包含(1)2个乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA，(2)乙酰乙酰-CoA转化成羟基丁酰-CoA,(3)羟基丁酰-CoA转化成巴豆酰-CoA，("巴豆酰-CoA转化成丁酰-CoA，(5)丁醛转化成正丁醇(见图2例示性图解)。2个乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA可通过在重组微生物中表达编码乙酰-CoA-乙酰转移酶(硫解酶)或Thl的天然或异源基因来实施。在本文中所公开的重组微生物中合适的例示性硫解酶由如下基因编码来自丙酮丁醇梭菌(具体而言来自菌抹ATCC824)的A/,或来自巴氏梭菌、拜氏梭菌(具体而言来自菌抹NCIMB8052或菌林BA101)、热带假丝酵母、芽孢杆菌属、埃氏巨球形菌、或解纤维丁酸弧菌的编码同源酶的基因，或选自/""或atoB的大肠杆菌硫解酶基因。乙酰乙酰-CoA转化成羟基丁酰-CoA可通过在重组微生物中表达编码羟基丁酰-CoA脱氬酶Hbd的天然或异源基因来实施。在本文中所公开的重组微生物中合适的例示性Hbd由如下基因编码来自丙酮丁醇梭菌(具体而言来自菌抹ATCC824)的/zk/，或来自克氏梭菌、拜氏梭菌(具体而言来自菌抹NCIMB8052或菌抹BA101)、热解糖梭菌、破伤风梭菌、解纤维丁酸弧菌、埃氏巨球形菌、或大肠杆菌(/a必)的编码同源酶的基因。羟基丁酰-CoA转化成巴豆酰-CoA可通过在重组微生物中表达编码巴豆酸酶或Crt的天然或异源基因来实施。在本文中所公开的重组微生物中合适的例示性cW由来自丙酮丁醇梭菌(具体而言来自菌林ATCC824)的cW，或来自溶纤维丁酸弧菌、聚核梭杆菌文氏亚种、艰难梭菌、巴氏梭菌、或马尔他布鲁氏菌的编码同源酶的基因编码。巴豆酰-CoA转化成丁酰-CoA可通过在重组孩史生物中表达编码丁酰-CoA脱氬酶的天然或异源基因来实施。在本文中所公开的重组微生物中合适的例示性丁酰-CoA脱氢酶由来自丙酮丁醇梭菌(具体而言来自菌抹ATCC824)的k^/e//4/e〖/B，或来自埃氏巨球形菌、埃氏消化链球菌、布氏共养生孢菌、溃蚀密螺旋体、解纤维丁酸弧菌的编码同源酶的基因，或哺乳动物线粒体Bcd同系物编码。丁醛转化成正丁醇可通过在重组微生物中表达编码丁醛脱氢酶或正丁醇脱氬酶的天然或异源基因来实施。在本文中所公开的重组微生物中合适的例示性丁醛脱氢酶/正丁醇脱氢酶由来自丙酮丁醇梭菌(具体而言来自菌抹ATCC824)的W/zAM/zB、aa丄或^//^2,或来自拜氏梭菌(具体而言来自菌抹NCIMB8052或菌抹BA101)的编码ADH-1、ADH-2、或ADH-3的基因编码。在某些实施方案中，自乙酰-CoA至正丁醇的代谢途径的酶是(i)硫解酶(Thl),(ii)羟基丁酰-CoA脱氢酶(Hbd)，(iii)巴豆酸酶(Crt)，(iv)醇脱氬酶(AdhE2),或正丁醇脱氬酶(Aad)或丁醛脱氬酶(Ald)加之单功能正丁醇脱氢酶(BdhA/BdhB)中的至少一种，和(v)反式-:2-烯酰-CoA还原酶(TER)(图2)。在某些实施方案中，Thl、Hbd、Crt、AdhE2、Ald、BdhA/BdhB和Aad来自梭菌属。在某些实施方案中，梭菌属是丙酮丁醇梭菌。在某些实施方案中，TER来自纤细眼虫或来自嗜水气单胞菌。在某些实施方案中，一种或多种异源基因编码乙酰-CoA-乙酰转移酶(硫解酶)、羟丁酰-C0A脱氬酶(/26力、巴豆酸酶(cr0、和醇脱氢酶(ad/^2)、丁酰-CoA脱氢酶(6c力、丁醛脱氢酶(M/L4/Z^/^)/丁醇脱氢酶(aa力、和反式-2-烯酰-CoA还原酶(TER)中的一种或多种。例如，乙酰-CoA-乙酰转移酶(硫解酶)可以是来自丙酮丁醇梭菌的A/，或来自巴氏梭菌、拜氏梭菌、热带假丝酵母、芽孢杆菌属菌种、埃氏巨球形菌、或溶纤维丁酸弧菌的同源酶，或选自fadA或atoB的大肠杆菌硫解酶。羟丁酰-CoA脱氬酶可以是来自丙酮丁醇梭菌的hbd，或来自克氏梭菌、拜氏梭菌、热解糖梭菌、破伤风梭菌、解纤维丁酸弧菌、埃氏巨球形菌、或大肠杆菌(fadB)的同源酶。巴豆酸酶可以是来自丙酮丁醇梭菌的crt,或来自溶纤维丁酸弧菌、聚核梭杆菌文氏亚种、艰难梭菌、巴氏梭菌、或马尔他布鲁氏菌的同源酶。丁酰-CoA脱氢酶可以是来自丙酮丁醇梭菌的bcd/etfA/etffi，或来自埃氏巨球形菌、埃氏消化链球菌、布氏共养生孢菌、溃蚀密螺旋体、解纤维丁酸弧菌的同源酶，或真核线粒体bcd同系物。丁醛脱氢酶/丁醇脱氢酶可以是来自丙酮丁醇梭菌的bdhA、bdhB、aad、或adhE2，或来自拜氏梭菌的ADH-1、ADH-2、或ADH-3。反式-2-烯酰-CoA还原酶(TER)可以来自纤细眼虫或嗜水气单胞菌。一种或多种异源DNA序列可以来自选自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的产溶剂梭菌，或来自艰难梭菌、巴氏梭菌、克氏梭菌、热解糖梭菌、破伤风梭菌、热带假丝酵母、芽孢杆菌属菌种、马尔他布鲁氏菌、埃氏巨球形菌、溶纤维丁酸弧菌、聚核梭杆菌文氏亚种、埃氏消化链球菌、布氏共养生孢菌、32在某些实施方案中，丙酮丁醇梭菌是菌林ATCC824，而拜氏梭菌是菌林NCIMB8052或菌抹BA101。在某些实施方案中，共享至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%序列同一性，或至少约50%、60%、70%、80%、90。/o序列同一性(根据NCBIBLAST的计算，使用缺省参数)的同系物对于本发明是合适的。部分(l):工程化改造丙酮酸变成乙酰-CoA的转化如上所述，丙酮酸变成乙酰-CoA的转化可通过两种一般路径发生在工程化细胞中(A)如上所述的"PDH旁路"路径或(B)胞质溶胶中通过PDH或通过PFL进行的丙酮酸变成乙酰-CoA的直接转化。(A)经"PDH旁路，，路径生成乙酰-CoA关于自丙酮酸生成乙酰-CoA的路径(A)，胞质乙酰-CoA生成途径是由三种酶催化的，如图3中步骤1、2和3所示。通过提高那些限速的酶的活性实现了生成乙酰-CoA的更有效途径。例如，在酿酒酵母中，如果ALD活性在途径中是限制性的，那么^LD6的过表达会由此提高通过该途径的整体通量。经以下机制之一或其组合实现了胞质溶胶中升高的乙酰-CoA形成在一个实施方案中，通过丙酮酸脱羧酶基因(例如，酿酒酵母尸Z)C7、尸DC5和/或尸DC6;步骤l)的过表达可生成升高的乙酰-CoA。在另一个实施方案中，通过乙醛脱氢酶基因(例如，酿酒酵母^丄Z^;步骤2)的过表达可生成升高的乙酰-CoA。在又一个实施方案中，通过乙酰-CoA合酶基因(例如，酿酒酵母JGS/或^CS2或二者；步骤3)的过表达可生成升高的乙酰-CoA。在一个不同的实施方案中，ALD和ACS(酿酒酵母JZD6;步骤2)二者的同时过表达可生成升高的乙酰-CoA(步骤2和3)。在另一个实施方案中，PDC、ALD、和ACS基因的同时过表达可生成升高的乙酰-CoA生成(步骤l-3)。为了进一步提高乙酰-CoA生成，可以降低或消除酵母中的主要胞质乙醇生成途径。在Crabtree阳性酿酒酵母中，这是通过删除v4D/7/来实现的，JD///是胞质ADH活性的主要来源。删除了^DH7的细胞不能够厌氧生长(Drewke等，(1990).J.Bacteriology172(7):3909),而且如此可能优选删除^D/Z/以将乙醛变成乙醇的转化降至最低。消除此途径选择性驱动乙醛通向乙酸且随后通向乙酰-CoA生成(图3，步骤5)。因此，可以在具有降低的或消除的ADH活性的细胞中实施上文所述基因的过表达。类似的，可以在Crabtree阴性酵母诸如乳酸克鲁维酵母中通过删除ADHI或ADHII降低或消除胞质ADH活性，用以提高经"PDH旁路"路径自丙酮酸至乙酰-CoA的通量。因此，在此生物体中，与上文对酿酒酵母所提议的类似，可以经由单独的或组合的尺M丄D6、AX4CS7或AX4GS7的过表达来提高经过"PDH旁路"路径的通量。(B)自丙酮酸直接生成乙酰-CoA关于自丙酮酸生成乙酰-CoA的路径(B),可以通过形成完整PDH复合物的基因的过表达来提高乙酰-CoA生成。例如，过表达的基因可以来自大肠杆菌(aceE、aceF、和/p^4)、运动发酵单胞菌(Z少mcwowosmo&7z》(^//z/4ot、/c/^4y5、/<i/i6、和&力、金黄色葡萄球菌(5!top/^/ococcw51"wm^y)(/<i/L4、/<i^S、—/7C、和、才古草芽孑包4干菌(5acz'〃wss"6"fc)、谷氛酸氺奉#干菌(Co/7"e6acen'wwg/wto附/cwm)、或4同纟录"f叚单月包菌(尸sewiiomomMaerwg/wos")(步骤4)。丙酮酸脱氢酶复合物催化丙酮酸变成乙酰-CoA的转化。在酿酒酵母中，此复合物定位在线粒体内膜空间中。因此，在酿酒酵母的细胞质中获得更高水平乙酰-CoA的另一种方法是工程化改造细胞以过表达能在细胞质中发挥功能的真核的或原核的丙酮酸脱氢酶复合物(步骤4)。在某些实施方案中，本文中所公开的重组微生物包括在厌氧或微需氧条件下有活性的丙酮酸脱氢酶(Pdh)。丙酮酸脱氢酶或NADH依赖性曱酸脱氢酶对于重组微生物而言可以是异源的，即编码这些酶的编码序列是异源的，或转录调节区是异源的(包括人工的)，或所编码的多肽包含包含序列变化，其使得该酶对某些代谢中间产物或底物带来的反馈抑制有抗性。直到最近，才广泛接受了Pdh在厌氧条件下不发挥功能，但是数份最近的报告证明了情况并非如此(deGraef，M.等，1999，JournalofBacteriology,181，2351-57;Ver證i，G.N.等，2002,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,68,1715-27)。此外，其它微生物诸如粪肠球菌CE"&racocc^/aecafc)即使在厌氧条件下也展现出Pdh复合物的高体内活性，前提是生长条件使得稳态NAD應AD+比足够低(Snoep，J.L.等，1991，F^twMkro&o/ogy81，63-66)。代替调节Pdh表达和功能的氧，已经显示了Pdh受到NADH/NAD+比的调节(deGraef,M.等，1999，/ow"a/o/5a"enb/ogy，181,2351-57)。如果在宿主细胞中表达的正丁醇途径消耗NADH快得足以在细胞内部维持低NADH/NAD+水平，那么内源或异源表达的Pdh可维持活性和提供NADH，其足以平衡该途径。这些Pdh酶能在本文中所公开的重组微生物中平衡正丁醇途径。在厌氧条件下功能性的Pdh的表达预期提高每摩尔葡萄糖获得的NADH摩尔数。Kim等记载了Pdh使得在大肠杆菌中消耗每摩尔葡萄糖可得到多达4摩尔NADH(Kim，Y.等(2007).jpp/.五"Wramw.M/cra&o/"73，1766-1771)。也可以工程化改造酵母，以表达来自各式各样细菌来源的PDH复合物。例如，来自粪肠球菌的Pdh与来自大肠杆菌的Pdh类似，但是在低得多的NADH/NAD+水平被灭活。另外，有些生物体诸如枯草芽孢杆菌和几乎所有乳酸细菌菌抹在厌氧代谢中使用Pdh。如果正丁醇生成途径能与内源发酵性途径竟争的话，那么在表达厌氧活性Pdh的微生物中表达正丁醇生成途径预期导致大于1.4%的正丁醇产率。或者，可以通过过表达两种细菌酶，即丙酮酸曱酸裂合酶(例如大肠杆菌py/B)和曱酸脱氢酶(例如博伊丁氏假丝酵母(Caw^feZ)oWw7)/^7)，在胞质溶胶中生成乙酰-CoA。使用此途径，丙酮酸被转化成乙酰-CoA和曱酸。然后曱酸脱氢酶催化曱酸变成二氧化碳的NADH依赖性转化。这些反应的净结果与丙酮酸脱氬酶复合物将丙酮酸转化成乙酰-CoA的情况相同丙酮酸+NAD十—乙酰-CoA+NADH+C02。NADH依赖性甲酸脱氢酶(Fdh;EC1.2丄2)催化曱酸变成0)2的氧化和同时的NAD+变成NADH的还原。Fdh可依照本发明用于提高宿主微生物内的NADH胞内可得性，而且可用于在NADH方面平tf正丁醇生成途径。具体而言，可以在宿主微生物中活化(具体而言是过表达)生物学活性NADH依赖性的Fdh。在存在这种新引入的曱酸脱氢酶途径时，l摩尔曱酸转化成二氧化碳时会形成1摩尔NADH。在某些实施方案中，在天然微生物中，曱酸脱氢酶将曱酸转化成C02和H2，不牵涉辅因子。另外，可以使用本领域技术人员已知的方法对任何编码外来酶的基因(或本文中所提及的任何其它的)(或任何控制或调控其表达的调节元件)进行另外，为了调控此途径，可以表达来自其它真菌和细菌物种的丙酮酸脱羧酶、乙酰-CoA合成酶、和乙醛脱氬酶基因。多种生物体能充当这些酶的来源，包括，但不限于酵母属菌种，包括酿酒酵母突变林和葡萄汁酵母(5*.mwwm);克鲁维酵母属，包括耐热克鲁维酵母(KAemoto/eram)、乳酸克鲁维酵母、和马克思克鲁维酵母(尺man:/amw);毕赤酵母属；汉逊酵母属，包括多形汉逊酵母(7/:;o/;;wc^/w);假丝酵母属；丝孢酵母属(7Hc/20^ora")、y"ma(iaz戸af，包括Ks印/to;7brw/os/ora/reton'em^;粟酒裂殖酵母(Sc/z/zasacc/zaram少ce;函6e);隐球菌属菌种(Oj^/ococctws/.);曲霉属菌种；脉孢菌属菌种(A^wms:;oraw.)或黑粉菌属菌种(as"/agow.)。有用丙酮酸脱羧酶的例子是那些来自贝酵母(5^cc/2Cfraw少CM6a少a"w)(1PYD)、Ca"t/Wag/a6rato、乳酸克鲁维酵母(KIPDC1)、或构巢曲霉(Ap^^〃附m'血/ara)(PdcA)、和来自白色假丝酵母(C朋tfefoa/Wcara)、粗糙脉孢菌(A^Mmy/oracrowa)、构巢曲霉、或乳酸克鲁维酵母(ACSl)的乙酰-CoA合酶，和来自黑曲霉C4werg/〃wsm'ge"(ALDDH)、白色假丝酵母、新生隐球菌(Oj;tococc^"eq/b，am)(alddh)的乙醛脱氢酶。有用原核酶的来源包括，但不限于大肠杆菌、运动发酵单胞菌、芽孢杆菌属菌种、梭菌属菌种、假单胞菌属菌种、乳^求菌属菌种(丄actococcws;.)、肠4干菌属菌种(五"&raZfl"ers/.)和沙、门氏菌属菌种(&^0"6//0平)。通过工程化改造这些酶以实现增强的活性，可获得此途径的进一步增强，其通过定点诱变和其它进化方法(这包括本领域技术人员已知的技术)来实现。原核生物，诸如，但不限于，大肠杆菌、运动发酵单胞菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌属菌种、梭菌属菌种、棒杆菌属菌种、假单胞菌属菌种、乳球菌属菌种、肠杆菌属菌种、和沙门氏菌属菌种，能充当这种酶复合物的来源。例如，来自大肠杆菌(aceE、aceF、和//^4)、运动发酵单胞菌(pdhAoc、pdhA(3、pdhB、和Ipd)、金黄色葡萄球菌(pdhA、pdhB、pdhC、和pdhC)、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、和铜绿假单胞菌的丙酮酸脱氢酶复合物可用于此目的。培养和操作酵母的方法是本领域公知的。在酵母细胞中过表达基因、以各种较低的水平表达基因、遏制基因表达、或删除基因的方法是本领域公知的，而且本发明涵盖任何此类方法用于构建本发明的酵母菌抹。可使用任何方法来将外源核酸分子导入酵母中，而且许多此类方法是本领域技术人员公知的。例如，转化、电穿孔、接合、和原生质体融合是用于将核酸导入酵母细胞的常用方法。参见例如Ito等，《/5ac/era/.153:163-16836(1983);Durrens等，Cwr.18:7-12(19卯)；及Becker和Guarente,M"/wA/"五"2^wo/ogy194:182-187(1991)。在一个实施方案中，感兴趣基因进入DNA片段或靶基因的整合依照同源重组的原理发生。依照这个实施方案，含有包含至少一种酵母标志基因的模块、有或无待整合基因(内部模块)的整合盒任一侧翼均为与靶定整合位点的末端同源的DNA片段(致重组序列)。通过适宜方法用该盒转化酵母后，致重组序列之间的同源重组可导致内部模块替换基因组中与整合盒的致重组序列对应的两个位点之间的染色体区域。在一个实施方案中，为了删除基因，整合盒可包括适宜的酵母选择标志，其侧翼为致重组序列。在一个实施方案中，为了异源基因整合入酵母染色体中，整合盒包括在适宜启动子和终止子控制下的异源基因，与选择标志一起，侧翼为致重组序列。在一个实施方案中，异源基因包含适宜的天然基因，期望提高天然基因的拷贝数。选择标志基因可以是任何在酵母中使用的标志基因，包括，但不限于，来自酿酒酵母的WM3基因或同源基因；或潮霉素抗性基因，它们分别用于对转化细胞进行基于营养缺陷型互补或抗生素抗性的选择。可以随意选择致重组序列，这取决于适合于期望应用的期望整合位点。另外，在一个实施方案中，使用本领域技术人员公知的技术自基因组中清除某些被导入的标志基因。例如，通过将含有^^43的细胞在含有？0八(5-氟-乳清酸)的培养基中涂板，并选择FOA抗性菌落，能获得WL43标志丢失(Boeke,J.等，1984，Mo/.197，345-47)。可以将包含在本公开内容酵母细胞内的外源核酸分子以任何形式维持在该细胞内。例如，可以将外源核酸分子整合入细胞的基因组中，或维持在附加体状态，其能稳定地传递("遗传")给子细胞。此类染色体外遗传元件(诸外，可以稳定地或瞬时地转化酵母细胞。另外，本文中所描述的酵母细胞可含有单拷贝或多拷贝的如上所述特定外源核酸分子。用于自外源核酸分子表达多肽的方法是本领域技术人员公知的。此类方法包括但不限于构建核酸，使得调节元件促进编码期望多肽的核酸序列的表如此，调节元件包括但不限于启动子、增强子等等。例如，外源基因可以在诱导型或组成性启动子的控制下。此外，用于在酵母中自外源核酸分子表达多肽的方法是本领域技术人员公知的。例如，能够在克鲁维酵母属(参见例如美国专利No.4,859,596和4，943,529,通过述及将每一篇完整收入本文)和酵母属(参见例如Gelissen等，1卯(1):87…7(199乃)中表达外源多肽的核酸构建体是公知的。在另一个实施方案中，异源控制元件可用于活化或遏制内源基因的表达。另外，在要遏制或消除表达时，可以通过已知的删除技术来消除有关酶、蛋白质或RNA的基因。如本文中所描述的，本公开内容范围内的酵母可通过对所表达的、过表达的或遏制的特定酶特异性的选择技术来鉴定。鉴定具有期望表型的菌林的方法是本领域技术人员公知的。此类方法包括但不限于PCR和核酸杂交技术诸如Northern和Southern分析，在特定基底(substrate)上或在存在特定底物(substrate)、化学品、选择剂等时改变的生长能力。在有些情况中，可使用免疫组织化学和生物化学技术通过检测所编码多肽的表达来测定细胞是否含有特定核酸。例如，可使用对所编码的酶具有特异性的抗体来测定特定酵母细胞是否含有该所编码的酶。另外，可使用生物化学技术通过检测作为酶多肽表达的结果而生成的产物来测定细胞是否含有编码酶多肽的特定核酸分子。例如，用编码乙酰-CoA合成酶的载体转化细胞并检测到升高的胞质乙酰-CoA浓度指示载体存在且基因产物有活性。用于检测特定酶活性或特定产物的存在的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以如Dalluge等，爿"a/.历o，fl/.C&m.374(5):835-840(2002)所记载的来测定乙酰-CoA的存在。本发明的酵母细胞具有降低的酶活性，诸如降低的醇脱氢酶活性。术语"降低的"，如本文中关于细胞和特定酶活性所使用的，指比在相同物种的可比较酵母细胞中所测量到的水平要低的酶活性。如此，缺乏醇脱氢酶活性的酵母细胞视为具有降低的醇脱氢酶活性，因为大多数(如果不是所有的话)可比较的酵母菌抹具有至少一些醇脱氢酶活性。此类降低的酶活性的原因可以是较低的酶浓度、较低的酶比活、或其组合。许多不同方法可用于使得酵母具有降低的酶活性。例如，可以工程化改造酵母细胞，以具有遭到破坏的编码酶的基因座，其使用常用诱变或敲除技术来实现。参见例如MethodsinYeastGenetics(1997年版)，Adams,Gottschling,Kaiser，和Stems,ColdSpringHarborPress(1998)。或者，可使用反义技术来降低酶活性。例如，可以工程化改造酵母，以含有编码反义分子的cDNA,该反义分子阻止酶生成。术语"反义分子"，如本文中所使用的，涵盖任何含有与内源多肽编码链对应的序列的核酸分子。反义分子还可具有侧翼序列(例如调节序列)。如此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。核酶可具有任何通用结构，包括，但不限于，发夹、锤头、或斧头(axhead)结构，前提是该分子切割RNA。具有降低的酶活性的酵母可使用任何方法来鉴定。例如，可使用常用方法来容易地鉴定具有降低的醇脱氢酶活性的酵母，例如通过经气相层析测量乙醇形成。在一个实施方案中，可以使用两步过程自本公开内容的代谢工程化菌株之一生成正丁醇。因为高水平的丁醇(例如在培养基中为1.5%,这一般随酵母和菌种而变化)对于细胞可以是有毒性的，一种获得大量正丁醇的策略是培养能够在其中不生成丁醇或只生成不显著的、无毒性的量的丁醇的条件下生成正丁醇的菌林。此步骤容许大量活细胞的积累，即显著量的生物质，然后可以将其转换成其中生成正丁醇的生长条件。这样的策略容许在毒性问题变得重要和减緩细胞生长之前生成大量正丁醇。例如，可以在需氧条件下培养细胞(其中正丁醇生成受到遏制或缺失)，然后转换成厌氧或微需氧条件以生成正丁醇(例如通过活化已经依照本发明被工程化改造入菌种中的适宜的代谢途径)。或者，有关酶的表达可以在诱导型控制下，例如热敏感性启动子或其它热敏感性步骤(诸如酶自身的热稳定性)，使得第一个步骤发生时伴有有关途径或酶关闭(即无活性)，诱导发生(例如温度转变)和正丁醇生成。用于对基因进行诱导型控制的方法是公知的。热稳定的酶是已知的，或者可以通过本领域已知方法来选择。正如在本公开内容的其它过程中那样，一旦生成正丁醇，就可以依照一个实施方案回收它。用于自微生物(包括酵母)回收正丁醇的过程披露于2007年12月3日提交的美国临时申请流水号11/949,724，通过述及收入本文。本领域技术人员会领会，可以对上文所描述的发明进行各种省略、添加和修改，而不偏离本发明的范围，而且所有此类修改和变化意图落在所附权利要求书限定的发明范围内。在此通过述及将所引用的所有参考文献、专利、专利申^青、和其它文件收入本文。实施例表l列举了实施例l-38中所描述的一组基因。给出了可用于扩增每一种基因的有关引物(正向的和反向的)、以及每一种引物的序列。基因是依照对每一种物种适宜的命名规则列举的；在某些所列举的基因前面有两个字母，它们代表了给定基因起源的属和种的第一个字母。对于某些基因名称，附有后缀"-co"，指示使用细菌大肠杆菌或酵母酿酒酵母优选的密码子使用率构建了经过密码子优化的合成基因，正如正文中所指明的。表l基因SEQIDNO:SEQID70:基因引物名称引物序列155Gevo-3"42ICilGCiACJAIUAAAAAUAlIIIItilA(JIltiUAUGevo-17543AATTGGATCCTTATTTAGAATAATCATAGAATCCTCb-crt156Gevo-31244GTTCTTGTCGACATGGAATTAAAAAATGTTATTCTTGGevo-17145AAIIGGAIGCIIAIIIAIIIIGAAAAIIUIIICJIGGOb掘157Gevo-31346CAAGAGGTCGACATGAATTTCCAATTAACTAGAGAACGevo-31447GCGTCCGGATCCCTATCTTAAAATGCTTCCTGCG158Gevo-31548CGGAAAGTCGACATGAATATAGCAGATTACAAAGGCGevo-17349AATTGGATCCTTATTCAGCGCTCTTTATTTCTTTA159Gevo-31650CAAAATGTCGACATGAATATAGTAGTTTGTGTAAAACGevo-31751IAAIIIG(JAIGGIIAGAIGIA(JIGIIIIICIIIIAAICb-a掘160Gevo-31952GAACCAGTCGACATGGCACGIIIIACTTTACCAAGGevo-17753AATTGGATCCTTACAAATTAACTTTAGTTCCATAGGb-a她161Gevo-31854TCCATAGTCGACATGAATAAAGACACACTAATACCTGevo-24955AATTGGATCCTTAGCCGGCAAGTACACATCTTCTTTGTCTCa-加162Gevo-30856GATCGAGTCGACATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAGGevo-30957GTTA'IAGGAICCCIAGCA(JIIII(JIAGCJAAIAIIGCa-,163Gevo-28158GTGGATGTCGACATGAAAAAGGTATGTGTTATAGGTGGevo-16159AAI图AIOJIIAIlIIGAAIAAIUJIA(JAAAaJICa-crt164Gevo-28260TCCTACGTCGACATGGAACTAAACAATGTCATCCTGevo-28361TAACT丁GGAICCCIAI(JIAIIIIICJAAGCXIl(JAAICa-6cc/165Gevo-28462CAAGAGGTCGACATGGATTTTAATTTAACAAGAGAACGevo-28563CAATAAGGA丁CCTTATCTAAAAATTTTTCC丁GAAATAACCa-e鹏166Gevo-28664CGGGAAGTCGACATGAATAAAGCAGATTACAAGGGCGevo-28765GTTCAAGGATCCTTAATTATTAGCAGCTTTAAC丌GCa-e他167Gevo-28866CAAAATTGTCGACATGAATATAGTTGTTTGTTTAAAACGevo-28967(JlIIIAGGAICX;iIAAAIAIAGI(ilIGIl(JIIIIAAIIII<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表2列举了一组质粒构建体及其有关特征，正如实施例中所描述的。表中包括有关质粒名称(pGV);存在的原养型标志，其对于质粒在适宜的营养缺陷型菌种中的选择和维持是有用的；启动子序列(来自给定酿酒酵母基因区域)；前述启动子控制下的基因；另外的启动子+基因组合，如果存在的话。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表3描述了携带各种质粒并由此表达一组所导入的基因(如列举的)的酵母酿酒(菌林W303a)酵母中所生成的丁醇表3:酿酒酵母转化体的丁醇生成<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>所有基因克隆和组合规程最初是使用已建立的方法(Miller，J.H.，1992;Sambrook，J.等，2001)在大肠杆菌中实施的。对于在酵母酿酒酵母中的表达有用的一组载体先前已有记载(Mumberg,D.等(1995)Gene156:119-122;Sikorski和Heiter(1989)Genetics122:19-27)。具体而言，这些出版物记载了一组选择标志(7/ZS3、Z^tT2、77尸/、f/W力和酿酒酵母复制起点，它们在表2中所列举的许多载体中也有使用。实施例1:用于在酵母酿酒酵母中表达丁醇途径基因的质粒构建使用刚好在起始密码子上游引入5^/I位点和刚好在终止密码子之后引入Sam/7I位点的引物，通过PCR自来自酿酒酵母菌林W303a的基因组DNA克隆了酿酒酵母硫解酶基因五WG川。将此PCR产物用5^/I和5am/7I消化并克隆入pUC19(Yanisch-Perron，C，Vieira，J.,1985,G匿，33，103-19)的相同位点以生成pGV1120。分别使用质粒pGV1031、pGV1037、pGV1094、和pGV1095作为PCR扩增丙酮丁醇梭菌基因(Oz-)Q-A/、Ca-ZzM、Ca-cw、和Ca-Z^/z5的模板。使用pGV1090作为PCR扩增O^c丄Ca-"/4、和Oz-e(/B的模板。使用梭菌ATCC824的基因组DNA来扩增Ca-6WA将扩增片段用5WI和^^7/I消化并克隆入pUC19的相同位点。此方案生成质粒pGV1121、pGV1122、pGV1123、pGV1124、pGV1125、pGV1126、pGV1127、pGV1128，它们分别含有基因C"-/W、Ca誦/^丄Qz-cW、Ca-6c丄Ga-e^4、Ca-e(/B、07-6J/l4、和G3扁^Z/z5。使用设计成刚好在起始密码子上游引入Sa/I位点和刚好在终止密码子下游引入5am/ZI位点的引物，通过PCR扩增拜氏梭菌(C6-)基因C6-Z^丄O)-cW、C6-k^、C6-e(/^、C6-e(/B、0-aW/z、和CZw^/z丄分别使用质粒pGV1050、pGV1049、pGV1096和pGV1091作为PCR扩增C6-Z2M、C6-cW、07-aW/z、和C6-atZ/^的模板。使用拜氏梭菌ATCC51743的基因组DNA作为C6-k^、C6-e^4、和C6-e/B的模板。将PCR扩增片段用Sa/I和^^/7I消化并克隆入pUC19的相同位点。此规程生成质粒pGV1129、pGV1130、pGV1131、pGV1132、pGV1133、pGV1134、和pGV1135，它们分别含有基因CW26丄cw、C6-6cc/、CZ-"/4、C6-"/B、C6画"W/7、和0-a^L4。还克隆了为在大肠杆菌中表达进行过密码子优化的(-co)丙酮丁醇梭菌和埃氏巨球形菌(Me-)基因。这些基因包括Ca-thl-co、Ca-hbd-co、Ca-crt-co、Ca-bcd-co、Ca-etfA-co、Ca-etfB隱co、Ca-adhE2-co、Me-bcd-co、Me-etfA-co、和Me-etffi-co。使用设计成刚好在起始密码子的上游引入5^/I位点和刚好在终止密码子下游引入Sam别位点的引物，扩增除了Ca-thl-co和Me-etffi-co以外的这些基因。在Ca-thl-co和Me-etffl-co的情况中，引物设计成刚好在起始密码子的上游引入五coiI位点和刚好在终止密码子的下游引入5amM位点。将所得PCR产物用适宜的限制酶消化0S(3/I和5am/yi或&o/I和万am/7I)并克隆入pUC19的相同位点以生成质粒pGV1197、pGV1198、pGV1199、pGV1200、pGV1201、pGV1202、pGV1203、pGV1205、pGV1206，它们分别含有基因Ca-thl-co、Ca-hbd-co、Ca-crt-co、Ca-bcd-co、Ca-etfA-co、Ca-etffi-co、Ca-adhE2-co、Me-etfA-co、和Me-etffl-co。将Me-bcd-co基因作为片段直接克隆入pGV1103中以生成pGV1214。将上述基因克隆入高拷贝酵母表达载体pGV1099、pGV1100、pGV1101、pGV1102、pGV1103、pGV1104、pGV1105和pGV1106。表2中描述了用于基因克隆的载体和所得质粒构建体的特性。使用Sa/I和BamHI分别自pGV1120和pGV1121释放硫解酶基因五/G^和a^/z/并克隆入pGV1099(携带/7ZS^标志)以生成pGVli:3S和pGV1139。使用五coRI和5am/TI自pGV1197取出经过密码子优化的硫解酶基因Ca-AZ-co并克隆入pGV1099以生成pGV1207。如此，这些基因克隆成符合两个拷贝的AU1标签(SEQIDNO:172)的读码框并使用酿酒酵母7^F7启动子区(SEQIDNO:175)表达。使用Sa/I和Bamm分别将羟丁酰-CoA-脱氢酶基因Ca-;zk/(来自pGVl122)、0>-/7k/(来自pGVl129)、和Ca-/zk/-co(来自pGVl198)克隆入pGV1100(携带Z^"2标志)以生成pGV1140、pGV1141、和pGV1208。这导致这些基因克隆成符合HA标签(SEQIDNO:173)的读码框并使用r五F/启动子表达。使用&/1和^^附//1分别将巴豆酸酶基因Ca-cW(来自pGV1123)、O-cW(来自pGV1130)、C"-cW-co(来自pGV1199)克隆入pGV1101(携带77尸/标志物)以生成pGV1142、pGV1143、和pGV1209。如此，这些基因克隆成符合两个拷贝的AU1标签的读码框并使用7^F7启动子表达。将丁酰-CoA脱氬酶和相应的电子传递基因和e/B克隆到myc标签(SEQIDNO:174)后面，使用来自酿酒酵母的77)/B启动子区(SEQIDNO:176)表达。将0^c《来自pGV1124)、C6-k^(来自pGV1131)、Ca-kY/-co(来自pGV1200)和Me-bcd-co基因克隆入pGV1103(携带77753标志)以生成pGV1144、pGV1145、pGV1210、和pGV1214。分别将C"-"/^(来自pGV1125)、Ca-e(/B(来自pGV1126)、C6-"/^(来自pGV1132)、C6-e(/B(来自pGV1133)、Ga扁e(/B-co(来自pGV1202)、和Me-e^-co(来自pGV1205)基因克隆入pGV1104(携带丄五C/2标志)以生成pGV1146、pGV1147、pGV1148、pGV1149、pGV1212、和pGV1215。分别将Oz-"^-co(来自pGV1201)和Me-^/B-co(来自pGV1206)克隆入pGV1104(携带7T尸7标志)以生成pGV1211和pGV1216。将醛脱氢酶基因C6-aW/z(来自pGVl134)克隆入pGVl102(携带t7/L43标志)以生成pGV1150。将C6-aW/2基因放置成符合HA标签(SEQIDNO:173)的读码框，使用7E^7启动子表达。将双功能醛/醇脱氢酶Cfl-a"t/、Ca-^/;^2、和Ca-ac/Z^2-co及特定醇脱氢酶Oz-M/l4、C"-6^B、和C6-a^^克隆到myc标签后面，在7D/D启动子控制下表达。使用设计成刚好在起始密码子上游引入5b/I位点和刚好在终止密码子下游引入Mrt位点的引物，通过PCR扩增O-aad和Ca-^Z/^:入使用质粒pGV1089作为Ca-aad的模板，而4吏用丙酮丁醇梭菌基因组DNA作为Ca-ad/^2的模板。使用5^/I和iVM将这些PCR产物克隆入pGV1106(携带WM3标志)以生成pGV1136(Ca-aa力和pGV1137(Ca-a^￡2)。使用51"/1和56^//1将经过密码子优化的0-^//^2《0(来自pGV1203)克隆入pGV1106以生成pGV1213。使用Sa/I和BawM分别将醇脱氢酶Ca-M/"(来自pGV1127)、Ca-k/;^(来自pGV1128)、和C6-a^v4(来自pGV1135)克隆入pGV1106以生成pGV1151、pGV1152、和pGV1153。因此，将丁酰-coA脱氢酶、电子传递蛋白A、电子传递蛋白B、和特定醇脱氢酶的上文所述酵母表达基因与7EF7启动子驱动的硫解酶、羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、或醛脱氢酶以成对方式组合，如表2中所汇总的。为此目的，分别将来自pGV1144(7Z>//3启动子和C"-k^)和来自pGV1145(7P//3启动子和C6-6c力的￡co/C7^I至Wol片段克隆入pGV1138的用Klenow填平)至A7/oI位点以生成pGV1167(￡WG^+Ca4ccO和pGV1168(￡7G70+C6-k^)。还分别将这些相同的五co/CiI至^7zoI片段类似地克隆入pGV1139以生成pGV1169(a^W+Ca-6c力和pGV1170(0-A/+C6-6cc0。使用相同的策略，分别将来自pGVl146(7X)/7_5启动子和、pGV1148(n)/D启动子和Ca-e(/B)、pGV1147(7P/D启动子和C6-"/v4)、和pGVl149(7D7/3启动子和CZ)-e(/B)的五co/C7I至^7zo1片段克隆入pGVl140、pGV1141、pGV1142、pGV1143的iVort(用Klenow填平)至^7oI位点以生成pGV1171(C"-編+Oz-e剣、pGV1172(CW什Ca-e卿、pGV1173(C^-M^+0-W/v4)、和pGVlH4(C6-cW+C6-e/B)。类似地通过分别将来自pGV1151(7T)/B启动子和Ca-、pGV1152(H)//3启动子和Oz-k//^)和卩0￥1153(7//3启动子和0)-^/^)的&0/01至屈01片段克隆入？0￥1150的(用Klenow填平)至Iol位点以生成pGV1175(C6-aW/z+a-M/")、pGV1176(C6-aW/7+C"-k//7B)、和pGV1177(C6-aW/2+C6-fl^L4)，将醛脱氢酶和醇脱氬酶组合。在经过密码子优化的基因的情况中，分别将来自？0￥1210(7^//3启动子和Ca-k^-co)、pGV1211(77)/W启动子和C"-"/4-co)、pGV1212(7D/D启动子和a-e^B-co)的五co/C7I至WoI片段克隆入pGV1207、pGV1208、和pGV1209的5am別(用Klenow补平)至^7zoI位点以生成pGV1220(Ca-A/-co+Ca-6o/-co)、pGV1217(0-/2Z^-co+Ca-"/4-co)、和pGV1218(Ca匿cW-co+Q-e/S-co)。分别将来自pGV1214(7D//3启动子和Me-bcd-co)、pGV1215(7D/73启动子和Me-etfA-co)、pGV1216(r/)/0启动子和Me-etfB-co)的五co/C7I至扇oI片段克隆入同一组载体以生成pGV1224(Oz-A/-co+Me-bcd-co)、pGV1221(0-/2^/-co+Me-etfA-co)、和pGV1222(Ca-cW-co+Me-etfB-co)。另夕卜，将来自卩0￥1210(7!)//3启动子和07-k^-co)和来自pGV1214(7D/73启动子和Me-k^-co)的五co/C7I至^oI片段克隆入pGVl138的万am/ZI(用Klenow补平)至JWzoI位点以生成pGV1223(EAG76l+a^c^-co)和pGV1219(￡扁0+MeU-co)。在上述途径之外，生成了利用k^/e^4/e《/B复合物的替代物，即反式-烯酰还原酶和巴豆酰-CoA还原酶的构建体。自丙酮丁醇4炎菌(CaAr)、嗜水气单胞菌04/7-fer)、和纤细眼虫(五g-^0克隆了反式-烯酰还原酶基因，而且自山丘链霉菌(&re/tow_ycwco〃/""力ccr)克隆了巴豆酰-coA还原酶。使用设计成刚好在起始密码子上游引入^/I位点和刚好在终止密码子下游引入iVo/I位点的引物，自丙酮丁醇梭菌基因组DNAPCR扩增了Ca:/^。使用设计成刚好在起始密码子的上游引入Sa/I位点和刚好在终止密码子的下游引入万amM位点的引物，分别自pGVl114、pGVl115、和pGVl166PCR扩增了l/er、￡g*、和Sc-ccr。这三种基因的序列已经为大肠杆菌中的表达进行了密码子优化。还有，五g-fer序列编码缺失可能牵涉线粒体定位的N-末端区域的蛋白质。使用适宜的限制酶将相应的PCR产物克隆入pGV1103以生成pGV1155(Ca-/eO、pGVl156(屈勿)、pGVl157(五g漏敏)和pGVl158(&償)。为了用于在酵母中表达丁醇途径，将k^/"/4/e〖/B复合物的这些替代物中每一种与硫解酶基因在一个质粒上组合。将Ca-fer、J/2-fer、五g-er和Sc-ccr基因与03-^"0基因组合，通过分别将来自pGV1155、pGV1156、pGV1157和pGV1158的五co/C/I至Wol片段克隆入pGV1207的^m//1(用Klenow补平)至屈ol位点以生成pGV1225(0^/z/匿co+Ca-^0、pGV1226(Ca-A/-co+J/7-&0、pGV1227(C"W-co+五g智)和pGV1228(0^/，+&-<^)。实施例2:酵母提取物/Western印迹分析为了分析蛋白质表达，通过快速TCA沉淀方案制备粗制酵母蛋白质提取物。收集l个OD600当量的细胞并在冰上用200pL1.85NNaOH/7.4。/o2-巯基乙醇处理10分钟。添加200(aL50。/。TCA并将样品在水上再溫育10分钟。通过以25，000rcf离心2分钟来收集所沉淀的蛋白质并用lml水冷的丙酮清洗。再次通过以25,000rcf离心2分钟来收集蛋白质。然后将沉淀物重悬于SDS样品緩沖液并煮沸(99。C)10分钟。将样品在离心机中以最大速离心30秒以清除不溶物。将样品通过SDS-PAGE分开并转移至硝酸纤维素。4吏用TMBWestern印迹试剂盒(KPL)进行Western分析。HA.ll、myc(9E10)、和AU1抗体得自Covance。如制造商所述的那样实施Westerns，只是在使用myc抗体时，使用补充有1。/o检测块粉(detectorblockpowder)的0.3x至0.5x检测块溶液(detectorblocksolution)。利用这种方法检验了实施例l中所描述的所有基因的表达。实施例3:酵母转化使用乙酸锂法(Gietz,R,D.a.R.A.W.，2002,Me/ZzoA&￡"z_ymo/ogy，350,87-96)进行了酿酒酵母(W303a)转化。简言之，将lml过夜酵母培养物稀释入50mL新鲜YPD培养基并在30。C摇床中温育5-6小时。收集细胞，用50mL无菌水清洗，再用25mL无菌水清洗。用lmLlOOmM乙酸锂重悬细胞并转移至微量离心管。通过离心10秒来沉淀细胞。丢弃上清液并将细胞重悬于4倍体积的100mM乙酸锂。将15jiL细胞添加至DNA混合物(72(iL50Q/oPEG、lOpL1M乙酸锂、3uL10mg/ml变性鲑鱼精DNA、2pL每种期望的质粒DNA和无菌水至总体积100(iL)。将样品于30。C温育30分钟并于42。C热激22分钟。然后通过离心10秒来收集细胞，重悬于100pLSOS培养基(Sambrook,J.,Fritsch，E.F.,Maniatis,T.,1989)，并在不含尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸或组氨酸的适宜SC选择板(KaiserC,M.，S.和Mitchel,A，1994)上涂布。实施例4:正丁醇的生成对表达与所建议的丁醇生成途径有关的酶的不同组合的转化体(上文表l)评估正丁醇生成。如下制备隔离群的预培养物，即将来自SC琼脂板的少数菌落接种入3mlSC培养基(KaiserC，M.，S.和Mitchel,A，1994),在需氧条件下于30。C以250rpm摇动16小时。将所得细胞以4000xg沉淀5分钟并重悬于500jalSC培养基。通过合适稀释度的600nm吸光度来评估细胞生长。对于所测试的每一种隔离群，将产生15个OD的细胞注射(200nl)入装有5ml先前已经用N2气饱和以消除溶解氧的SC厌氧培养基的厌氧balch管。将管于30。C温育，以250rpm摇动来防止细胞沉降。在接种后IO、26、44和70小时对管取样，即用无菌注射器取出500ial培养物。之后，将250{1140%葡萄糖溶液注射入每一个管以维持培养基中适量的碳。在每一个时间点，将所回收的样品离心以沉淀细胞，并立即冷冻上清液直至收集了所有样品。通过气相层析(GC)分析测定转化体的正丁醇生成。将所有冷冻样品于室温融化并将400nl每一种样品及作为内部对照添加的80(^110mM戊醇通过0.21im滤器过滤。将20(V1所得滤出液置于GC管形瓶中并进行GC分析。在配备有HP-7673自动取样系统的带火焰离子化检测仪(FID)的系列IIPlus气相层析仪上运行样品。基于可信标准品的保留时间来鉴定分析物，并使用5点校准曲线来定量。以ljil体积注射所有样品。在连接FID检测仪的DB-FFAP毛细管柱(30m长度，0.32mmID,0.25|im薄膜厚度)上实施正丁醇产物的直接分析。用于将醇产物分开的温度程序为225。C注射器，225。C检测仪，50°C烤箱O分钟、然后8。C/分钟梯度至80。C、13。C/分钟梯度至170。C、50。C/分钟梯度至220。C、然后220。C3分钟。为了评估丁醇生成，测试了每一种质粒组合的两个独立转化体。上文表3总结了结果。"隔离群名称"下的两个Gevo名称指为每一种质粒组合所评估的两个独立转化体。下文(图6)显示了相对于仅用空载体即GevolllO和Gevollll转化的隔离群，最好的两种生产者即转化体Gevol099和Gevoll02随时间变化所生成的丁醇量。Gevol099和Gevoll02展现出丁醇生成随时间的升高，在接种后24-72小时丁醇浓度分别自123!iM升高至313pM和自57^iM升高至317nM。51实施例5:大肠杆菌丙酮酸脱氢酶亚基在酿酒酵母中的克隆和表达此实施例的目的是描述如何自一起包含在大肠杆菌中找到的丙酮酸脱氢酶(PDH)的三种亚基的大肠杆菌克隆ace五、aceF、和//^基因。使用PCR自基因组DNA扩增这三种基因。此实施例还例示了这三种基因的蛋白质产物如何在宿主生物体即酿酒酵母中表达。使用大肠杆菌基因组DNA作为模板，通过PCR扩增来自大肠杆菌的//%^基因。为了特异性扩增/;^」，使用引物Gevo-610和Gevo-611;制造商的试剂盒中供应了其它PCR扩增试剂，例如，KOD热启动聚合酶(Novagen，Inc.,产品目录#71086-5)，并依照制造商的方案来使用。正向和反向引物分别摻入编码^/I和A72oI限制性内切核酸酶位点的核苷酸。将所得PCR产物用Sa/I和^zo1消化并克隆入pGV1103，产生pGV1334。对所插入的//^4DNA完整测序。使用与上文所述类似的办法，将来自大肠杆菌的ace五和aceF基因插入pGV1334。使用引物Gevo-606和Gevo-607自大肠杆菌基因组DNA扩增ace五基因，用5W/I+loI消化，并克隆入经5WI+loI切割的载体pGV1334，产生pGV1379。对ace五插入物完整测序。为了获得具有适合于酿酒酵母表达的不同原养型选择标志的质粒，作为S"/I+屈o1片段自pGV1379克隆出ace五插入物并克隆入经5WI+^oI切割的pGV1104,产生pGV1603。使用引物Gevo-653和Gevo-609自大肠杆菌基因组DNA扩增aceF基因。将所得1.9kb产物用Sa/I+ioI消化并克隆入经相同酶切割的载体pGV1334，产生pGV1380。对aceF插入物完整测序。为了获得具有适合于酿酒酵母表达的不同选择标志的质粒，自pGV1380克隆出aceF插入物并克隆入pGV1105,产生pGV1604。为了在酿酒酵母中表达这些蛋白质，用pGV1334、pGV1603、和pGV1604的任意组合转化酿酒酵母菌4朱Gevo1187(CEN.PK)，并在适宜淘汰培养基(dropoutmedia)上选择转化体，正如实施例3中所描述的。作为对照，用相应的空载体即pGV1103、pGV1104、和pGV1105分别转化细胞。如下对自转化体培养得到的培养物测定LpdA、AceE、或AceF表达，即制备粗制酵母蛋白质提取物并通过Western印迹分析它们(基于检测每一种蛋白质中所存在的Myc表位)，正如实施例2中所描述的。实施例6:自基因组DNA克隆酿酒酵母PDH亚基，消除内源线粒体靶向序列的修饰，和它们在酿酒酵母细胞中的表达在大多数真核生物中，丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物定位在线粒体内部。右的氨基酸，包含PDH的各种蛋白质被引向进入线粒体。这样的序列的存在可通过实验或计算(例如通过程序MitoProt:http:〃mi。s.。sf.de/cqi-bin/proi/medqen/mitofilter)来测定。蛋白质成功车#入线#立体后发生特异性蛋白水解切割，靶向序列被消除，导致"经过切割的"输入形式。众所周知，通过遗传改变蛋白质的编码序列自该蛋白质消除这样的序列引起该蛋白质变得不能够移行入线粒体。如此，一种用于将正常情况中在线粒体中的蛋白质改向进入胞质溶胶的诱人策略牵涉只表达编码蛋白质在线粒体输入和后续蛋白酶切割之后剩余的"经过切割的"部分的那部分基因。此实施例的目的是描述构成酿酒酵母丙酮酸脱氢酶复合物的数种基因的克隆，及这些基因在酿酒酵母细胞培养物中的表达和检测。通过PCR克隆编码PDH各亚基的数种基因，其基本上使用实施例5中所描述的规程，只是模板是酿酒酵母基因组DNA。表l中显示了要扩增的酿酒酵母基因和所使用的相应引物。为了生成编码预测定位在胞质溶胶中的蛋白质的基因，每一对引物(表1中所列举的)中所列举的第一种引物设计成扩增每一种基因中预测编码线粒体把向序列的那部分下游的区域。使用用于扩增每一种基因的引物中所编码的独特限制酶位点，将所得PCR产物克隆入载体pGV1103,产生表2中所列举的质粒。对每一种插入物完整测序。为了测试每一种基因的表达，仅用pGV1381、pGV1383、pGV1384、或pGV1385中每一种转化酿酒酵母菌抹Gevo1187(CEN.PK)，其基本上遵循实施例3中所描述的规程，并在SC-his限定的淘汰培养基上选择HIS+菌落。通过溶胞物制备和和Western印迹(用以^r测每一种蛋白质中所存在的Myc标签)来测定蛋白质表达，正如实施例2中所描述的。实施例7:酿酒酵母亚基/:尸Z)i的克隆和表达及其在酿酒酵母细胞中的表达此实施例描述了如何通过PCR自酿酒酵母基因组DNA克隆基因丄尸D7，53及如何检测丄尸D7在宿主酿酒酵母细胞中的表达。在PCR反应中使用引物Gevo-658加Gevo-659扩增缺乏那些预测编码线粒体靶向序列的核香酸的Lpdl可读框，基本上如实施例5中所描述的。将1.5kb产物用^7zoI+SamM消化并克隆入经相同限制酶切割的pGVl103。将所得克隆pGVl103-lpdl转化入Gevol187并通过HIS+原养型来选择所得菌落，基本上如实施例3中所描述的。培养含有pGV1103-lpdl的细胞的培养物并如下检测丄尸D/表达，即收获细胞，接着是Western印迹(针对蛋白质上所存在的Myc标签)，基本上如实施例2中所描述的。实施例8:大肠杆菌PDH亚基的克隆及其在乳酸克鲁维酵母中的表达某些酵母，尤其是那些已知是"Crabtree阴性"，提供了作为生产宿主的独特优点。与在需氧条件下将过量葡萄糖发酵成乙醇的Crabtree阳性菌林(例如酿酒酵母)不同，Crabtree阴性菌抹(诸如克鲁维酵母属的那些)取而代之地会经TCA循环来代谢葡萄糖以生成生物质。因此，Crabtree阴性酵母耐受所谓的葡萄糖异化PDH旁路路径的灭活(例如通过删除/i7尸Z)C7基因)(在需氧生长期间)。以下实施例描述了如何将编码大肠杆菌PDH的三种亚基的基因克隆入适合于在酵母乳酸克鲁维酵母中表达的载体，以及还有如何检测那些基因的表达。如实施例5中所述PCR扩增大肠杆菌基因/;^4、ace五、和aceF。将所得PCR产物用&/1+^01消化并分别克隆入均经5"a/I+WoI切割的载体pGVl428、pGV1429、和pGV1430。这些步骤产生了质粒pGV1428-lpdA、pGV1429-aceE、和pGV1430-aceF。对每一种插入物完整测序。依照已知方法(例如KooistraR，HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)reaW.15;21(9):781-92)用这些质粒之一或任意组合转化乳酸克鲁维酵母菌种(例如Gevo1287),并通过适宜的原养型来选择所得菌落。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析(基于检测每一种蛋白质中所存在的Myc表位)对自转化体培养得到的培养物测定LpdA、AceE、或AceF表达。实施例9:过表达PDH亚基的细胞中PDH活性的测量此实施例的目的是描述如何通过体外测定法的手段来测量PDH活性。文献中记载了对细胞溶胞物中PDH活性定量的方法(WenzelTJ等(1992).￡wJ历oc/zew209(2):697-705)。此方法利用自富含线粒体的细胞级分衍生的溶胞物。此方法的一个不同实施方案利用自全细胞获得的细胞溶胞物作为PDH来源。此类溶胞物是如先前(实施例2)所述制备的。此测定方法的另一个实施方案使用自高度富含胞质(非线粒体)蛋白质的细胞级分衍生的细胞溶胞物。此生物化学分级会降低内源线粒体PDH在测定法中的贡献。制备此类富集溶胞物的方法是商品化的且本领域技术人员公知的(例如线粒体/胞质溶胶分级试剂盒，BioVision,Inc.,MountainView,CA)。在另一个实施方案中，借助一种或多种表达质粒中所编码的Myc表位标签的存在自细胞免疫纯化PDH活性。免疫纯化带表位标签的蛋白质的方法是本领域4支术人员公知的(例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,(1988)CSHLPress)。经过免疫纯化的PDH复合物如此有别于内源复合物并充当前述PDH体外测定法中的活性来源。实施例10:过表达PDH的细胞中增加的胞内乙酰-CoA的测量此实施例的目的是描述如何能在一群培养的酵母细胞中测量乙酰-CoA(即PDH的产物)的胞内水平。为了测量胞内乙酰-CoA,对那些携带表达整套PHD基因所必需的适宜质粒组合(例如pGV1334、pGV1603、和pGV1604)的酵母转化体评估细胞乙酰-CoA水平，与只含载体的对照转化体(例如pGV1103、pGV1104、和pGV1105)进行比较。在摇瓶中在适当限定的淘汰培养基(例如SC-His、-Leu、-Trp)中将酵母细胞培养至饱和。测定培养物的光密度(OD600)并通过以2800xg离心5分钟来沉淀细胞。使用珠式破碎仪(beadbeater)裂解细胞并将溶胞物用于使用已建立方法(Zhang等,ConnectionofPropionyl-CoAMetabolismtoPolyketideBiosynthesisinAspergillusnidulans.G認"cs,168:785-794)进行的蛋白质观'J定和乙酰-CoA测定分析。实施例ll:大肠杆菌PDH亚基基因和丁醇生成途径在酿酒酵母中的共表达此实施例的目的是描述如何在宿主酿酒酵母中与那些构成丁醇生成途径的基因一起共表达编码大肠杆菌PDH亚基的基因。与丁醇生成途径一起共表达PDH会相对于只表达丁醇途径而胞质溶胶中没有异源表达的功能性PDH提高所生成的丁醇的产率。将所克隆的基因、aceE和aceF(见实施例5)亚克隆入丁醇途径基因质粒，具体是pGV1208、pGV1209和pGV1213(表2)。为此，将pGV1334、pGV1603和pGV1604均用限制酶五co/C7I+^oI消化，并将所得释放的插入物连接入pGV1208、pGV1209和pGV1213，这些质粒经Bam/7I消化，用KlenowDNA聚合酶补平悬垂，然后经iol消化，所有这些操作均使用标准分子生物学方法(Sambrook，J.Fritsch，E.F.，Maniatis，T.,1989)。这些步骤分别产生了pGV1208-lpdA、pGV1209-aceE和pGV1213-aceF。将所得质粒与pGV1227—起转化入Gevoll87并选择HIS、LEU、TRP和URA原养型，所有操作基本上如实施例3中所描述的。使用经亲本质粒pGV1208加pGV1209加pVG1213加pGV1227转化的菌抹作为对照，用以评估PDH共表达对丁醇生成的影响。丁醇生成是如实施例4中所述实施的。正丁醇产率大于10%。实施例12:在厌氧条件下或在过量NADH条件下功能性的一种PDH形式的生成此实施例的目的是描述在厌氧下有活性的，或在存在相对于正常需氧生长期间所存在的比要高的[NADH]/[NAD+]比时有活性的突变型PDH的分离。这样的突变型PDH是想要的，因为它可容许甚至在^(敖需氧或厌氧条件下都有持续的PDH酶活性。先前(Kim，Y.等(2007).J;//.￡"v/raww.M/craZ/o/"73，1766-1771;美国专利申请No.11/949,724,完整收入本文)记载了获取和鉴定允许微需氧或厌氧活性的改变型式PDH的方法。实施例13:具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或没有丙酮酸脱羧酶活性的酿酒酵母菌林中大肠杆菌PDH亚基基因和丁醇生成途径的共表达此实施例的目的是描述如何在具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性或没有丙酮酸脱羧酶(PDC)的宿主酿酒酵母菌林中与构成丁醇生成途径的基因共表达编码大肠杆菌PDH亚基的基因。PDC和PDH二者利用并因此竟争可利用的丙酮酸池。尽管PDH的产物乙酰-CoA能直接被丁醇途径所利用，但是PDC的产物乙醛能被进一步还原成乙醇(经醇脱氢酶)，丁醇发酵的一种不想要的副产物，或者能经乙醛脱氬酶加乙酰-CoA合酶的协同作用被转化成乙酰-CoA。如此，降低或消除PDC活性会提高在胞质溶胶中还过表达功能性PDH的细胞中丙酮酸变成丁醇的产率。pdc-酿酒酵母菌抹的生成文献(例如Flikweert，M.T.等，(1996).ifea^15;12(3):247陽57;FlikweertMT等，(1999).F￡MSM/cra&o/丄e".l;174(l):73-9;vanMarisAJ等，(2004)^p/￡"v/rawM/cra&'o/.70(1):159-66)中记载了具有降低的PDC活性或没有PDC活性的酿酒酵母菌株，而且它们是本领域技术人员公知的。在一个实施方案中，缺乏所有PDC活性的酿酒酵母菌林具有基因型pdclApdc5Apdc6A。此类菌林缺乏可检测到的PDC活性，而且不能够在作为唯一碳源的葡萄糖上生长，但是能在生长培养基补充有作为替代碳源的乙醇或乙酸时存活。在另一个实施方案中，此菌林的衍生物已经进化成在葡萄糖上生长，葡萄糖是方便且常用的碳源。具有大大降低的PDC活性的菌林的第三个实施方案是有关基因型pdc2A的菌林，在文献(FlikweertMT等，(1999).所o&c/wo/66(1):42-50)中也有记载。任何这些菌株均能充当PDH加丁醇途径表达的有用宿主。在必要时，可以通过标准分子生物学手段和酵母遗传技术来工程化改造任何pdc-突变抹，使得那些营养缺陷型标志可利用，使得能选择质粒pGV1208-lpdA、pGV1209-aceE、和pGV1213-aceF并在宿主细胞中稳定维持。此类遗传工程会通过破坏有关内源基因来发生，其通过基于[7/M3的破坏盒，及后续通过FOA反选择来消除L^43标志来实施。过表达PDH的pdc-菌抹中的丁醇生成将所克隆的基因/pW、ace五和aceF(见实施例5)亚克隆入丁醇途径基因质粒，具体是pGV1208、pGV1209和pGV1213(表2)，基本上如实施例ll中所描述的。将质粒组pGV1208-lpdA加pGV1209-aceE加pGV1213-aceF加pGV1227、或作为对照的组pGV1208加pGV1209加pGV1213加pGV1227转化入适宜的pdc-酵母突变林并在液体培养物中培养所得菌落。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于50%。有可能的是，具有降低的PDC活性或没有PDC活性的菌林会展现出显著的生长缺陷，并因此可能不得不补充另外的碳源(例如乙酸或乙醇)。因为pdc-酿酒酵母中的生长缺陷源自它们胞质乙酰-CoA池的缺失，所以预期PDH在胞57复可充当胞质溶胶中PDH活性的有用体内读出。实施例14:酿酒酵母中的pfl(丙酮酸曱酸裂合酶)和FDHl(甲酸脱氢酶)表达大肠杆菌/7yw(无活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p/M(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)的克隆为了克隆大肠杆菌p/L5和;/L4,分别使用大肠杆菌基因组DNA和pflB—forw、PflB—rev和PflA—forw、PflA—rev引物扩增基因。为了克隆博伊丁氏假丝酵母尸D///(OkFDZ/7)基因，与fdh一forw和fdh—rev引物一起使用博伊丁氏假丝酵母的基因组DNA。利用分别掺入正向和反向基因扩增引物的限制性位点5^/I和五coRI，将所扩增的DNA连接到经Sa/I和五coiI消化的pGV1103、pGV1104和pGV1102上，产生pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl。自所得质粒表达的蛋白质分别带myc、myc和HA标签。利用所得质粒(pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl)和载体(pGV1103、pGV1104和pGV1102)来转化酵母菌抹Gevo1187，如实施例3所指出的，以生成表达PflA、PflB、Fdhl(PFL+)的转化体和对照(PFL-)转化体。通过HIS、TRP和URA原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对所得转化体评估PflA、PflB和Cb-Fdhl表达。对那些被证实表达所有三种蛋白质的酵母转化体评估细胞乙酰-CoA水平，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，以摇瓶形式在Sc-ura,his，trp培养基中培养PFL+和PFL-细胞。测定培养物的光密度(OD600)并通过以2800xrcf离心5分钟来沉淀细胞。使用珠式破碎仪裂解细胞并将溶胞物用于使用已建立方法(Zhang等,ConnectionofPropionyl-CoAMetabolismtoPolyketideBiosynthesisinAspergillusnidulans.GWe"'cs,168:785-794)进行的蛋白质测定和乙酰-CoA测定分析。评估每mg细胞总蛋白质的乙酰-CoA量。为了评估PflA、PflB和Fdhl表达对正丁醇生成的影响，将p/L4、//75和C6-FD7/7亚克隆入含有pGV1208、pGV1209和pGV1213的丁醇途径基因(表1)。为此，使用标准分子生物学方法(Sambrook,J.Fritsch,E.F.，Maniatis，T.,1989)，将pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl用Eco/C7I+^zoI限制58酶消化并连接入经Saw/7I(随后用Klenow补平末端)+^7zoI消化的pGVU08、pGV1209和pGV1213以生成pGV1208PflA、pGV1209PflB和pGV1213Fdhl。将所得质粒与pGV1227—起转化入Gevoll87并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和Gevollll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。实施例15:具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或没有丙酮酸脱羧酶活性的酿酒酵母中的PflA、PflB和Fdhl表达如实施例14中所述进行大肠杆菌;/75(无活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和pyi4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)和O)-F￡>///的克隆。利用所得质粒(pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdh1)和载体(pGV1103、pGV1104和pGV1102)来转化酿酒酵母(有关基因型wra3、^7、A&3、/ew2、/7dc7、/&5、；t/c6)酵母菌抹，如实施例3所指出的，以生成表达PflA、PflB、Cb-Fdhl的(PFL+)转化体和对照(PFL-)转化体。通过HIS、TRP和URA原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对所得转化体评估PflA、PflB和Fdhl表达。如实施例14中所述，对那些被证实表达所有三种蛋白质的酵母转化体评估细胞乙酰-CoA水平，与只含载体的对照转化体进行比较。为了评估表达PflA、PflB和Fdhl对正丁醇生成的影响，将pGV1208PflAl、pGV1209PflB和pGV1213Fdh1与pGV1227—起转化入酿酒酵母(MATA、腦3、trpl、his3、leu2、pdcl、pdc5、pdc6)并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于50%。实施例16:具有降低的^lD^/活性或没有^Dfl7活性的酿酒酵母中的Pfl和Fdhl表达大肠杆菌/7j^(无活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和;乂L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)的克隆如实施例14中所述进行大肠杆菌;/B(无活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p/L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)和C6-FZ)/7/的克隆。如实施例3中所迷，利用所得质粒(pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl)和载体(pGVl103、pGV1104和pGVl102)来转化酵母菌林Gevo1253(adhlA)以生成表达PflA、PflB、Fdhl的(PFL+)转化体和对照(PFL-)转化体。通过HIS、TRP和URA原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对所得转化体评估PflA、PflB和Fdhl表达。如实施例14中所述对那些被证实表达所有三种蛋白质的酵母转化体评估细胞乙酰-CoA水平，与只含载体的对照转化体进行比较。为了评估过表达PflA、PflB和Fdhl对正丁醇生成的影响，将pGV1208PflA、pGV1209PflB和pGV1213Fdhl与pGV1227—起转化入Gevol253并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。实施例17:自酿酒酵母克隆尸Z)C7基因及其在酿酒酵母中的过表达此实施例的目的是描述在组成性有活性的启动子控制下克隆编码丙酮酸脱羧酶的基因，及描述这样的基因在酿酒酵母宿主细胞中的表达。在基本上如实施例5中所述实施的PCR反应中使用引物Gevo-639加Gevo-640自酿酒酵母基因组DNA扩增完整PDC7ORF。将所得1.7kb产物用A72oI+5am//1消化并连接入经切割的载体pGVl106,产生pGV1389(见表2)。将插入物完整测序。为了在酿酒酵母中过表达Pdcl,用pGV1389转化酿酒酵母菌林Gevo1187(CEN.PK)并在SC-ura淘汰培养基上选择转化体，如实施例3中所描迷的。使用粗制酵母蛋白质提取物和Westem印迹分析(基于对重组表达蛋白质中所存在的Myc表位的检测)对自转化体培养得到的培养物测定Pdcl表达，如实施例2中所描述的。实施例18:克隆以容许丙酮酸脱羧酶基因的诱导型表达基因(例如丙酮酸脱羧酶)的組成性表达在培养物生长期间的某些点可能是不想要的，或可能对那些过表达细胞施加意外代谢或选择压力。如此，需要釆用基因表达受调节的'系统，由此感兴趣基因可主要在最佳时间表达以使培养物生长以及在后续发酵中的性能最大化。60此实施例的目的是描述在可诱导调节的启动子控制下克隆编码丙酮酸脱羧酶的基因，及描述这样的基因在酿酒酵母宿主细胞中的表达。作为^Z^I+5am別片段释放pGV1389(见实施例19)中所存在的户DC7ORF并克隆入经JwII+5am别消化的载体pGV1414，产生载体pGV1483。如此，驱动尸ZX7基因的表达。M五:n启动子在存在曱硫氨酸时在转录方面是沉默的，但是在曱硫氨酸水平落到某阔值以下时变得有活性。将质粒pGV1483转化入Gevol187并通过SC-ura培养基上的选择来鉴定转化体，如实施例3中所描述的。培养携带pGV1483的Gevoll87的培养物并测定PDCl表达，基本上如实施例2中所描述的。在此实施例的另一个实施方案中，尸DC7基因在酿酒酵母铜诱导的CM3/基因启动子(SEQIDNO:178)控制下表达。首先，在基本上如实施例5中所述的反应中使用引物通过PCR自酿酒酵母基因组DNA扩增Cf/尸/基因启动子。将PCR产物用消化并插入经fecI+5""/1切割的pGVl106,产生pGV1388。对所插入的Ct/尸7启动子序列完整测序。接着，将来自pGV1389、含有尸DC7基因的^&dKSa/77/7I片段插入经Jwn+BamM消化的pGV1388，产生pGV1388-PDCl。将质粒pGV1388-PDCl转化入Gevo1187，如实施例3中所描述的，并在缺少铜的SC-ura限定培养基上鉴定转化体。在没有补充铜的SC-ura培养基中培养转化细胞的培养物，直至它们达到OD600〉0.5,那时添加硫酸铜至终浓度0.5mM。将培养物根据需要再培养24小时至48小时，然后通过Western印迹测定Pdc1表达，基本上如实施例2中所描述的。实施例19:测量过表达丙酮酸脱羧酶的酵母细胞的培养物中所生成的PDC活性的体外测定法此实施例的目的是描述对于测定细胞(特别是来自过表达PDC酶的一群细胞)中所存在的总丙酮酸脱羧酶活性有用的体外测定法。用于测量来自总细胞溶胞物的PDC活性的测定法已有记载而且是本领域技术人员公知的(MaitraPK和LoboZ.1971.JAo/C/2e附.25;246(2):475-88;SchmittHD和ZimmermannFK.1982.J5acfenV/.151(3):1146-52;Eberhardt等，(1999)五w5/oc/2ew.262(1)，191-201)。在此实施例的另一个实施方案中，如下测量通过如实施例17和18中所述表达PDC所生成的PDC活性，即首先使用针对PDC的特异性抗体或使用针对如实施例RF20和RF21中所表达的过表达的(但不是内源的)PDC中所存在的Myc表位标签的抗体免疫沉淀PDC。用于特异性免疫沉淀复合物混合物中所存在的蛋白质的方法是本领域技术人员公知的(例如Harlow和Lane，1988，Antibodies:ALaboratoryManual,CSHLPress)。然后免疫沉淀的PDC复合物充当要使用前述测定法测定的材料的来源。此方法如此容许异源的、过表达的PDC的特异性测定。实施例20:还含有功能性丁醇生成途径的酿酒酵母中PDC过表达引起的升高的丁醇生产率此实施例的目的是例示PDC过表达如何提高还表达丁醇生成途径的酿酒酵母培养物中的丁醇生产率。过表达PDC基因的酿酒酵母菌抹先前已有记载(vanHoek等，(1998).々少/五"w'rawM/cra6/o/.64(6):2133-40)。这些实验揭示了(l)酉良酒酵母中的内源PDC水平虽然占总细胞蛋白质的高达3.4%，仍能通过过表达构建体的存在而进一步提高；和(2)处于高生长速率的过表达PDC的培养物的发酵能力(乙醇生成的最大比速率)相对于对照菌抹升高。这些结果提示PDC在某些生长条件下的过表达会提高经由异源提供的丁醇生成途径的通量。为了在存在丁醇途径的情况中过表达PDC基因，通过&el消化自pGV1389切出尸DC7基因，用KlenowDNA聚合酶片段将切出的DNA悬垂补平，然后用^7zoI消化载体。将片段插入pGV1213(此载体经Sam/n消化，用Klenow酶补平切过的末端，然后用^7zoI消化)，产生质粒pGV1605。将质粒pGV1605或pGV1057(Mumberg,D.，等(1995)156:119-122)与质粒pGV1208、pGV1209、和pGV1213—起转化入Gevo1187，基本上如实施例3中所述，并选择His、Leu、Trp、和Ura原养型。实施发酵以生成丁醇，如实施例4中所述测量。包含pGV1605导致比前述发酵中包含pGV1057及质粒pGV1208、pGV1209、和pGV1213更高的丁醇生产率(每单位时间所生成的丁醇量)。正丁醇产率大于5%。实施例21:具有降低的醇脱氢酶活性且还含有功能性丁醇生成途径的酿酒酵母细胞中PDCit^达引起的升高的丁醇生产率此实施例的目的是演示如何通过在醇脱氬酶(ADH)活性缺陷的酵母菌抹中在存在丁醇生成途径的情况中过表达PDC基因来获得增强的丁醇生产率。由PDC自丙酮酸生成的乙醛有两种主要命运它能通过乙醛脱氢酶和乙酰-CoA合酶的作用被进一步代谢成乙酰-CoA，它然后可以作为丁醇合成途径的有用底物；或者，它能通过醇脱氢酶(ADH)的作用通过还原过程被进一步代谢成乙醇。因此，降低或消除ADH(尤其是那些偏爱乙醛的ADH酶)会降低或消除这种不想要的乙醛异化路径并提高丁醇途径可利用的乙酰-CoA池。同时将质粒pGV1208、pGV1209、pGV1213、和pGV1605共转化入菌抹Gevoll87(其具有有关基因型^D/77+)或菌林Gevol266(其具有有关基因型a^/zJ)。对转化菌落选择His、Leu、Trp、和Ura原养型，基本上如实施例3中所描述的。实施发酵以生成丁醇，如实施例4中所述测量。正丁醇产率大于10%。菌林Gevol266(^/WJ)展现出比在菌抹06"01187(^0///+)中实施的平行发酵改善的丁醇产率。实施例22:具有降低的醇脱氢酶活性且表达功能性丁醇生成途径的乳酸克鲁维酵母细胞中PDC过表达引起的升高的丁醇产率此实施例的目的是描述具有大大降低的ADH活性或没有ADH活性的乳酸克鲁维酵母菌抹中的丁醇生成。预测这样的菌抹中表达丁醇途径会产生比在具有ADH活性的菌林中表达丁醇途径显著更大的丁醇产率每输入葡萄糖。具有降低的醇脱氢酶活性的乳酸克鲁维酵母菌林的生成。用选择标志替换功能性可读框，接着后续消除标志)先前已有记载(KooistraR，HooykaasPJ，SteensmaHY.(2004)15;21(9):781-92)。乳酸克鲁维酵母具有四种编码ADH酶的基因，其中两种(即/1^4/)//7和^14/)//2)定位于胞质。文献(Saliola,M.,等,(1994)肠f10(9):1133-40)中已经记载了删除了这所有四地i养这种菌抹所要求的培养条件。这种办法的一种备选型式采用赋予对药物G418/遗传霉素(geneticin)的抗性的标志，例如如kanj^因所提供的。这样的办法是有用的，因为它留下WM3标志可供用作后'续转化中的选择标志。乳酸克鲁维酵母adhG菌林中丁醇表达途径的表达同时将质粒pGV1208、pGV1209、pGV1213、和pGV1605共转化入菌抹Gevol287(其是ADH+)或adhG菌抹。对转化菌落选择His、Leu、Trp、和Ura原养型。实施发酵以生成丁醇，如实施例4中所述测量。正丁醇产率大于10%。菌抹Gevol287生成比在其它方面同基因的adhG菌抹中实施的平行发酵显著更多的丁醇。实施例23:酿酒酵母中的/^Z)6it^达为了克隆酿酒酵母的爿丄D6基因，采用两步融合PCR法，其消除内部Sa/1限制酶位点以便于后续分子生物学操作。使用引物对Gevo-643+Gevo-644和Gevo-645+Gevo-646及作为模板的酿酒酵母基因组DNA生成跨越酿酒酵母y!LD6基因序列的两种交叠PCR产物。用Sa/I+^w7M消化所得PCR片段并连接入经类似限制性消化的pGV1105和pGV1101以生成pGV1321和pGV1326。随后，亚克隆y!LD6，即用五co/CRI+WoI消化pGV1321和pGV1326并分别连接入BamM(并随后用Klenow补平末端)+Wo1消化的pGV1209和pGV1208以生成pGV1339和pGV1399。来转化酵母菌林Gevo1187，如实施例3中所描述的，以生成过表达^丄D6的("Ald6+，，)转化体或对照转化体。通过在适宜淘汰培养基中选择TRP和LEU原养型来选择这两组转化体。使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对所得转化体评估Ald6表达，如实施例2中所描述的。对那些被证实表达Ald6蛋白的酵母转化体评估增强的乙醛脱氢酶活性，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，在摇瓶中在适宜的淘汰培养基中培养Ald6+和对照细胞。测定培养物的光密度(OD600)并通过以2800xg离心5分钟来沉淀细胞。使用珠式破碎仪裂解细胞并将溶胞物用于使用已建立方法(例如VanUrk等，5/oc/n'm.所o;/2;as.Jcto.191:769)进行的蛋白质测定和醛脱氢酶活性分析。为了评估过表达Ald6对正丁醇生成的影响，将pGV1339与pGV1208、pGV1227和pGV1213—起转化入Gevoll87并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于5%。实施例24:没有醇脱氢酶I活性(flrf/^J)的酿酒酵母中的Ald6过表达如实施例23中所述实施^LD6基因的克隆。如实施例3中所述分别利用所得质粒(pGVl339和pGVl399)和载体(pGV1100和pGV1101)来转化酵母菌林Gevol253以生成过表达Ald6+的转化体和对照转化体。在适宜的淘汰培养基上选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对所得转化体评估Ald6表达。如实施例23中所述对那些被证实表达Ald6蛋白的酵母转化体评估增强的乙醛脱氢酶活性。为了评估过表达对正丁醇生成的后果，将pGV1339与pGV1209、pGV1227和pGV1213—起转化入Gevol253并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。实施例25:乙酰-CoA合酶基因在酿酒酵母中的过表达此实施例的目的是描述编码乙酰-CoA合酶活性的基因的克隆，及这样的基因在宿主酿酒酵母细胞中的表达。具体而言，酿酒酵母基因」CS7或JCS2任一或二者编码乙酰-CoA合酶活性。为了克隆爿C^和^CS2基因，利用作为模板的酿酒酵母基因组DNA，及引物Gevo-479+Gevo-480(v4CW)和Gevo-483+Gevo-48404CS2)，每一组分别在正向和反向引物中含有5"a/I和BamT/I限制性位点。将所得PCR片段用Sfl/I+5am/ZI消化并连接入经类似限制性消化的pGV1101和pGV1102以生成pGV1262和pGV1263。随后，亚克隆JCW和^C&,即用五co/CRI+WoI消化pGV1262和pGV1263并连接入经BawM(且随后用Klenwo补平末端)+Wo1消化的pGV1213以生成pGV1319和pGV1320。如实施例3中所述分别利用所得质粒pGV1262和pGV1263及载体pGV1101和pGV1102来转化酵母菌抹Gevo1187以生成过表达」、^的转化体和对照转化体。通过LEU、URA原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对转化体评估Acsl或Acs2表达。65对那些被证实表达Acsl或Acs2蛋白的酵母转化体评估增强的乙酰-CoA合酶活性，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，以摇瓶型式在SC-LEU、URA培养基中培养ACS1+或ACS2+和对照细胞。测定培养物的光密度(OD600)并通过以2800xrcf离心5分钟来沉淀细胞。使用珠式破碎仪裂解细胞并将溶胞物用于使用已建立方法(VanUrk等，所ocWm.所o//^.爿cto191:769)进行的蛋白质测定和乙酰-CoA合酶活性分析。为了评估Acsl或Acs2过表达对正丁醇生成的影响，将pGV1319和1320与pGV1208、pGV1209和pGV1227—起转化入Gevoll87并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于5%。实施例26:没有醇脱氢酶I活性(fl^/力的酿酒酵母细胞中乙酰-CoA合酶的#达如实施例25中所述克隆酿酒酵母的JCW和^CS2基因。如实施例3中所述分别利用所得质粒pGV1262和pGV1263及载体pGV1101和pGV1102来转化酵母菌林Gevol253以生成过表达ACSl+、ACS2+的转化体和对照转化体。通过LEU、URA原养型选择来选择这两组转化体。如实施例25中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对转化体评估Acsl或Acs2表达。如实施例26中所述对那些被证实表达Acsl或Acs2蛋白的酵母转化体评估增强的乙酰-CoA合酶活性。为了评估过表达Acsl或Acs2对丁醇生成的影响，将pGV1319和1320与pGV1208、pGV1209和pGV1227—起转化入Gevol253并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于5%。实施例27:爿丄ZM、^CW和JCS7在酿酒酵母中的it^达如实施例23和25中所述克隆」LD(5、^C^和^C^基因。载体pGVl105和pGVl102来转化酵母菌林Gevol187以生成过表达ALD6+ACSl+、ALD6+ACS2+的转化体和对照转化体。通过LEU和URA原66养型选择来选择这两组转化体。对转化体ALD6+ACSl+和ALD6+ACS2+评估增强的乙酰-CoA合酶活性，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，如实施例25中所述以摇瓶型式在SC-LEU、URA培养基中培养ALD6+ACSl+、ALD6+ACS2+和对照细胞。为了评估Ald6加Acs1或Acs2的过表达如何导致更高的丁醇生成，将Gevo1187用pGV1208、pGV1339、pGV1227和pGV1319或1320转化并选4奪His、Leu、Trp和Ura原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述评估丁醇生成。正丁醇产率大于5%。实施例28:没有醇脱氢酶I活性(adhlA)的酿酒酵母中的^丄ZM加^CS/或y4C52过表达如实施例23和25中所述克隆」丄D(5、^GS/和爿GS2基因。载体pGV1105和pGV1102来转化酵母菌林Gevo1253(AADH1)以生成过表达ALD6+ACSl+或ALD6+ACS2+的菌抹或对照转化体。通过LEU和URA原养型选择来选择这两组转化体。对转化体ALD6+ACSl+或ALD6+ACS2+评估增强的乙酰-CoA合酶活性，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，如实施例25中所述以摇瓶型式在SC-LEU、URA培养基中培养ALD6+ACSl+或ALD6+ACS2+和对照细胞。为了评估过表达S^X)(5和JCS7或^CS7对丁醇生成的影响，将Gevo1253用pGV1208、pGV1339、pGV1227和pGV1319或1320转化并选择HIS、LEU、TRP和URA原养型。使用GevolllO和llll作为对照隔离群(表l)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。实施例29:将丁醇途径克隆入用于在克鲁维酵母属的酵母中进行表达的栽体为了将丁醇途径基因克隆入适合于在菌林乳酸克鲁维酵母中进行表达的载体，通过5^cI和7Vort限制性消化自pGV1208、pGV1209和pGV1227释放hbd、Crt、Thl+TER并克隆入经类似消化的pGV1428、1429和1430以生成pGV1208KI、pGV1209KI和pGV1227KI。为了将ADHE2克隆入乳酸克鲁维酵母，将pGV1213用MwI和&cI消化并连接入经类似消化的pGV1431以生成pGV1213KI。将所得质粒pGV1208KI、pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI转化入乳酸克鲁维酵母(菌抹Gevol287;有关基因型MATa、trpl、his3、leu2、ura3)并对转化体选择TRP、HIS、LEU和URA原养型(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)reaW.15;21(9):781-92)。如实施例4中所述实施丁醇生成。实施例30:丙酮酸曱酸裂合酶和曱酸脱氢酶I在乳酸克鲁维酵母中的表达大肠杆菌/yw(无活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p/L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)的克隆为了克隆大肠杆菌//7万和//L4,分别使用大肠杆菌基因组DNA和pflB_forw、PflB—rev和PflA—forw、PflA—rev引物扩增基因。为了克隆博伊丁氏假丝酵母FZ)/77基因，在PCR^应中使用作为模板的博伊丁氏假丝酵母的基因组DNA及fdh—forw和fdh—rev引物。利用分别掺入正向和反向基因扩增引物的限制性位点&ZI和五coRI，将所扩增的DNA连接到经Sa/I和五coRI消化的pGV1428、pGV1429和pGV1430上，生成pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl。自所得质粒表达的蛋白质带myc标签，用以进行蛋白质表达研究。通过已知方法(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)Ko^.15;21(9):781-92)利用所得质粒(pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl)和载体(pGV1428、pGV1429和pGV1430)来转化酵母菌林乳酸克鲁维酵母(Gevol287;有关基因型MatA、trpl、his3、leu2和ura3)以生成表达PflA、PflB、Cb-Fdhl的(PFL+)转化体和对照(PFL-)转化体。通过HIS、TRP和LEU原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Westem印迹分析对所得转化体评估PflA、PflB和Fdhl表达。对那些被证实表达所有三种蛋白质的酵母转化体评估细胞乙酰-CoA水平，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，以摇瓶型式在SC-LEU、HIS、TRP培养基中培养PFL+和PFL-细胞。测定培养物的光密度(OD600)并以2800xrcf离心5分钟以沉淀细胞。使用珠式破碎仪裂解细胞并将溶胞物用于使用已建立方法(Zhang等,ConnectionofPropionyl-CoAMetabolismto68PolyketideBiosynthesisinAspergillusnidulans.GewWcs,168:785-794沐行的蛋白质测定和乙酰-CoA测定分析。评估每mg细胞总蛋白质的乙酰-CoA量。为了评估PflA、PflB和Fdhl表达对丁醇生成的影响，将pflA、pflB和Cb-FD/Z/亚克隆入含有pGV1208KI、pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI的丁醇途径基因(表l)。为此，使用标准分子生物学方法(Sambrook，J.Fritsch，E.F.，Maniatis，T.,1989),将pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1002fdhl用五co/CRI+^zoI限制酶消化并连接入经BamM(随后用Klenow补平末端)十IoI消化的pGV1208KI、pGV1209KI和pGV1213KI以生成pGV1208KIPflA、pGV1209KIPflB和pGV1213KIFdhl。将所得质粒与pGV1227KI—起转化入乳酸克鲁维酵母菌抹(MATa、pdcl、trpl、his3、leu2ura3)并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用包含pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431的乳酸克鲁维酵母转化体作为对照隔离群。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。实施例31:丙酮酸甲酸裂合酶和曱酸脱氬酶I在缺乏丙酮酸脱羧酶活性的乳酸克鲁维酵母中的表达如实施例30中所述克隆大肠杆菌;/W(无活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p乂L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)C6-FD///。通过已知方法(KooistraR，HooykaasPJ，SteensmaHY.(2004)^as.15;21(9):781-92)利用所得质粒(pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl)和载体(pGV1428、pGV1429和pGV1430)来转化酵母菌抹乳酸克鲁维酵母(MatA、pdcl、trpl、his3、leu2和ura3)以生成PflA、PflB、Cb-Fdhl的(PFL+)转化体和对照(PFL-)转化体。通过HIS、TRP和LEU原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对所得转化体评估PflA、PflB和Cb-Fdhl表达。对那些被证实表达所有三种蛋白质的酵母转化体评估细胞乙酰-CoA水平，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，如实施例30中所述以摇瓶型式在SC-LEU、HIS、TRP培养基中培养PFL+和PFL-细胞并评估。为了评估PflA、PflB和Fdhl的表达如何导致更高的丁醇生成，将pGV1208KIPflA、pGV1209KIPflB和pGV1213KIFdh1与pGV1227KI—起转化入乳酸克鲁维酵母(MATa、pddA、trpl、his3、leu2、ura3)并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用包含pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431的乳酸克鲁维酵母转化体作为对照隔离群。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于50%。实施例32:Pfl(丙酮酸曱酸裂合酶)和Fdhl(曱酸脱氬酶I)在缺乏Adhl活性的乳酸克鲁维酵母中的表达如实施例30中所述克隆大肠杆菌//^(无活性的丙酮酸曱酸裂合酶)、p/L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)和C6-FD//7。通过已知方法(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)^as.15;21(9):781-92)利用所得质粒(pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl)和载体(pGV1428、pGV1429和pGV1430)来转化酵母菌抹乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、Leu2、ura3)以生成表达PflA、PflBl、Fdhl的(EcPFL+)转化体和对照(EcPFL-)转化体。通过HIS、TRP和LEU原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对所得转化体评估PflA、PflB和Fdhl表达。对那些被证实表达所有三种蛋白质的酵母转化体评估细胞乙酰-CoA水平，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，如实施例30中所述以摇瓶型式在SC-LEU、HIS、TRP培养基中培养EcPFL+和EcPFL-细胞并评估。为了评估PflA、PflB和Fdhl的表达如何导致更高的丁醇生成，将pGV1208KIPflA、pGV1209KIPflB和pGV1213KIFdh1与pGV1227KI—起转化入乳酸克鲁维酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、ura3)并选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用包含pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431的乳酸克鲁维酵母转化体作为对照隔离群。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于20%。实施例33:AL4ZJ)6在乳酸克鲁维酵母中的过表达为了克隆《/」丄/)6，在PCR反应中使用作为模板的乳酸克鲁维酵母基因组DNA及引物KI4丄D6Jeft5和ii^4丄D(5一right3(见表l),其它方面与实施例5中所述类似。前述引物分别包含S"/I和^W7/7I限制性位点，将所得PCR片段用Sa/I+Bam/H消化并连接入经类似限制性消化的pGV1428以生成pGV1428KLALD6。随后，亚克隆XL4LD6,即将pGV1428ALD6用￡co/CRI+ioI消化并连接入经5aw//1(随后用Klenow补平末端)+^7zo1消化的pGV1208KI以生成pGV1208KIALD6。通过已知方法(KooistraR，HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)7eo^.15;21(9):781-92)分别利用所得质粒pGV1428ALD6KI和载体pGV1428来转化酵母菌株乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)以生成过表达KIALD6+和KIALD6-的转化体和对照转化体。通过HIS原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Westem印迹分析对所得转化体KIALD6+和KIALD6-评估KIAld6表达。对那些被证实过表达KIAld6蛋白的乳酸克鲁维酵母转化体评估增强的乙醛脱氬酶活性，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，如实施例23中所述以摇瓶型式在SC-HIS培养基中培养KIALD6+和KIALD6-细胞并评估。为了评估KIALD6的过表达如何导致更高的丁醇生成，将pGV1208KIALD6与pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI—起转化入乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)并选择HIS、LEU、TRP和URA原养型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431转化乳酸克鲁维酵母产生的转化体作为对照隔离群。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于5%。实施例34:醛脱氢酶在缺乏Adhl活性的乳酸克鲁维酵母中的过表达实施例33中记载了克鲁维酵母KIALD6基因的克隆。通过已知方法(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)FeaW.母菌抹乳酸克鲁维酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、ura3)以生成过表达KIALD6+和KIALD6-的转化体和对照转化体。通过HIS原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Westem印迹分析对所得转化体评估KIAld6表达。如实施例30中所述对那些被证实表达KIAld6蛋白质的乳酸克鲁维酵母转化体评估增强的乙醛脱氢酶活性。为了评估KIAld6的过表达如何导致更高的丁醇生成，将pGV1208KIALD6与pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI—起转化入乳酸克鲁维酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、ura3)并选择HIS、LEU、TRP和URA原养型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431转化乳酸克鲁维酵母产生的转化体作为对照隔离群。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。实施例35:乙酰-CoA合酶基因在酵母乳酸克鲁维酵母中的it^达酵母乳酸克鲁维酵母基因组中的两种侧向同源基因(即尺Z4CS/和^L4CS刁编码乙酰-CoA活性。为了克隆AX4C57和/^4GS2,利用作为模板的乳酸克鲁维酵母基因组DNA及引物KIACS1—left5+KIACS2—Right3(ACSl)和KIACS2—Left5+KIACS2—Right3(ACS2)(见表l)，其分别在正向和反向引物中含有7VM+S"/I和Sa/1+jgam/ZI限制性位点。将所得PCR片段用适宜酶消化并连接入经类似限制性消化的pGV1429和pGV1431以生成pGV1429ACS1和pGV1431ACS2。随后，亚克隆XL4CS/和XL4C^2，即将pGV1429ACSl和pGV1431ACS2用Sacld和消化并连接入经类似消化的pGV1209KI和pGV1213KI以生成pGV1209KIACS1和pGVKIACS2。体pGV1429和pGV1431来转化乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)以生成过表达KIACSl+、KIACS2+和KIACS-蛋白的转化体和对照转化体。通过TRP、URA原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对转化体评估KIAcsl和KIAcs2表达。对那些被证实表达KIAcsl和KIAcs2蛋白的酵母转化体评估增强的乙酰-CoA合酶活性，与只含载体的对照转化体进行比较。为此，如实施例25中所述以摇瓶型式在SC-TRP、URA培养基中培养KIACSl+、KIACS2+和KIACS-细胞并评估。为了评估KIACS1和KIACS2的过表达如何导致更高的丁醇生成，将入菌抹Gevol287并对转化细胞选择His、Leu、Trp和Ura原养型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431转化乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、leu2、um3)产生的转化体作为对照隔离群。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于5%。实施例36:乙酰-CoA合酶基因在缺乏Adhl活性的酵母乳酸克鲁维酵母中的过表达实施例35中记载了乳酸克鲁维酵母/i^4CS7和ia4C52基因的克隆。通过已知方法利用所得质粒pGV1429ACSl和pGV1431ACS2及空载体pGV1429和pGV1431来转化乳酸克鲁维酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、1^3)以生成过表达/040^/+和^04(^2+的转化体和对照转化体。通过TRP和URA原养型选择来选择这两组转化体。如实施例2中所述使用粗制酵母蛋白质提取物和Western印迹分析对转化体评估KIAcsl和KIAcs2表达。如实施例25中所述对那些被证实表达KlAcsl和KIAcs2蛋白的酵母转化体评估增强的乙酰-CoA合酶活性。为了评估^/^CW和XZ4CS2的过表达如何导致更高的丁醇生成，将pGV1209KIACSl和pGV1209KIACS2与pGV1208KI和pGV1227KI—起转化入乳酸克鲁维酵母(MatA、adhl、trpl、his3、leu2和ura3)。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。实施例37:《"丄2)6和^^40^或^//4(:^在乳克鲁维氏酵母中的过表达如上文实施例33和35中所述克隆XL4ZZ)6、尺L4CS/和/i^4GS7基因。通过已知方法分别利用所得质粒pGV1428ALD6和pGV1429ACSl或pGV1430及载体pGV1428和pGV1429或pGV1430来转化乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)以生成过表达KIALD6+KIACS1+、KIALD6+KIACS2+和KIALD-KIACS-的转化体和对照转化体。分别通过HIS、TRP和HIS、LEU原养型选择来选择这两组转化体。对转化体KIALD6+KIACSl+和KIALD6+KIACS2+评估增强的乙酰-CoA合酶活性，与只含载体的对照转化体(ALD-ACS-)进行比较。为此，如实施例25中所述以摇瓶型式分别在SC-HIS、TRP和HIS、LEU培养基中培养KIALD6+KIACSl+、KIALD6+KIACS2+和KIALD-KIACS-细胞并评估。为了评估KIAld6和KIAcs1或KIAcs2的过表达如何导致更高的丁醇生成，73将乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、leu2ura3)用pGV1208KIALD6、pGV1209KIACSl或pGV1209KIACS2、pGV1227KI、pGV1213KI转化并选择HIS、LEU、TRP和URA原养型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431转化乳酸克鲁维酵母(MATa、trpl、his3、leu2ura3)产生的转化体作为对照隔离群。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于5%。实施例38:AL4丄D6、兀"CW和AL4CS2在缺乏KIAdhl活性(KladhlA)的乳酸克鲁维酵母中的过表达如实施例33和35中所述克隆/J^LD6、AZ4GS/和XL4CS2基因。通过已知方法分别利用所得质粒pGV1428ALD6和pGV1429ACS1或母(MATa、KladhlAtrpl、his3、leu2ura3)以生成过表达KIALD6+KIACSl+、KIALD6+KIACS2+和KIALD-KIACS-的转化体和对照转化体。分别通过HIS、TRP和HIS、LEU原养型选择来选4奪这两组转化体。如实施例14中所述对转化体KIALD6+KIACS1十和KIALD6+KIACS2+评估细胞乙酰-CoA水平。为了评估KIAld6和KIAcs1或KIAcs2的过表达是否导致更高的丁醇生成，将乳酸克鲁维酵母(MATa、KladhlAtrpl、his3、leu2ura3)用pGV1208KIALD6、pGV1209KIACSl或pGV1209KIACS2、pGV1227KI、pGV1213KI转化。如实施例4中所述实施丁醇生成。正丁醇产率大于10%。权利要求1.一种代谢工程化酵母，其能够代谢碳源以生成正丁醇，至少一种途径配置成生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量，且至少一种异源基因编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶。2.权利要求l的酵母，其中所述至少一种异源基因单独地编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶。3.权利要求l的酵母，其中所述至少一种异源基因与至少一种天然酵母基因组合地编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶。4.权利要求l的酵母，其中所述酵母过表达丙酮酸脱羧酶以提高胞质乙酰-CoA生成。5.权利要求4的酵母，其中所述丙酮酸脱羧酶是由酿酒酵母基因尸DC7所编码的。6.权利要求4的酵母，其中所述丙酮酸脱羧酶是由酿酒酵母基因尸DC7、尸DC5、和尸Z)C6中至少一种所编码的。7.权利要求l的酵母，其中所述酵母过表达醛脱氢酶以提高胞质乙酰-CoA生成。8.权利要求7的酵母，其中所述醛脱氢酶是由酿酒酵母基因」ZX)6所编码的。9.权利要求7的酵母，其中所述醛脱氢酶是由乳酸克鲁维酵母基因JZi)6所编码的。10.权利要求l的酵母，其中所述酵母过表达乙酰-CoA合成酶以提高胞质乙酰-CoA生成。11.权利要求10的酵母，其中所述乙酰-CoA合成酶是由酿酒酵母基因」CS/和酿酒酵母基因^C52中至少一种所编码的。12.权利要求10的酵母，其中所述乙酰-CoA合成酶是由乳酸克鲁维酵母基因^CS7和乳酸克鲁维酵母基因JCS2中至少一种所编码的。13.权利要求l的酵母，其中所述酵母过表达醛脱氬酶和乙酰-CoA合成酶二者以提高胞质乙酰-CoA生成。14.权利要求13的酵母，其中所述醛脱氢酶是由酿酒酵母基因^LD6所编码的，且所述乙酰-CoA合成酶是由酿酒酵母基因^CS7和酿酒酵母基因^C52中至少一种所编码的。15.权利要求13的酵母，其中所述醛脱氬酶是由乳酸克鲁维酵母基因J丄Z)6所编码的，且所述乙酰-CoA合成酶是由乳酸克鲁维酵母基因」C57和乳酸克鲁维酵母基因」CS2中至少一种所编码的。16.权利要求13的酵母，其中所述酵母过表达丙酮酸脱羧酶以提高胞质乙酰-CoA生成。17.权利要求16的酵母，其中所述丙酮酸脱羧酶是由尸Z)C7、户Z)C5和尸DC6中至少一种所编码的，醛脱氢酶是由酿酒酵母基因J丄D6所编码的，且所述乙酰-CoA合成酶是由酿酒酵母基因^GS7和酿酒酵母基因^GS2中至少一种所编码的。18.权利要求16的酵母，其中所述丙酮酸脱羧酶是由乳酸克鲁维酵母基因尸Z)C7所编码的，醛脱氢酶是由乳酸克鲁维酵母基因v4丄D(5所编码的，且所述乙酰-CoA合成酶是由乳酸克鲁维酵母基因^CW和乳酸克鲁维酵母基因^CS2中至少一种所编码的。19.权利要求l的酵母，其中所述酵母过表达丙酮酸脱氢酶以提高胞质乙酰-CoA生成。20.权利要求19的酵母，其中所述酵母过表达由大肠杆菌基因ace五、aceF、/;^4所编码的丙酮酸脱氢酶以提高胞质乙酰-CoA生成。21.权利要求20的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。22.权利要求19的酵母，其中所述酵母过表达由删除了N-末端线粒体靶向信号的酿酒酵母基因尸」〖X4/、尸DB7、尸Z)X7、丄v477、￡尸/)/所编码的丙酮酸脱氬酶以提高胞质乙酰-CoA生成。23.权利要求22的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。24.权利要求23的酵母，其中所述酵母是(l)基因型;^/cZ4,及(2)基因型;^fc/zl、基因型;dc5zl、和基因型^/c6zl之一的酿酒酵母。25.权利要求23的酵母，其中所述酵母是基因型/x/c/zl的乳酸克鲁维酵母。26.权利要求l的酵母，其中所述酵母过表达丙酮酸曱酸裂合酶和曱酸脱氬酶二者以提高胞质乙酰-CoA生成。27.权利要求26的酵母，其中所述酵母过表达由大肠杆菌基因;^/L4和大肠杆菌基因//W所编码的丙酮酸曱酸裂合酶，并与博伊丁氏假丝酵母基因组合以提高胞质乙酰-CoA生成。28.权利要求27的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。29.权利要求27的酵母，其中所述酵母是(l)基因型/^cW，及2)基因型/3&"、基因型/^c5丄和基因型/^c6z/之一的酿酒酵母。30.权利要求27的酵母，其中所述酵母是基因型;^c/z/的乳酸克鲁维酵母。31.权利要求l的酵母，其中所述至少一种异源基因中至少一种已经进行了分子进化以增强由其所编码的蛋白质的酶活性。32.权利要求l的酵母，其中至少一种另外的编码醇脱氬酶的基因被灭活，使得醇脱氬酶活性充分降低以相对于野生型生成提高胞质乙酰-CoA生成。33.权利要求32的酵母，其中所述酵母是酿酒酵母，且所述醇脱氢酶是由JZ)7/7所编码的。34.权利要求32的酵母，其中所述酵母是乳酸克鲁维酵母，其所述醇脱氢酶是由所编码的。35.权利要求32的酵母，其中所述酵母是酿酒酵母，且所述醇脱氢酶是由yiD/W、^D//2、ylD/73和ylDf"所编码的。36.权利要求32的酵母，其中所述酵母是乳酸克鲁维酵母，且所述醇脱氬酶是由爿￡)/7/、AD////、爿/)/////和爿￡>///7所编码的。37.权利要求l的酵母，其中所述酵母是来自以下属之一的物种酵母属、德克酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、西洋蓍霉属、曲霉属、克鲁维酵母属、管嚢酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、丝孢酵母属、Kwwt/a矽附G、有孢圆酵母属、和隐球菌属。38，权利要求l的酵母，其中所述途径在代谢碳源以生成正丁醇时提供平衡的NADH生成和消耗。39.—种生产正丁醇的方法，该方法包括(a)提供如下代谢工程化酵母，其能够代谢碳源以生成正丁醇，至少一种途径配置成生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量，且至少一种异源基因编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶；并(b)培养该代谢工程化酵母，培养的时间和条件用以生成正丁醇。40.—种使用酵母生产正丁醇的方法，该方法包括(a)代谢工程改造酵母以提高胞质乙酰-CoA生成；(b)代谢工程改造酵母以表达将碳源转化成正丁醇的代谢途径，其中该途径需要至少一种对于该酵母而言非天然的酶，其中步骤(a)和(b)可以以任一次序实施；并(c)培养该酵母，培养的时间和条件用以生成可回收量的正丁醇。41.一种使用酵母生产正丁醇的方法，该方法包括(a)培养代谢工程化酵母，培养的时间和条件用以生成酵母细胞生物质但不激活正丁醇生成；并(b)在另一段时间改变培养条件，培养的时间和条件用以生成可回收量的正丁醇。42.—种代谢工程化酵母，其能够代谢碳源并生成相对于野生型酵母所生成的胞质乙酰-CoA量增加的乙酰-CoA量。43.权利要求42的酵母，其中所述酵母过表达丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶和乙酰-CoA合成酶以提高胞质乙酰-CoA生成。44.权利要求42的酵母，其中所述丙酮酸脱羧酶是由酿酒酵母基因尸DC7、i^C5和PZ)C6中至少一种所编码的，醛脱氢酶是由酿酒酵母基因^LZ)6所编码的，且乙酰-CoA合成酶是由酿酒酵母基因v4GW和^CS2中至少一种所编码的。45.权利要求44的酵母，其中所述醇脱氢酶是通过删除酿酒酵母基因710///而灭活的。46.权利要求42的酵母，其中所述酵母是克鲁维酵母属的，所述丙酮酸脱羧酶是由乳酸克鲁维酵母基因^/尸DC所编码的，醛脱氢酶是由乳酸克鲁维酵母基因^L4丄ZM所编码的，且乙酰-CoA合成酶是由乳酸克鲁维酵母基因i04CW和AX4CW中至少一种所编码的。47.权利要求46的酵母，其中所述醇脱氢酶是通过删除乳酸克鲁维酵母基因^D7/7而灭活的。48.权利要求42的酵母，其中所述酵母过表达丙酮酸脱氢酶以提高胞质乙酰-CoA生成。49.权利要求48的酵母，其中所述酵母过表达由大肠杆菌基因flc^:、大肠杆菌基因ace尸和大肠杆菌基因/;^4所编码的丙酮酸脱氢酶以提高胞质乙酰-CoA生成。50.权利要求49的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。51.权利要求49的酵母，其中所述酵母是(l)基因型/^cZ^，及(2)基因型;^c7zl、基因型;^/c5zl、和基因型/^c^之一的酿酒酵母。52.权利要求49的酵母，其中所述酵母是基因型;&"的乳酸克鲁维酵母。53.权利要求48的酵母，其中所述酵母过表达由删除了N-末端线粒体靶向信号的酿酒酵母基因尸A47、尸￡必7、尸DX7、丄J77、和丄尸Z)/所编码的丙酮酸脱氢酶以提高胞质乙酰-CoA生成。54.权利要求53的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。55.权利要求53的酵母，其中所述酵母是(l)基因型/^c2z1,及(2)基因型;7&"、基因型/A5zl、和基因型;^/cW之一的酿酒酵母。56.权利要求53的酵母，其中所述酵母是基因型/^c"的乳酸克鲁维酵母。57.权利要求42的酵母，其中所述酵母过表达丙酮酸曱酸裂合酶和曱酸脱氬酶二者以提高胞质乙酰-CoA生成。58.权利要求57的酵母，其中所述酵母过表达由大肠杆菌基因;/7丄/7/W所编码的丙酮酸曱酸裂合酶，并与博伊丁氏假丝酵母基因FD7/7组合以提高胞质乙酰-CoA生成。59.权利要求58的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。60.权利要求59的酵母，其中所述酵母是(l)基因型;^c2J，及(2)基因型/7&/丄基因型;^c5丄和基因型/^/c(5J之一的酿酒酵母。61.权利要求59的酵母，其中所述酵母是基因型;^c/的乳酸克鲁维酵母。62.权利要求42的酵母，其中至少一种基因已经进行了分子进化以增强由其所编码的蛋白质的酶活性。63.—种提高酵母的代谢活性的方法，该方法包括酵母生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量。64.—种代谢工程化酵母，其具有至少一种途径，该途径配置成生成相对于野生型酵母所生成的另一胞质乙酰-CoA量增加的胞质乙酰-CoA量。全文摘要公开了代谢工程化酵母及生产正丁醇的方法。在一个实施方案中，代谢工程化酵母能够代谢碳源以生成正丁醇，至少一种途径生成相对于野生型酵母所生成的胞质乙酰-CoA增加的胞质乙酰-CoA，且至少一种异源基因编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶。在另一个实施方案中，生产正丁醇的方法包括(a)提供如下代谢工程化酵母，其能够代谢碳源以生成正丁醇，至少一种途径生成相对于野生型酵母所生成的胞质乙酰-CoA增加的胞质乙酰-CoA，且至少一种异源基因编码并表达能够利用NADH来将乙酰-CoA转化成正丁醇的代谢途径的至少一种酶；并(b)培养该酵母以生成正丁醇。还公开了其它实施方案。文档编号C12P7/16GK101652482SQ200780051627公开日2010年2月17日申请日期2007年12月21日优先权日2006年12月21日发明者尤维尼·古纳沃德纳,彼得·迈因霍尔德,琼·尤拉诺,里德·M·R·费尔德曼,马修·W·彼得斯申请人:格沃股份有限公司