专利名称：空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
娜大臉弯曲菌^I检测试剂盒的制备和检测方法駄领域本发明涉及一种利用环介导等显扩增(LAMP)技术进行菌样盼^I检测的方法，具体是一种魏;W^曲菌^I检测试剂盒的制备和检测方法。背景狱魏弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是一^M逗点状或S形的革兰阴性杆菌， 是常见的人畜共患病原菌，该菌广泛分布于自然界，可M动物、食物、水、牛奶割专 播。该駒引起动物下痢和人的肠炎，多种动Wt此菌。i^^分布甚广，曾从牛、猫、 狗、兔、麟哺乳动物和离体的肠管和祠離物中检出。彌传播途4姓要是消{雄，空 臉弯曲杆菌是斜顿原菌，在气候寒冷、饲养管理不善、牛^f[力斷氐的情况可弓胞 发病。感染不仅可以引起纖、急性、自限性胃肠炎、格林-巴利徵征，还可以引起牛 和绵^^荒产，力鸟的肝炎和蓝冠病，童子X鸟和飾鸟顿倒干炎，嫩鸟、犊牛、仔猪的腹 湾等多种疾病。可以iM动物、鸟和患病者的粪^A环境中，包括t畑水，由于该菌 对环境非常敏感，所以不可能在宿勤卜存活时间太长，但是在水中可以mVNC状态。 污染的水、生牛奶和禽肉是人类感染的;ti對专染源。SJ^弯曲杆菌主要引起人类的急 ',炎和食物中毒，并已取代沙门氏菌成为鋭国織常见的腹湾病病原菌之一，被认为是人 要^^!^ 原菌之一，由于S^弯曲杆菌t，的生长斜特n容易SA^r培养但存活的状态，所以传统的生化鉴定结果不够可靠，并且是一项费时而繁琐的工作。 现有舰弯曲杆菌的检测方法主魏PCR、腿杂交、献栅滤膜筛选和酶免疫。目前尚未见用环介导等显扩增方法检测SI^弯曲杆菌的试剂^^^t测方法的手随。 发明内容本发明的目的是掛共一种顿大臉弯曲菌决速检测试剂盒的制备和检测方法，以克 服现有技术的J^缺点，从而为7jC产翁直和食品^r^i共科学的依据和指导作用。本发明的主要原理为(1) f魏设计一组可以识别耙DM六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内弓胸)和两个外弓嫩(上游外引物和下游外弓嫩)，内引t^含耙DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA 合鹏具有高度驢换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外弓嫩启动，释放出单链DNA， 荆乍为由杂交至脾巴的另一端的一个内引物和一个外弓胸启动的DNA合淑嫩，产生一个4原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNAfi^皿，启动fffl换DM的合成，产生一 个原始的茎环DNA和一^f 的由两倍茎长度的茎环DNA; (4)在^^显^j牛下，内引物以 茎环DNA为t1^， MMS，成多4^有耙DNA重，列的蓬环DNA，在一小时内该 循环反应可使耙DNA累积到109拷贝，可M荧光染料彩见^T增结果。本发明涉及的魏;W^曲菌I^I检测微l」盒，其中的试剂包括如下(1) _ (4):(1)环介导鏽扩增(LAMP)反应液 其中包括10XThermopo1反应缓冲液、300—500umol/L dMP、 2—4mmol/L硫酸 镁(MgS04)、 0.8—1.2ymol/L上游引内物(FIP)、 0. 8—1. 2y mol/L下游内引物(BIP)、 0. 2—0. 3 y mol/L上游外弓|物(F3)、 0. 2—0. 3 pmol/L下嫩卜弓|物(B3)和l一l. 5mol/L 甜纖上游内引物5- ACAGCTATACCACTrGAACCAnTA-AAGTGAACCTGATGTTTTACCT醫3 、下游内引物5- ACAAACATCCCGCCTCArAGnTAA-TCTCTTCTAAGCTTGCArCT -3 、 上齢卜引物5國TTCCAAAITArGArGGTrcAGA國3、 下游外引物5國TGGACCTnAATAAACTGCATAA-3 、其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。其中所述的10 X Thermopol反应缓冲液中含有200 mmol pH8. 8的三羟基甲基M 甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100ranol/L氯化钾(KC1)、 100ramol/L硫^f安((肌)2S04)、 20 ramol/L硫^l美(MgS04)和1X曲鄉X—100 (Triton X—100);(2) 區酶1 U/uL;(3) Bst靈聚合酶8 U /uL;(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面戶;M环介导^^扩增(LAMP)反应液每管23uL的最佳纟賊为2.5uL 10XThermopol反应缓冲液、1. 0y L 10ramol/L dMP (四种脱ftt亥糖核酸的混^tl)、 1.0uL 20 u mol/L上游内引物(FIP)、 1. 0 y L 20 u mol/L下游内引物(BIP)、 0. 25 y L 20 u mol/L 上游外引物(F3)、 0.25pL 20umol/L下游外引物(B3)、 0.5nL 100 ranol/L MgS04、 12.5uL 2M甜M^卩4uL ddH"(灭菌双蒸水)。f顿J^试剂^t测SI汤;W^弯曲菌的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):(1) 待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D脚/OD观在l. 6-2.0范围内，浓度在 10-100 ng/yL范围内。(2) 进行S^;W^弯曲菌的环介导等显扩增反应A. 在歸23uLLAMP反应液的反应管中力口入luL待检丰鎌DNA，和0.5uL的UNG 酶，于直M7jC浴上50。C方爐3 min， 95。C方燈3—5 min，立即置于冰上1—3 min;B. 在反应管中力口入luL Bst DNA聚合酶；C. 于水鹏中恒^7jC浴上60—65。C方爐45—90 min;D. 将水浴调到80—95。C中止反应，3—5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的齡鹏管中加入1PL显色剂，直接用肉膨见察颜色变化，如果 为黄 色，说明待检样品不含或者不是顿;W^曲菌，如果颜色变为纟絶，则说明待检样品含有^为^I^W^曲菌。本发明^:了SI^W^曲菌的环介导等显扩增樹则试剂^S检测方法，本试剂盒根据，;W弯曲菌的gyrA基因的基本保守区的六个序列设计了两，异性内引物和两W寺异龄卜弓嫩，该保守基因序列为娜: ^曲菌各不同血清型和菌株,万贿，以保ffi/人种的水平上检测不同来源的顿大臉弯曲菌株的可靠性。本发明翻环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵鹏，但不需要 昂贵的PCR仪，只需普通的水纖即可，且结果不必用 繊电泳方ti^见察，{顿荧光染料彩见察即可，简单而十规。可用于魏: ^弯曲菌的检测，特别适于基层医疗机构。具体实施力式下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明柳蹄lj。 实施例1按下列配方制作^^W^弯曲菌的环介导^a扩增试剂盒(1) LAMP反应液含有2.5 uL lOXThermopol反应缓冲液、l.OuL 10 mmol/L dOTP、 1.0 wL 20 ymol/L上游内弓胸(FIP)、 1.0uL20，l/L下游内弓胸(BIP)、 0. 25"L20umol/L 上游外引物(F3)、 0.25uL20iimol/L下嫩卜弓l物(B3)、 0. 5 u L 100mmol/LMgS04、 12.5"2 mol/L甜^W口 4 " ddaO 。 其中戶脱的上游内引物5- ACAGCTATACCACTTGAACCAnTA-AAGTGAACCTGATGTnTACCT -3 、 下游内引物5- ACAAAC ArCCCGCCTCATAGnTAA-TCTCTrCTAAGCTTGC ATCT -3 、 上嫩卜引物5國TTCCAAAITArGArGGTrcAGA画3、 下游外引物5-TGGACCnTAATAAACTGCATAA-3其中混，dOTP内的四种脱ftt亥糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2:1:1:1。(2) UNG酶1 U/uL;(3) Bst薩聚合酶8U(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN 1^DNAGreen。 按照以下(1) - (3)禾M^进行检测(1) 样品DNA的提取检测菌种空臉弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),菌种来源中国1^斗院食品^^微 生物菌州繊中心，编号IQCC13602。使用北京天根生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D脚/ OD观 倉,翻1. 8，浓度达到20 ng/ u Lo(2) 进行S^W^弯曲菌的环介导等显扩增反应A. 在親23 u L LAMP反应液的反应管中力口入1 u L待检丰鎌DNA，和0. 5 u L的UNG 酶，于直^7jC浴上50。C方爐3 min， 95。C方爐5 min，立即置于冰上l min;B. 在反应管中加入l UL Bst DNA聚合酶；C. 于直^7jC浴上65 。C方j(g 1小时；D. 将水浴调到80 。C中止反应，3 min后取出；(3) 显色检测在待检的旨反应管中加入l PL显色剂，直接用肉目 察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品不含或者不是SM^J^弯曲菌，如果Mfe变为纟絶，贝U说明待检样 品含有赫为SI^J^弯曲菌。实施例2按下列配方制作魏大臉弯曲菌的环介导^^扩增试剂盒 (1)證鹏液含有2.5tiL 10XThermopol反应缓冲液、1.0uL 10 mmol/L dOTP、 1.0 uL 20u mol/L上游内引物(FIP)、 1.0 txL20 umol/L下游内引物(BIP)、 0.25 uL20umol/L 上游外引物(F3)、 0.25 UL20 umol/L下嫩卜引物(B3)、 0.5 u L 100 mmol/L MgS04、 12. 5 li L 2 mol/L甜熟卿4 u L ddH20。其中戶脱的上游内引物、下游内引物、上齢卜引物、下嫩卜引物同上。 战混^dNTP内的四种脱ftt亥糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。(2) UNG酶:1 U/yL;(3) Bst DNA聚合酶8U /ixL;(4) 显色剂C:为10X的荧光染料SYBR GREEN 1^DNAGreen。 按照以下(1) - (3)禾M^进行检测(1) 样品DNA的提取检测菌种空M曲杆菌(Campylobacter jejuni),薪中来源中国1^斗院食品安全微 生物菌种 中心，编号IQCC13601。4OT:W^生物工程公司的植物核^I取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D股/0D加倉, 达到1.8，,达到20 ng/uL。(2) 进行 ^弯曲菌的环介导等显扩增反应A. 在翻23uLLAMP反应液的反应管中力口入luL待检禾鎌DNA，和0.5ixL的UNG 酶，于恒M7jC浴上50。C方爐3 min， 95。C方燈5min，立即置于冰上lmin;B. 在反应管中加入1 ii L Bst DNA聚合酶；C. 于恒^7jC浴上65。C方燈l h;D. 将7jC浴调到80。C中lhS应，3min后取出；(3) 显色检测在待检的針反应管中加入1" L显色剂，直接用剛歐见察颜色变化，如^Mfe为黄 色，说明待检样品不含或者不是 ^曲菌，如果颜色变为乡絶，则说明待检样品含有#为 ; ^曲菌。核苷,列表〈110〉山东出入境检验检疫局检验,技术中心〈120〉魏大臉弯曲菌I^I检测试剂盒的制备和检测方法<160〉 4〈210〉 1<211> 47〈212>腿〈213〉 AX序列〈221> prim—bind〈222> (1)…(47)〈400〉 1acagctatac cacttgaacc atttaaagtg aacctgatgt tttacct 47〈210〉 2 〈211〉 45 <212〉腿 <213> AX序列 〈221> prim—bind <222〉 (l)... (45) <400〉 2acaaacatcc cgcctcatag tttaatctct tctaagcttg catct 45〈210〉 3 〈211〉 22 〈212〉腿 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim— bind <222> (22) 〈400〉 3ttccaaatta tgatggttca ga 229〈210〉 4 〈211〉 23 <212> DNA 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim—bind <222> (23) 〈400〉 4tggaccttta ataaactgca taa 2权利要求
1. 一种空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括(1)-(4)(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中上游内引物5-ACAGCTATACCACTTGAACCATTTA-AAGTGAACCTGATGTTTTACCT-3、下游内引物5-ACAAACATCCCGCCTCATAGTTTAA-TCTCTTCTAAGCTTGCATCT-3、上游外引物5-TTCCAAATTATGATGGTTCAGA-3、下游外引物5-TGGACCTTTAATAAACTGCATAA-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒，其特征是上 述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP 二2:1:1:1。
3. 空肠大肠弯曲菌的快速检测方法，其特征是依次包括(1) _ (3)下列 步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26。/ 0D，在1. 6-2. 0范围 内，浓度在10-100 ng/uL范围内。(2) 进行空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23uLLAMP反应液的反应管中加入luL待检样品模板DNA，和 0. 5nL的UNG酶，于恒温95 。C放置3 —5 min，立即置于冰上1 —3 min;B. 在反应管中加入1UL Bst DNA聚合酶；C. 再于恒温65 。C放置45 — 90 min;D. 将温度调到80 。C中止反应，3 — 5 min后取出待检；(3) 显色检测在每个反应管中加入luL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜 色为黄色，说明待检样品不含或者不是空肠大肠弯曲菌，如果颜色变为绿 色，则说明待检样品含有或为空肠大肠弯曲菌。
全文摘要
本发明涉及一种用环介导等温扩增技术的空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法。该试剂盒内有环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-ACAGCTATACCACTTGAACCATTTAAAGTGAACCTGA TGTTTTACCT-3、下游内引物5-ACAAACATCCCGCCTCATAGTTTAAT CTCTTCTAAGCTTGCATCT-3、上游外引物5-TTCCAAATTATG ATGGTTCAGA-3、下游外引物5-TGGACCTTTAATAAACTGCATAA-3和甜菜碱；检测空肠大肠弯曲菌的方法包括细菌DNA的提取、空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/68GK101255459SQ20081001500
公开日2008年9月3日 申请日期2008年3月25日 优先权日2008年3月25日
发明者昃向君, 超 林, 颖 陈, 雷质文, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心