专利名称：β-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物发酵产生的(3-葡萄糖苷酶在生物转化中的应用，尤其涉及 微生物发酵产生的p-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜声醇中的应用。
技术背景白藜卢醇是一种天然多酚类物质，化学名称为芪三酚，主要存在于虎杖、葡萄、花 生、黎卢、何首乌等多种植物中。白藜芦醇具有抗炎、抗菌作用，能够抑制金黄色葡萄 球菌、卡他球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等致病菌的生长，还具有抑制和治疗肿瘤癌变， 抑制血小板非正常凝集，调节血脂、保护心血管的功能，主要可以用于预防和治疗心肌 硬塞、动脉粥样硬化、脑血栓等心脑血管疾病。近年来，发现白藜芦醇具有抗氧化、抗 自由基，延缓衰老的作用，因而也被广泛应用于食品保健品和化妆品，致使其需求量在 逐年上升。白黎戸醇传统的生产方法主要是化学合成和从天然植物中提取。化学合成法成本 高，污染环境，所以目前白黎芦醇的生产主要是从植物中提取。然而，植物中游离态的 白藜芦醇含量很低，这就使得其分离纯化成本偏高。植物中，以与糖苷元结合的形式存在的白黎芦醇苷的含量是白黎芦醇量的7 12倍。 这为白黎卢醇的大量制备提供了基础。将白黎芦醇苷转化为白黎芦醇主要是通过微生物转化和酶法转化实现的。微生物转 化法能够有效提高白黎卢醇的产率，但是转化产物较复杂，导致白黎卢醇后续的分离提 纯较为困难。利用微生物酶法水解植物中的白黎芦醇苷，将其转化为白黎芦醇，具有条件温和， 反应产物较单一，产物得率高，环境友好等许多优点，从而可以克服传统的糖苷水解反 应需要在高温高压下，由酸或碱催化来完成，对设备要求高，且对环境造成污染的缺点。 发明内容针对现有技术中所述的不足，本发明要解决的问题是提供一种P-葡萄糖苷酶在转化 白藜戶醇苷制备白藜芦醇中的应用。本发明所述p-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇中的应用，其特征在于，以下述步骤实现(1) 菌种选择选用桔青霉CGMCC 3. 2938，少根根霉CGMCC No. 1963，杨奇青霉CGMCC NO. 0668，绿色木霉CGMCC No. 1962，毛霉CGMCC NO. 0151，黑曲霉CGMCC 0496，黑曲 霉CGMCC 0751， 土曲霉CGMCC No. 0569中的一种菌作为产(3-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备(3-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于p-葡萄糖 苷酶产酶培养基中，在25'C 50'C，摇床转速120 220 rpm的条件下，产酶发酵12~ 144小时，然后将所有发酵物在5000 10000 r/min的转速下离心15 40 min，收集上 清液即获得P-葡萄糖苷酶粗酶液；(3) 酶转化白藜芦醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品，将其粉碎至60目， 然后按lg粉碎的样品比5 10 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2)制得 的(3-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于25'C 45。C条件下静置转化反应10 24小时；或充分搅拌后置于25°C 45°C、摇床转速80 180 rpm条件下转化反应5 24小时；(4) 转化液收集将步骤(3)转化反应后的所有物料以4000 8000 r/min条件离 心10 15 min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；(5) 白藜戸醇的提取纯化向步骤(4)获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体 积量的50 95%的乙醇，在5(TC 100'C温度下进行加热回流提取，得纯(3-葡萄糖苷酶 转化产物——白藜戸醇液。上述应用中，所述产p-葡萄糖苷酶的菌优选桔青霉CGMCC 3. 2938,少根根霉CGMCC No. 1963，绿色木霉CGMCC No. 1962，毛霉CGMCC NO. 0151，黑曲霉CGMCC 0496， 土曲 霉CGMCC No. 0569中的一种。上述应用中，所述p-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为10 40 g/L麦麸，10 40 g/L 草粉，5 10 g / L硫酸铵或3 5 g/L尿素，0.5 5 ml/L微量离子液；其中，所述 微量离子液是如下组分量的溶液FeS04 0 . 5 ml/L、 MnSO., 0. 16 ml/L、 ZnSO,, 0. 14 ml/L、 CoCl2 0. 2 ml/L。上述应用中，歩骤(2)中所述温度优选28 38°C,所述摇床转速优选150 220rpm， 所述产酶发酵时间优选为24 120小时。上述应用中，步骤(2)中所述离心条件优选5000 7000r/min的转速下离心20 30 min。上述应用中，步骤(3)中所述含有白藜芦醇苷的植物样品是指虎杖、花生根、花生、葡萄皮、黎芦、何首乌之一。上述应用中，步骤(3)中所述温度优选28 38°C，所述摇床转速优选120 160rpm。 上述应用中，歩骤(4)中所述离心的转速优选4000 6000 r/min。 上述应用中，步骤(5)中所述乙醇的体积百分比浓度优选是75% 95%。 上述应用中，步骤(5)中所述乙醇加热回流提取白藜,-醇的温度优选6(TC 8(TC。 本发明是利用微生物产生的(3-葡萄糖苷酶将植物(如虎杖、花生根、花生、葡萄皮、何首乌等)中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，具有重要意义和极好的市场前景，能产生可观的经济效益。本发明的优点在于利用微生物产生的(3-葡萄糖苷酶粗酶液对白藜产醇苷进行转化， 收率高，产物较单一，白藜芦醇的分离提取步骤简单，极易规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明内容作进一步的说明，但并不尽限于此。 实施例1:'(1)菌种选择选用桔青霉CGMCC 3.2938作为产p-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备p-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于p-葡萄糖苷酶产酶培养基中，在25'C，摇床转速120 rpm的条件下，产酶发酵18小时，然后将 所有发酵物在5000r/min的转速下离心15 min，收集上清液即获得P-葡萄糖苷酶粗酶 液；(3) 酶转化白藜芦醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品(虎杖)，将其粉碎至 60目，然后按lg粉碎的样品比6 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2)制 得的(3-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于28°C、摇床转速100 rpm条件下转化反应10 小时；(4) 转化液收集将步骤(3)转化反应后的所有物料以5000r/min条件离心lOmin， 收集上清液即得含白藜产醇的溶液；(5) 白藜芦醇的提取纯化向歩骤(4)获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体 积量的65%的乙醇，在6CTC温度下进行加热回流提取，得纯p-葡萄糖苷酶转化产物一 一白藜戸醇液。上述p-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为30 g/L麦麸，20 g/L草粉，8 g / L硫 酸铵，1.5 ml/L微量离子液；其中，所述微量离子液是如下组分量的溶液FeS04 0.5 ml/L、 MnS04 0. 16 ml/L、 ZnS04 0. 14 ml/L、 CoCl2 0. 2 ml/L。经过10小时的转化，白藜卢醇的产率为5.8mg/g，对照实验白藜卢醇的得率为 1.2mg/g,未转化前白藜芦醇苷的含量为5mg/g。实施例2;(1) 菌种选择选用少根根霉CGMCC No. 1963作为产p-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备P-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于(3-葡萄糖 苷酶产酶培养基中，在30'C，摇床转速150 rpm的条件下，产酶发酵24小时，然后将 所有发酵物在6000 r/min的转速下离心20 min，收集上清液即获得(3-葡萄糖苷酶粗酶 液；(3) 酶转化白藜芦醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品(虎杖)，将其粉碎至 60目，然后按lg粉碎的样品比7 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2)制 得的p-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于30'C条件下静置转化反应14小时；(4) 转化液收集将步骤(3)转化反应后的所有物料以6000 r/min条件离心10nun， 收集上清液即得含白藜卢醇的溶液；(5) 白藜卢醇的提取纯化向步骤(4)获得的含白藜卢醇的溶液中加入其1倍体 积量的75%的乙醇，在70'C温度下进行加热回流提取，得纯p-葡萄糖苷酶转化产物一 一白藜芦醇液。上述(3-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为20g/L麦麸，20g/L草粉，5g/L尿素， 2.5 nil/L微量离子液；其中，所述微量离子液是如下组分量的溶液FeSO, 0. 5 ml/L、 MnS04 0. 16 ml/L、 ZnSO,, 0. 14 ml/L、 CoCl2 0.2 ml/L。经过14小时的转化，白藜芦醇的产率为6.0mg/g，对照实验白藜芦醇的得率为 1.2mg/g，未转化前白藜芦醇苷的含量为5mg/g。 实施例3:(1) 菌种选择选用杨奇青霉CGMCC N0.0668作为产(3-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备P-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于(3-葡萄糖 苷酶产酶培养基中，在32'C，摇床转速160 rpm的条件下，产酶发酵36小时，然后将 所有发酵物在7000 r/min的转速下离心20 min，收集上清液即获得P-葡萄糖苷酶粗酶 液(3) 酶转化白藜芦醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品(黎芦)，将其粉碎至 60目，然后按lg粉碎的样品比8 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2)制 得的(3-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于32°C、摇床转速140 rpm条件下转化反应16 小时；(4) 转化液收集将歩骤(3)转化反应后的所有物料以7000r/min条件离心10min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；(5)白藜戸醇的提取纯化向步骤(4)获得的含白藜戸醇的溶液中加入其1倍体 积量的85%的乙醇，在80'C温度下进行加热回流提取，得纯P-葡萄糖苷酶转化产物一 —白藜戸醇液。上述p-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为30g/L麦麸，30g/L草粉，5g/L尿素， 3.5 ml/L微量离子液；其中，所述微量离子液是如下组分量的溶液FeSO.， 0. 5 ml/L、 MnS(X 0. 16 ml/L、 ZnS04 0. 14 ml/L、 CoCl2 0. 2 ml/L。经过16小时的转化，白藜戸醇的产率为6.0mg/g，对照实验白藜卢醇的得率为 1.2mgZg，未转化前白藜芦醇苷的含量为5mg/g。 实施例4:(1) 菌种选择选用土曲霉CGMCC No.0569作为产p-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备[3-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于p-葡萄糖 苷酶产酶培养基中，在25'C，摇床转速120 rpm的条件下，产酶发酵18小时，然后将 所有发酵物在5000r/min的转速下离心15 min，收集上清液即获得p-葡萄糖苷酶粗酶 液；(3) 酶转化白藜芦醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品(何首乌)，将其粉碎 至60目，然后按lg粉碎的样品比6 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2) 制得的13-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于28'C、摇床转速IOO rpm条件下转化反应 IO小时(4) 转化液收集将步骤(3)转化反应后的所有物料以5000r/min条件离心10 min， 收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；(5) 白藜戸醇的提取纯化向步骤(4)获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体 积量的75%的乙醇，在60'C温度下进行加热回流提取，得纯(3-葡萄糖苷酶转化产物一 —白藜卢醇液。上述(3-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为25 g/L麦麸，25 g/L草粉，8 g / L硫 酸铵，2ml/L微量离子液；其中，所述微量离子液是如下组分量的溶液FeSO,经过10小时的转化，白藜芦醇的产率为3.2mg/g，对照实验白藜芦醇的得率为 0.8mg/g，未转化前白藜芦醇苷的含量为3mg/g。 实施例5:(1) 菌种选择选用毛霉CGMCC N0.0151作为产p-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备P-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于P-葡萄糖苷酶产酶培养基中，在45。C，摇床转速220 rpm的条件下，产酶发酵120小时，然后将 所有发酵物在60000 r/min的转速下离心30 min,收集上清液即获得(3-葡萄糖苷酶粗 酶液；(3) 酶转化白藜芦醇苷反应取含有O藜芦醇苷的植物样品(花生根)，将其粉碎 至60目，然后按1 g粉碎的样品比10 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2) 制得的卩-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于45'C条件下静置转化反应24小时；(4) 转化液收集将歩骤(3)转化反应后的所有物料以8000r/min条件离心15min， 收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；(5) 白藜芦醇的提取纯化向步骤U)获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的95%的乙醇，在6crc温度下进行加热回流提取，得纯p-葡萄糖苷酶转化产物一 一白藜卢醇液。上述(3-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为30g/L麦麸，30g/L草粉，5g/L尿素， 3.5 ml/L微量离子液；其中，所述微量离子液是如下组分量的溶液FeS04 0.5 ml/L、 MnS04 0. 16 ml/L、 ZnS04 0. 14 ml/L、 CoCl2 0.2 ml/L。实施例6:(1) 菌种选择选用黑曲霉CGMCC 0496作为产p-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备P-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于p-葡萄糖苷酶产酶培养基中，在35。C，摇床转速200 rpm的条件下，产酶发酵80小时，然后将 所有发酵物在10000 r/min的转速下离心15 min，收集上清液即获得(3-葡萄糖苷酶粗 酶液；(3) 酶转化白藜卢醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品(花生根)，将其粉碎 至60目，然后按lg粉碎的样品比8 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2) 制得的(3-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于35'C、摇床转速140 rpm条件下转化反应 20小时；(4) 转化液收集将步骤(3)转化反应后的所有物料以6000 r/min条件离心15 min， 收集上清液即得含白藜戸醇的溶液；(5) 白藜芦醇的提取纯化向步骤(4)获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体 积量的90%的乙醇，在7CTC温度下进行加热回流提取，得纯p-葡萄糖苷酶转化产物一 一白藜芦醇液。上述p-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为30g/L麦麸，30g/L草粉，5g/L尿素， 3. 5 ml/L微量离子液；其中，所述微量离子液是如下组分量的溶液FeS04 0. 5 ml/L、 MnS04 0. 16 ml/L、 ZnS04 0. 14 ml/L、 CoCl2 0. 2 ml/L。实施例7:(1) 菌种选择选用绿色木霉CGMCC Nal962作为产(3-葡萄糖苷酶的菌种；(2) 制备p-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于如实施例6 所述的p-葡萄糖苷酶产酶培养基中，在37'C，摇床转速180 rpm的条件下，产酶发酵 100小时，然后将所有发酵物在8000 r/min的转速下离心25 min，收集上清液即获得 (3-葡萄糖苷酶粗酶液；(3) 酶转化白藜芦醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品(葡萄皮)，将其粉碎 至60目，然后按lg粉碎的样品比8 ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2) 制得的P-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于37°C、摇床转速150 rpm条件下转化反应 20小时；(4) 转化液收集将步骤(3)转化反应后的所有物料以6000 r/min条件离心15min， 收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；(5) 白藜芦醇的提取纯化向步骤(4)获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体 积量的85%的乙醇，在75。C温度下进行加热回流提取，得纯p-葡萄糖苷酶转化产物一 一白藜戸醇液。
权利要求
1.β-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇中的应用，其特征在于，以下述步骤实现(1)菌种选择选用桔青霉CGMCC 3.2938，少根根霉CGMCC No.1963，杨奇青霉CGMCCNO.0668，绿色木霉CGMCC No.1962，毛霉CGMCC NO.0151，黑曲霉CGMCC 0496，黑曲霉CGMCC 0751，土曲霉CGMCC No.0569中的一种菌作为产β-葡萄糖苷酶的菌种；(2)制备β-葡萄糖苷酶粗酶液将步骤(1)所述菌种以常规量接种于β-葡萄糖苷酶产酶培养基中，在25℃～50℃，摇床转速120～220rpm的条件下，产酶发酵12～144小时，然后将所有发酵物在5000～10000r/min的转速下离心15～40min，收集上清液即获得β-葡萄糖苷酶粗酶液；(3)酶转化白藜芦醇苷反应取含有白藜芦醇苷的植物样品，将其粉碎至60目，然后按1g粉碎的样品比5～10ml粗酶液的比例，向粉碎的样品中加入步骤(2)制得的β-葡萄糖苷酶粗酶液，充分搅拌后于25℃～45℃条件下静置转化反应10～24小时；或充分搅拌后置于25℃～45℃、摇床转速80～180rpm条件下转化反应5～24小时；(4)转化液收集将步骤(3)转化反应后的所有物料以4000～8000r/min条件离心10～15min，收集上清液即得含白藜芦醇的溶液；(5)白藜芦醇的提取纯化向步骤(4)获得的含白藜芦醇的溶液中加入其1倍体积量的50～95％的乙醇，在50℃～100℃温度下进行加热回流提取，得纯β-葡萄糖苷酶转化产物——白藜芦醇液。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产p-葡萄糖苷酶的菌选桔青霉CGMCC 3.2938，少根根霉CGMCC No. 1963，绿色木霉CGMCC No. 1962，毛霉CGMCC NO. 0151， 黑曲霉CGMCC 0496， 土曲霉CGMCC No.0569中的一种。
3. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述(3-葡萄糖苷酶产酶培养基的配方为 10 40 g/L麦麸，10 40 g/L草粉，5 10 g / L硫酸铵或3 5 g/L尿素，0. 5 5 ml/L 微量离子液；其中，所述微量离子液是如下组分量的溶液FeS04 0.5ml/L、 MnS(X 0. 16 ml/L、 ZnS04 0. 14 ml/L、 CoCl2 0. 2 ml/L。
4. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述温度为28 38'C，所述 摇床转速为150 220rpm，所述产酶发酵时间是24 120小时。
5. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述离心条件是5000 7000 r/min的转速下离心20 30 min。
6. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述含有白藜芦醇苷的植物 样品是指虎杖、花生根、花生、葡萄皮、黎芦、何首乌之一。
7. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述温度为28 38'C，所述 摇床转速为120 160rpm。
8. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)中所述离心的转速是4000 6000 r/min。
9. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，步骤(5)中所述乙醇的体积百分比浓度 是75% 95%。
10. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(5)中所述乙醇加热回流提取白 藜芦醇的温度是60。C 8(TC。
全文摘要
本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇中的应用，主要涉及(1)菌种选择，(2)制备β-葡萄糖苷酶粗酶液，(3)酶转化白藜芦醇苷反应，(4)转化液收集，(5)白藜芦醇的提取纯化等步骤。本发明利用微生物产生的β-葡萄糖苷酶粗酶液对白藜芦醇苷进行转化，收率高，产物较单一，白藜芦醇的分离提取步骤简单，极易规模化生产，具有极好的市场前景并能产生可观的经济效益。
文档编号C12P7/02GK101255449SQ20081001483
公开日2008年9月3日 申请日期2008年3月20日 优先权日2008年3月20日
发明者欣 宋, 曲音波, 袁晓华 申请人:山东大学