专利名称：伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种禾佣环介导紫显扩增(LAMP)技术进行菌样盼^I检测的方法，具体是一种伤寒沙门氏菌决速检测试剂盒的制备和检测方法。
技术背景伤寒沙门氏(Salmonella enterica)是一类大小0. 6 1. 0X2 3um，无芽胞的革 兰氏阴性杆菌，是病原件肠道细菌的一个属，包括肠伤寒杆菌， 一般有鞭毛，无刻莫， 多数有菌毛，在形态l:和生理上都极似大肠杆菌，1885年沙门氏等在霍舌L流行时分离到 猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物 致病，也有对人和动物者降文病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所弓跑的X寸人类、 家畜以皿生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污,品，可使 人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中 毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌分布很广，广泛在于自然界 中，常可在各种动物，如猪、牛、羊、马、等家畜忠鸟、鸭、鹅、等家禽，飞鸟、鼠类 等野生动物的肠道中发现。鸡是沙门氏菌最大的储存储主，鸡群暴发死亡率高达80%， 也存在于蛋类、穀分及其它食物中(牛肉、猪肉、鱼肉、香肠、，退等)。伤寒沙门氏菌， 甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌和仙台沙门氏菌等只对人类致病，而马流产沙门氏菌，雏 沙门氏菌只对马和鸡致病。可引起如下类型的疾病:(1)肠热症(2)食物中毒(3)慢性肠 炎(4)败血症。人们在探索沙门氏菌检测方法的过程巾，作出了不懈的努力，现有樹则方 法主要有1、同位素fei己，该方溜顿同位素1^i己的伤寒沙门氏菌DNA片段，经大约 48h的增菌步骤后，其检测敏感性高，但所需时间较长，目前尚未见用环介导等温扩增 方法检测伤寒沙门氏菌的试剂紐離测方法附艮道。 发明内容本发明的目的是提供一种伤寒沙门氏菌的快速检测试剂盒的制备和检测方法，以 克服现有技术的上述缺点，从而为水产养殖和食品安全掛共科学的依据和指导作用。本发明的主要原理为(1 )特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内弓I 物(上游内弓嫩和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外弓物)，而且内引物包含耙DNA的正义链和反义能(2)其中一个内弓物首先和靶DNA杂交，随后的f趕换 DNA合成在具有高度,连置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单f连 DNA，并作为由杂交到耙的另一端的一个内弓嫩和一个夕卜弓嫩启动的DNA合j^對反，产生 -个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产 生一个原始的蓬环DNA和一个新的由两倍莲长度的茎环DNA; (4)在^M条件下，内引 物以茎环DNA为t對及，ffiilf趕换形成多4^有-革巴DNA重mi^列的茎环DNA，在一小时 内该循环反应可使革巴DNA累积到109拷贝，可fflJl荧光染料^^^T增结果。本发明涉及的伤寒沙门氏菌卜魏检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1) - (4):(1)环介导紫显扩增(L鮮)反应液 其中包括10XThermopol反应缓冲液、300—500 timol/L dNTP、 2—4mmol/L硫酸 镁(MgS04)、 0. 8—1. 2umol/L上游引内物(FIP)、 0. 8—1. 2umol/L下游内引物(BIP)、 0. 2—0. 3 y mol/L上游外弓l物(F3)、 0. 2—0. 3 li mol/L下游外弓l物(B3)和1—1. 5mol/L 甜熟庇上游内引物5- TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG -3 、 下游内引物5- CGGTAAATACCATCCCCACGGC陽TAACGCAGCGAGAATGGC -3 、上游外弓l物5- GTCGCGTACTTTACGCCAT -3 、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3 ， 其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2:1:1:1。其中所述的lOXThemopol反应缓冲液中含有200 mmol pH8. 8的三羟基甲基MS 甲烷—盐酸(Tris—HC1)、 100mirol/L氯化钾(KC1)、 100腿ol/L硫酸智((肌)2SO〗)、 20 imol/L硫^!美(MgSCU禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1 U/";(3) Bst DNA聚合酶8 U /uL;(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液中每管23 uL的最佳绍成为2.5uL 10XThermopol反应缓冲液、1. 0 u L 10ramol/L dNTP、 1. 0 u L 20 y mol/L上游内引物(FIP)、 1.0iiL20iimol/L下、游内弓lt/ (BIP)、 0. 25y L 20 y mol/L Ji游夕卜弓l物(F3)、 0. 25nL20u mol/L下游外引物(B3)、 0. 5 u L 100 mmol/L MgS(X、 12. 5 u L 2M甜菜石碱和4 u L ddH20 (灭菌双蒸水)。使用上述试剂盒检测伤寒沙门氏菌的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):(1) 待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA ，其DNA 0D250/0D250加在1.6-2.0范围内， 浓度在10-100 ng/ ii L范围内。(2) 进行伤寒沙门氏菌的环介导等显扩增反应A. 在装有23 y L LAMP反应液的反应管中加入1卩L待检模板DNA，和0. 5 u L的UNG 酶，于恒温浴上50。C放置3 rain， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 在反应管中加入1 li L Bst DNA聚合酶；C. 于恒温65。C放置45—90 min;D. 将水浴调到8。C中止反应，3—5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的針反应管中加入b L显色剂，直接用卿B见察颜色变化，如果颜色为黄 色，说明待检样品不含或者不是伤寒沙门氏菌，如果颜色变为乡絶，贝lj说明待检样品含 有或者为伤寒沙门氏菌。本发明建立了伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增检测试剂M检测方法，本试剂獻艮 据伤寒沙门氏菌的gyrA基因的基本保守区的六个序列设计了两^#异性内弓胸和两个 特异性外引物，该保守基因序列为伤寒沙门氏菌各不同血清型和菌株MJ^共有，以保证 从种的水平上检测不同来源的伤寒沙门氏菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩增 (LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的 PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用翻交电泳方、 辣观察，4顿荧光染料来 观察即可，简单而快速。可用于伤寒沙门氏菌的检测，特别适用于基层医疗机构。下列实施例进一歩说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 实施例1按下歹脂己方制作伤寒沙门氏菌的环介导樂显扩增试剂盒 (1)酉己制LAMP反应液含有2.5 u lOXThemopol反应缓冲液、l.O卩L 10mmol/L dNTP、 1.0 uL 20Umol/L上游内引物(FTP)、 1.0uL20umo〗/L下游内弓i物(BIP)、 0. 25y L20"mol/L 上游外引物(F3)、 0.25yL20iimol/L卜游外引物(B3)、 0. 5 u L 100ramol/LMgS04、 12.5 u L 2 mol/L甜^l!^卩4 u L ddH20 。 其中户7M的上游内引称5- TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG -3 、下游内引物5- CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、匕游外弓(物5- GTCGCGTACTTTACGCCAT -3 、 下游外弓l物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3 ;其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。(2) UNG酶1 U/yL;(3) Bst D魁聚合酶8U(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)禾M)字进行检测(1) 样品DNA的提取检测薪中鼠伤寒沙门氏菌(&ifflQ/ e"s ^iffiwr/履)，薪中来源中国检科院食品安 全微生物薪中保藏中心，编号IQCC10503.2。 大连宝生物工程公司的植物核 取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D，/ OD观育够 达到1.S，鹏达到20 ng/uL。(2) 进行伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23 u L LAMP反应液的反应管中加入1 y L待检丰對及DNA，禾口 0. 5卩L的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上1 min;B. 在反应管中加入l uL Bst DNA聚合酶；C. 于恒温65 。C放置l小时；D. 将水浴调到80 。C中止反应，3 min后取出；(3) 显色检测在待检的旨反应管中加入l "L上述显色剂，直接用肉目歐见察颜色变化，如果颜 色为黄色，说明待检样品不含或者不是伤寒沙门氏菌，如果颜色变为乡絶，贝喊明待检样品含有或者为伤寒沙门氏菌。实施例2按下歹鹏己方制作伤寒沙门氏菌的环介导等显扩增试剂盒 (1)酉己制LAMP反应液含有2.5yL lOXThermopol反应缓冲液、1.0yL 10咖ol/L dNTP、 1.0 uL 20u mol/L上游内引物(FTP)、 1.0 yL20 yraol/L下游内引物(BIP)、 0.25 yL20幽l/L 上游外引物(F3)、 0.25 uL20 umol/L下游外引物(B3)、 0.5 M L 100咖ol/L MgS04、 12. 5 u L 2 mo〗/L甜^W3 4 ii L d維其中戶脱的上游内弓嫩、下游内引物、上游外弓嫩、下游外弓嫩同上。 ，混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。(2) UNG酶1 U/uL;(3) Bst DNA聚合酶8U /uL;(4) 显色剂为10%的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 按照以下(1) - (3)禾旨进行检测(1) 样品DNA的提取繊隨种甲型副伤寒沙门氏菌(&i/^W&A2ra^/w J)，菌种繊中国翻棍食 品安全微生物餅中保藏中心，编号IQCC10518。使用北京天根生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA， DNA 0DM/ 0D， 歸达到1. 7，浓度达到22 ng,/ ii L。(2) 进行伤寒沙门氏菌的环介导等显扩增反应A. 在^W23uL LAMP反应液中的反应管中加入luL待检丰對及DNA，和0.5uL的 UNG酶，于瞎O7K浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上1 min;B. 在反应管中加入luL Bst DNA聚合酶；C. 亍,JC浴上63。C體1 h;D. 将水浴调到9(TC中止反应，3min后取出；(3) 显色检测在待检的齡鹏管中加入b L显色剂，直接用卿^见察颜色变化，如果颜色为黄 色，说明待检样品不含或者不赵劳寒沙门氏菌，如果颜色变为纟絶，则说明待检样品含 有或者为伤寒沙门氏菌。核苷,列表〈110〉山东出入境检验检疫局检验皿,中心〈120〉伤寒沙门氏菌^I检测试剂盒的帝恪和检测方法〈160〉 4〈210〉 1〈211〉 41〈212〉 DNA〈213〉 AX序列〈221> prim—bind〈222> (1)…(41)〈400> 1ttacgtcacc aaccacacgg gacgtattgg gcaatgactg g 41〈210〉 2 〈211> 40 〈212>醒 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(40) ■> 2cggtaaatac catccccacg gctaacgcag cgagaatggc 40〈210〉 3 〈211> 19 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (l)... (19) 〈400〉 3gtcgcgtact ttacgccat 19<210〉 4 〈211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 〈221> prim—bind 〈222〉 (1)…(18) 〈400> 4accctgacca tccaccag 18
权利要求
1. 一种伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括(1)-(4)(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中上游内引物；5-TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG-3、下游内引物；5-CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、上游外引物5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒，其特征是上述 dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。
3. 伤寒沙门氏菌的快速检测方法，其特征是依次包括下列(1) -(3)步骤(1) 待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D柳/ 0D，在1. 6-2. 0范围 内，浓度在10-100 ng/uL范围内；(2) 进行伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增反应A.在装有23uLLAMP反应液的反应管中加入luL待检样品模板DNA，和 0. 5yL的UNG酶，于恒温95 。C放置3 — 5 min，立即置于冰上1 — 3 min;B. 在反应管中加入luL Bst DNA聚合酶；C. 再于金属浴中恒温60 — 65 。C放置45 — 90 min ;D. 将浴中温度调到80 — 95 'C中止反应，3 — 5 min后取出待检；(3)显色检测在每个反应管中加入1PL上述的显色剂，直接用肉眼观察颜色变化， 如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是伤寒沙门氏菌，如果颜色变 为绿色，则说明待检样品含有或为伤寒沙门氏菌。
全文摘要
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体说是一种伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法。该试剂盒内包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；环介导等温扩增反应液中含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-TTACGTCACCAACGAC ACGGGACGTATTGGGCAATGACTGG-3、下游内引物5-CGGTAAATACCATCCCCACGGCT AACGCAGCGAGAATGGC-3、上游外引物5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、下游外引物5-ACCCTGACCATCCACCAG-3和甜菜碱；检测伤寒沙门氏菌的方法包括细菌DNA的提取、伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/10GK101255460SQ20081001500
公开日2008年9月3日 申请日期2008年3月25日 优先权日2008年3月25日
发明者超 林, 梁成珠, 贾俊涛, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心