专利名称：：一种吸水链霉菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物及其应用，尤其涉及一种吸水链霉菌及其在制备西罗莫司中的应用。
背景技术：
：免疫抑制剂在器官移植中用于防治排斥反应，即干扰受体对外来抗原的识别和非自身细胞的清除。1954年，人类第一例同卵双生子间肾脏移植的手术取得成功以后，至今40多年来医学科学在器官移植方面的研究有了很多重大的突破。1978年环孢菌素A(cyclosporineA)的临床使用为器官移植开辟了新纪元。大多数患者肾移植2年存活率己超过80%，而患者生存率也有所提高。西罗莫司(Sirolimus)是吸水链霉菌(5yre;to/^cas/^gmycp/cw"的代谢产物，是一种新型强效免疫抑制剂，为一亲脂性35元大环内酯类化合物，结构式中含有很特殊的由a，P—二酮己哌啶酸胺分子掩盖的半宿酮，并有一个三烯片断。它抑制细胞从Gl期进入S期，阻断IL-2与其受体的结合，使Tc、Td细胞不能成为具有免疫应答作用的致敏T细胞，发挥其免疫抑制作用。西罗莫司主要应用于防治肾、肝等移植排异反应，尤适用于并发肾功能不良、震颤、高血压的患者，还能治疗类风湿关节炎、红斑狼疮、牛皮癣等疾病，现在作为防治冠状动脉再狭窄的涂层支架、基因治疗和抗肿瘤药物等具有广阔的市场前景。西罗莫司1999年10月20日在美国上市，为口服液剂型。此后采用伊兰(Elan)公司的纳米晶体(NanoCrystal)技术制备的lmg片剂也已在美国上市，获准与环孢菌素A、类固醇联合用于肾移植病人的抗排异。2000年3月西罗莫司在英国、德国、丹麦等国上市，此外西罗莫司还在英国以口服混悬剂的方式销售。西罗莫司为胞内产物，培养得到的发酵液过滤的菌体后经甲醇萃取浓縮后，再通过一系列纯化工艺如色谱层析、萃取、结晶等获得西罗莫司纯品。一般的西罗莫司产生菌，发酵单位只有200ug/ml左右，发酵副产物较多，导致后序的提取时层析分离比较困难，工作较为复杂，产品收率低于20%。
发明内容本发明的目的是针对上述问题，提供一种高单位的西罗莫司产生菌。本发明的另一个目的是提供该该菌种在制备西罗莫司中的应用。本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种吸水链霉菌ZJQ60115(6Yre/z^7(rces力/grocA'c〃sZJQ60115)，已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏编号为CCTCCNO:M207200。保藏日期为2007年12月14日。所述的保藏编号为CCTCCNO:M207200菌株来自四川横断山脉土壤样品中分离所得。所述的保藏编号为CCTCCNO:M207200菌株的菌落特征菌落形态在燕麦片琼脂培养基上，菌落圆形，直径46mm，高起。气丝灰色，培养10天以后出现黑色吸水斑。菌丝形态以高氏-天冬素琼脂或燕麦片琼脂为培养基，接入菌株FC904，斜插无菌盖玻片，在2530'C培养，分别于7天、14天、20天取出盖玻片观察。在光学显微镜下观察，保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株基丝发育良好，细长，分枝。气丝发育贫乏至中等。孢子丝着生在气生菌丝体上，为35圈的紧密螺旋形。在电子显微镜下观察，孢子圆形或卵圆形，0.50.6X0.60.8um，孢子表面疣状。综上所述，根据微生物形态学及国外相关资料的描述，结合保藏编号为CCTCCNO:M207200菌株的各种培养特征和形态特征，将保藏编号为CCTCCNO:M207200菌株初步定为5^eptomycas/^gmscp/cw系的一个变种即浙e/7tom少c&s/^msc//cwsZJQ60115。所述的保藏号为CCTCCNO:M207200的菌株可应用于发酵制备西罗莫司。该制备方法包括下列步骤a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株；b.将发酵菌株接种在固体培养基上，培养15~20天，收集菌株的孢子制成孢子甘油管，按摇瓶种子培养基体积的0.5~1%的接种量接入种子培养基，200240rpm，培养3648小时，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按种子罐培养基体积1~2%的接种量接种于种子罐培养基，150250rpm，发酵培养48~54h，得罐种子；将罐种子液按发酵培养基体积5~10%的接种量接种于发酵罐培养基，150250rpm,发酵培养120~168小时，收集发酵液；其中培养温度均为25~30°C。所述的制备方法，其中所述的固体培养基为燕麦片琼脂斜面；5所述的摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.52g，氮源0.53g，无机盐00.5g，其余为水；种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.5~2g，氮源l3g，无机盐0.10.5g，其余为水；发酵培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源412g，氮源l4g，无机盐0.1lg，氨基酸0.05~0.5g，其余为水。其中优选，摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.51.5g，氮源l2.5g，无机盐00.3g，其余为水；种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.5~1.5g，氮源l2.5g，无机盐0.10.3g，其余为水；发酵培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源610g，氮源1.53g，无机盐0.30.8g，氨基酸0.10.4g,其余为水。其中所述的碳源选自面粉、甘油、淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆汁、麦芽汁、土豆浸出粉、燕麦片中的一种或几种；所述的氮源选自玉米浆、蛋白胨、鱼胨、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母粉、酵母浸膏、黄豆粉、棉子粉、氨水、硝酸盐中的几种，无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种；氨基酸为L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。优选碳源为面粉、燕麦片、甘油、葡萄糖中的一种或几种；氮源为黄豆粉、酵母粉、蛋白胨中的几种；无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾中的一种或几种氨基酸为L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸中的一种或几种。发酵过程是西罗莫司生产的重要环节，其发酵水平与工艺优劣直接相关，本发明提供的发酵工艺经过摇瓶和10吨、50吨发酵罐进行试验，其生产能力稳定。经检测，用本发明提供的菌种及发酵培养方法制备的西罗莫司单位可高达60(Hig/ml以上，从而为后续的工业化生产提供了良好的基础。本发明所述的保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株是目前分离到的一种天然高单位的西罗莫司产生菌，发酵性能优良。本发明的西罗莫司产生菌发酵单位达到600ng/ml以上，发酵副产物相对较少，降低了后提取的难度，产品收率可达30%以上，适应于工业化生产。菌株保藏情况保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M207200，分类命名为吸水链霉菌ZJQ60115(5"帥tchygroscpicusZJQ60115)。保藏日期为2007年12月14日。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。实施例1:保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株的培养特征采用国际链霉菌计划推荐的培养基及Waksman推荐的培养基进行培养特征描述。保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株在253(TC分别培养7、14、28天观察结果。颜色的描述采用科学出版社1957年出版的《色谱》。保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株的气丝生长贫乏-中等，白-中灰(IX44')，在培养23周后有黑色吸水斑出现。基丝发育良好，在无机培养基上为无色-浅驼色(Ic34')，在有机培养基上为浅芒果黄-浅龟背灰(Ia33'-Ic54')。仅在甘油-苹果酸钙琼脂上有浅驼色的可溶性色素。保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株的培养特征培养基生长气丝基丝可溶性色素甘油-天冬素琼源OSP5)灰白背面激它色(Ic34')无鄉虚-淀臓旨卄稀薄，灰白色背面娜色(Id43，)无酵母-新琼』旨asp2)化无嫩背總(Ic54，)无smrj旨asP3)liI中總0X44，)賠果黄色(Ia33')她，脉黑斑)无MM旨(ISP7)+白色勉她(I脇，)觀鹏(IIb66，)实施例2:生理生化特征生理生化性质采用链霉菌分类中的标准方法。7保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株能利用纤维素，水解淀粉，液化明胶，冻化、凝固牛奶，还原硝酸盐，不产生H2S;生长pH59，生长温度15~40。C。实施例3:碳源利用碳源利用试验以无碳源的査氏及高氏1号琼脂为基础培养基，分别加入各种碳源2%，接入保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株，253(TC培养10、20天观察结果。保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株能利用葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖、甘油、棉籽糖、淀粉等大多数碳源，不利用山梨糖、鼠李糖等碳源。实施例4:发酵培养制备西罗莫司采用保藏编号为CCTCCNO:M207200的菌株1.种子菌种培养及保存孢子培养基燕麦片琼脂(ISP3)斜面，燕麦片20g，琼脂20g，加水定容至1000ml，pH7.0孢子培养沙土保存孢子接种于ISP3琼脂斜面，253(TC培养15~20天，斜面表面菌苔出现吸水黑斑，存4"C备用。孢子悬液的制备将灭菌好的20%(Wv)甘油水溶液加入生长好的琼脂斜面，用刮刀轻轻将孢子刮下，制成孢子悬浮液，然后分装至小试管中(5m1/支)，制备好的孢子悬液放置-2(TC冷藏备用。2.摇瓶种子培养培养基可溶性淀粉20g，酵母粉12g，蛋白胨15g，加水定容至2000ml，pH7.0装量500ml三角瓶装80ml培养基接种量0.5%(v/v)的孢子悬液培养温度27°C培养时间44h摇床转速220rpm3.种子罐种子培养基培养基葡萄糖葡萄2kg，豆粉2kg，酵母粉lkg，MgS04'7H200.02kg，氯化钠0.4kg，加水至200L，pH自然装量300L种子罐装200L种子培养基接种量2L摇瓶种子液工艺控制罐压0.04~0.05MPa搅拌速度180rpm通气量1:0.5(V/V)温度26°C周期50h4.发酵培养培养基面粉36kg，燕麦片36kg，甘油18kg，葡萄糖72kg，黄豆粉9kg，酵母粉10.8kg，蛋白胨3.6kg，L-赖氨酸2.52kg，NaCl1.8kg，加水至1.8吨，，pH自然。装量2.5吨发酵罐装1.8吨发酵培养基接种量180L的种子液工艺控制罐压0.020.03MPa搅拌速度200rpm通气量1:1(V/V)温度28°C周期144小时5.10吨、50吨发酵罐按照上述发酵条件和工艺，IO吨发酵罐、50吨发酵罐各进行3批发酵，发酵单位为600-660pg/ml，均在600昭/ml以上。将所得发酵液过滤菌体，经甲醇萃取浓縮后，再通过色谱层析、萃取、结晶等纯化工艺获得西罗莫司纯品。产品收率在30-35%，均在30%以上。具体发酵单位及提取收率见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例5:发酵培养制备西罗莫司采用保藏编号为CCTCCNO.M207200的菌株1.摇瓶种子培养培养基土豆浸出粉20g，鱼胨24g，酵母浸膏16g，K2HPO4'3H2O20g，加水至4000ml，pH7.0。500ml三角瓶装100ml培养基，接种P/。(v/v)的孢子悬液，200rpm摇床25'C培养48小时，得摇瓶种子液。2.种子罐种子培养基培养基面粉lkg，酵母粉lkg，蛋白胨lkg，MgS047H200.2kg，K2HP043H2O0.1kg，加水至200L，pH7.0。300L种子罐装200L种子培养基，接种量4L摇瓶种子液，240rpm，29"C培养36h得种子液。3.发酵培养发酵培养基按5000L培养基计，面粉200kg，葡萄糖350kg，黄豆粉50kg，酵母浸膏25kg，蛋白胨10kg，L-酪氨酸4kg，NaC140kg。种子接种量7%(v/v)，140rpm，26。C培养168小时。放罐所得发酵液离心得菌丝，甲醇浸泡后浸泡液HPLC检测效价为630ug/ml。将所得的发酵液过滤菌体，经甲醇萃取浓縮后，再通过色谱层析、萃取、结晶等纯化工艺获得西罗莫司纯品，产品收率为31.2%，实施例6:发酵培养制备西罗莫司采用保藏编号为CCTCCNO.M207200的菌株1.摇瓶种子培养培养基甘油15g，蔗糖30g，玉米浆30g，蛋白胨45g，Na2HP04*3H206g，MgS047H203g，加水定容至3000ml，pH7.0。500ml三角瓶装100ml培养基，接种0.5%(v/v)的孢子悬液，240rpm摇床3(TC培养36小时，得摇瓶种子液；2.种子罐种子培养基培养基可溶性淀粉3kg，酵母浸膏3kg，黄豆粉2kg，MgSO4'7H2O0.2kg，K2HP043H200.3kg，加水至200L，pH7.0。300L种子罐装200L种子培养基，接种量3L摇瓶种子液，230rpm，25"C培养48h得种子液。3.发酵培养发酵罐培养基以5000L培养基计，燕麦片200kg，黄豆粉50kg，酵母粉50kg，蛋白胨90kg，L-赖氨酸25kg，NaCl15kg，其余水。种子接种量5%(v/v)，250rpm，29。C培养125小时。10放罐所得发酵液离心得菌丝，甲醇浸泡后浸泡液HPLC检测效价为650ug/ml。将所得的发酵液过滤菌体，经甲醇萃取浓縮后，再通过色谱层析、萃取、结晶等纯化工艺获得西罗莫司纯品，产品收率为33.4°/。。权利要求1.一种吸水链霉菌ZJQ60115(StreptomyceshygroscpicusZJQ60115)，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO.M207200，保藏日期为2007年12月14日。2.如权利要求1所述的保藏号为CCTCCNO.M207200的菌株在发酵制备西罗莫司中的应用。3.如权利要求2所述的保藏号为CCTCCNO.M207200的菌株在发酵制备西罗莫司中的应用，其特征在于该制备方法包括下列步骤a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCCNO.M207200的菌株；b.将发酵菌株接种在固体培养基上，培养1520天，收集菌株的孢子制成孢子甘油管，按摇瓶种子培养基体积的0.51%的接种量接入种子培养基，200240rpm，培养3648小时，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按种子罐培养基体积12%的接种量接种于种子罐培养基，150250rpm，发酵培养48~54h，得罐种子；将罐种子液按发酵培养基体积510%的接种量接种于发酵罐培养基，150250rpm，发酵培养120~168小时，收集发酵液；其中培养温度均为2530°C。4.如权利要求书3所述的保藏号为CCTCCNO.M207200的菌株在发酵制备西罗莫司中的应用，其特征是，所述的固体培养基为燕麦片琼脂斜面；摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.52g，氮源0.53g，无机盐00.5g，其余为水；种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.52g，氮源l3g，无机盐0.10.5g，其余为水；发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源4~12g，氮源l4g，无机盐0.1lg，氨基酸0.05~0.5g，其余为水。5.根据权利要求4所述的保藏号为CCTCCNO.M207200的菌株在发酵制备西罗莫司中的应用，其特征为，摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.51.5g，氮源l2.5g，无机盐00.3g，其余为水；种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中，碳源0.5~1.5g，氮源l2.5g，无机盐0.10.3g，其余为水；发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为每1OOml培养基中，碳源6~10g，氮源1.53g，无机盐0.30.8g，氨基酸0.10.4g，其余为水。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征是所述的碳源选自面粉、甘油、淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆汁、麦芽汁、土豆浸出粉、燕麦片中的一种或几种；所述的氮源选自玉米浆、蛋白胨、鱼胨、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母粉、酵母浸膏、黄豆粉、棉子粉、氨水、硝酸盐中的几种，无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种；氨基酸为L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是所述的碳源为面粉、燕麦片、甘油、葡萄糖中的一种或几种；氮源为黄豆粉、酵母粉、蛋白胨中的几种;无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾中的一种或几种氨基酸为L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸中的一种或几种。全文摘要本发明公开了一种吸水链霉菌及其应用，该菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO.M207200，保藏日期为2007年12月14日。本发明所述的保藏编号为CCTCCNO.M207200的菌株是目前分离到的一种天然高单位的西罗莫司产生菌，发酵性能优良。本发明的西罗莫司产生菌发酵单位达到600ug/ml以上，发酵副产物相对较少，降低了后提取的难度，产品收率可达30％以上，适应于工业化生产。文档编号C12N1/20GK101486976SQ20081001920公开日2009年7月22日申请日期2008年1月16日优先权日2008年1月16日发明者卿亚丽,健朱,陈晓霞申请人:杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司