一种活性乳酸乳球菌制品的制备方法

专利名称：：一种活性乳酸乳球菌制品的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种乳酸乳球菌制品的制备方法，特别是涉及一种可高效低成本的表达苯丙氨酸解氨酶的活性乳酸乳球菌制品的制备方法。
背景技术：
：苯丙氨酸(phenylalanine,phe)是人体必须氨基酸的一种，正常人从饮食中摄入及体内再循环利用的苯丙氨酸，除少部分被直接利用外，大部分在肝脏的苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase,PAH)的作用下转化成为酪氨酸后被利用。患有常染色体隐性遗传病——苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)的患者，由于苯丙氨酸羟化酶基因缺陷，导致肝脏的PAH酶活性降低或缺如，无法将苯丙氨酸转化成为酪氨酸，致使苯丙氨酸通过其他途径转化为苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸等。这些非正常代谢产物在血、脑脊液和其他组织中大量积累，对各种组织特别是脑组织造成不可逆损伤。PKU患者的主要临床表现是智力低下，癫痫发作和黑色素减少。目前国际上通用的治疗PKU方法是低苯丙氨酸饮食控制疗法。该方法需从患儿一出生起即给予低苯丙氨酸特制奶粉和食物，同时严格限制正常食物的摄入，并且根据各生长发育阶段和个体的差异随时调整饮食控制量，直至智力发育基本成熟，g卩17-18岁。由于苯丙氨酸在日常饮食中普遍、大量存在，饮食控制难度极大且容易造成患儿其它必需氨基酸缺乏引起体质下降、生长发育迟滞等副作用。而人工合成的低苯丙氨酸食品品种少、口感差、价格昂贵，实际应用中患者由于常年无法食用正常饮食而极其痛苦，少有能坚持饮食控制十几年者，因此极大地影响了治疗质量。国际上80年代初就开始研究酶法治疗PKU，主要是采用逆转录病毒和重组腺病毒载体介导的方法，来实现PAH在PKU模型小鼠的肝细胞表达。主要问题是g移效率低，免疫原性强，外源基因在细胞中只能短期表达，同时存在安全性隐患，因此至今未见用于临床的报道。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase，PAL)广泛存在于各种绿色植物和少数微生物中，它可以催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，因此有希望口服该酶治疗PKU。由于植物和酵母等生产的天然PAL量极少，提取成本很高，因此通过基因工程方法获取大量PAL成为研究的重点。《中国病理生理杂志》2000年16巻第1期第12页公布了一种水稻苯丙氨酸解氨酶基因在大肠杆菌BL21DE3中的表达方法，融合蛋白His6—rPAL主要以包涵体形式存在，诱导7小时后逸高峰，表达蛋白量占菌体总蛋白量的35.43%。由于大肠杆菌为人体致病菌，其活菌禁止直接口服应用。但该菌超声破碎后提取的粗酶比活性很低，仅为0.46U/g。原因可能是PAL在生物体外极不稳定。中国专利02117216.1公布了"一种治疗苯酮尿症的药物及其制造方法与应用"技术，将苯丙氨酸脱氨酶基因转入肠道正常菌中表达有活性的PAL酶，通过口服转基因工程菌，利用PAL酶在消化道内将phe转化为肉桂酸，从而降低食物来源中phe进入血液的量，达到治疗疾病的同时保持较正常饮食的目的。《生物工程学报》2002年18巻第6期第713页公布了利用上述技术在乳酸乳球菌(丄./ac&)NICE系统表达欧芹PAL的结果，其使用翻译融合型载体p。(NZ8048-PAL)和转录融合型载体p(NZ8048-PAL)在乳酸乳球菌中表达的欧芹PAL，表达量分别占总蛋白的5.16%和2.76%。该技术的明显缺陷在于表达产物产率很低，乳酸乳球菌的产量也低，因此成本极高，限制了其实际应用。
发明内容本发明的目的是提供一种高效低成本的表达苯丙氨酸解氨酶的活性乳酸乳球菌制品的制备方法。该发明克服了上述缺点，采用了高效表达的菌种和发酵培养条件，提高了产率、产为了实现上述发明目的，本发明釆用的技术方案，包括菌种的构建(质粒构建、连接、转化、筛选)、配制发酵培养基、菌种活化、接种发酵、收菌和干燥工艺过程为了提高欧芹PAL基因在乳酸乳球菌中的表达效率，本发明在菌种构建过程中采用了乳酸乳球菌偏爱密码子1)质粒构建以质粒pET23b-PAL中PAL基因片段为模板，将欧芹PAL上密码子全部改变为乳酸乳球菌偏爱密码子，并进行人工合成得到全长2.2kb的PALcDNA(PAL311);2)连接将PALT与适当表达载体相连接形成重组表达载体；3)转化将重组表达载体转化感受态的乳酸乳球菌(L/M^);4)筛选筛选获得高效表达菌株采用本发明技术可使表达效率大幅提高，使PAL蛋白表达达到总蛋白量12%以上。为了提高表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的产量，本发明在发酵过程中采用了添加氢氧化钠和盐酸的方法自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.5-7.5，避免了乳酸乳球菌发酵过程中因乳酸产物积累，pH过酸对发酵的抑制作用，延长了菌体对数生长期一倍以上，使表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的产量明显提高。为了进一步提高表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的产量，本发明还采用了经优化的发酵培养基配方，1L培养基中含有蛋白胨5-30g，酵母提取物2.5-15g，乳糖或葡萄糖5-30g，MgS04.7H200.2-0.5g，MnS04.H200.05國0.1g，NaAc.3H203.3g，KH2P042g，Tween-800.5-5ml，pH值6.5-7.5。该技术的优点是提供适当的碳源、氮源及合理的碳/氮比例，在培养基中添加促进工程菌生长的微量元素MgS04、MnS04及对表达产物有利的稳定剂Tween-80，在保证充分发酵所需能量的同时，避免酸性产物的大量堆积，减少原材料浪费，降低了成本。因乳酸乳球菌发酵最适pH值为6.0-6.5，而PAL酶保存最适pH值为7.5-9.5，为了减少发酵过程中PAL酶活力的损失，本发明采用将发酵pH值维持在6.5-7.5，温度维持在25-40°C，发酵时间控制在6-30小时，使得发酵充分的同时PAL酶活力得到最佳保护。为减少外源基因PAL过早表达对乳酸乳球菌生长的不利影响，本发明采用当发酵液光齊度OD值在0.3-0.6时进行诱导，诱导剂为乳链菌素(Nisin)，诱导剂终浓度为3.75-50ng/ml;为在收菌后保持乳酸乳球菌的活菌率同时有利于PAL酶的保存，本发明采用将发酵液it速离心脱水并用pH值为8.0-8.8的磷酸盐或硼酸盐缓冲液洗涤2-3次，收集菌体，25-60'C烘干6-72小时得活菌粉。本发明的特点是釆用乳酸乳球菌偏爱密码子，提高苯丙氨酸解氨酶在基因工程菌中的表达效率；通过对pH值进行调控，使pH维持在6.5-7.5之间，延长乳酸乳球菌的对数生长时间，并有利于保护PAL表达产物的活性；对培养基配方进行优化，找到最适于工程菌生长的碳源、氮源及其比例；在培养基中添加促进工程菌生长的微量元素及对表达产物有利的稳定剂；在菌体密度达到0.3-0.6时使用最佳诱导浓度诱导，使得诱导表达量和菌体得率达到最佳平衡；屏弃冻干等高能耗的活菌保存方法，使用简便易行、节能环保的干燥方式同样达到良好的保存效果。采用本发明的技术，乳酸乳球菌发酵体系中菌体密度提高IOO倍，活菌得率大于10UCFU/ml，PAL表达量大于12%;所得菌体具有高效转化苯丙氨酸生成肉桂酸的能力，PAL酶比活性大于50U/g;所得菌粉稳定性好，在4'C保存6个月，活菌数仍可达101C)CFU/g以上，并且PAL酶比活性无明显降低；发酵成本降低2/3。因此利用本发明可方便地大量提供低成本的PAL用于PKU治疗。具体实施例方式实施例一高效表达苯丙氨酸脱氨酶的基因工程乳酸乳球菌制备1、以质粒pET23b-PAL中PAL基因片段为模板，将欧芹PAL上密码子全部改变为乳酸乳球菌偏爱密码子，并进行人工合成得到PAL"t，所用的引物为Tl:5'-GAGAACGGTAACGGTGCAACTAC國3'，T2:5'-GCTCTAGAGCATGTCAGTTAAC-3'。T2含XbaI酶切位点；2、PAL^经T4DNA聚合酶处理后，再用XbaI酶切，得到具有乳酸乳球菌偏爱密码子的cDNA片段；3、用NcoI酶切表达载体pNZ8149,并与具有乳酸乳球菌偏爱密码子的cDNA片段连接;4、用上述重组质粒转化感受态的乳酸乳球菌；5、筛选被转化乳酸乳球菌中的高效表达菌株；6、配制发酵培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L:蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，乳糖5g，MgS04.7H200.25g，MnS04.H200.05g，NaAc.3H2O3.3g,KH2P042g，Tween-800.5ml，其余为水，pH值7.0;7、将菌种进行常规活化，活化种子液按l:50比例接种发酵培养基；8、发酵温度为3(TC，发酵时间为18小时；9、当发酵液光密度OD值在0.3时用乳链菌素进行诱导，诱导剂终浓度为7.5ng/ml;10、发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸的方法调节pH值，使pH值维持在6.5-7.5之间；11、发酵结束，发酵液经高速离心(8000rpm/分，离心20分钟)脱水并用pH8.0的O.lmol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，收集菌体，60'C烘干，4X:密封避光保存。实施例二本发明中乳酸乳球菌表达PAL酶活力测定将实施例一收集的菌体用pH8.8的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(含有10mM苯丙氨酸)配制成lmg/ml悬液，3(TC反应1小时，分别在0，15，30，45，60分钟收集反应上清液，用分光光度法测定转化产物肉桂酸的生成量，并计算出菌体中PAL酶的比活。实施例三本发明治疗苯丙酮尿症的药效学鉴定给基因缺陷苯丙酮尿症模型小鼠词喂本发明实施例一中得到的菌体，用法为每日单次R服，0.5g/只，连续7天，结果表明，用药小鼠血液中苯丙氨酸水平均明显低于对照鼠，两组有显著性差异(PO.Ol)。实施例四本发明不同制备工艺的产量、产率比较表1中配方1为常规乳酸菌培养基M17，配方2为实施例一中优化培养基配方表1、不同培养培养基和pH值产量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2中培养基为经本发明优化的培养基配方，发酵条件均为经本发明优化的培养条件。表2、不同诱导剂浓度产量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其制备过程包括如下步骤1)质粒构建以质粒pET23b-PAL中PAL基因片段为模板，将欧芹PAL上密码子全部改变为乳酸乳球菌偏爱密码子，并进行人工合成得到全长2.2kb的PALcDNA(PALart)；2)连接将PALart与适当表达载体相连接形成重组表达载体；3)转化将重组表达载体转化感受态的乳酸乳球菌(L.lactis)；4)筛选筛选获得高效表达菌株5)配制发酵培养基6)菌种活化7)接种发酵8)诱导9)收菌10)干燥其特征是在质粒构建过程中使用了乳酸乳球菌偏爱密码子。2、根据权利要求1所述的一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述发酵培养基1L中含有蛋白胨5-30g,酵母提取物2.5-15g，乳糖或葡萄糖5-30g，MgS04.7H200.2-0.5g，MnS04.H200.05-0.1g，NaAc.3H203.3g，KH2P042g，Tween-800.5-5ml,pH值6.5-7.5。3、根据权利要求1所述的一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸的方法自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.5-7.5之间。4、根据权利要求1所述的一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述诱导条件为当发酵液光密度OD值在0.3-0.6时进行诱导，诱导剂为乳链菌素(Nisin)，诱导剂终浓度为3.75-50ng/ml。5、根据权利要求1所述的一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述发酵温度为25-3(TC，发酵时间为6-30小时。6、根据权利要求1所述的一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述收菌过程，采用高速离心脱水并用适当缓冲液洗涤2-3次收集菌体。7、根据权利要求1所述的一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是干燥采用25-6(TC烘干6-72小时。8、根据权利要求6所述的一种利用微生物菌株制备活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述适当缓冲液为pH8.0-8.8的磷酸盐或硼酸盐缓冲液中的一种。全文摘要本发明公开了一种活性乳酸乳球菌制品的制备方法，包括菌种的构建(质粒构建、连接、转化、筛选)、配制发酵培养基、菌种活化、接种发酵、收菌和干燥工艺过程，本方法采用了高表达的菌株、优化的培养基配方，为延长菌体的对数生长期采用了pH调控等方法，最终使发酵体系中菌体密度提高100倍，活菌得率大于10¹¹CFU/ml，PAL蛋白表达量大于12％；所得菌体具有高效转化苯丙氨酸生成肉桂酸的能力，PAL酶比活性大于50U/g；所得菌粉稳定性好，在4℃保存6个月，活菌数仍可达10¹⁰CFU/g以上，并且PAL酶比活性无明显降低；发酵成本降低2/3。因此利用本发明可方便地大量提供低成本的PAL用于PKU治疗。文档编号C12R1/225GK101586111SQ200810098008公开日2009年11月25日申请日期2008年5月22日优先权日2008年5月22日发明者刘金毅,孙俭波,春牛,程永庆,高天星申请人:北京三元基因工程有限公司;北京毕艾欧科技发展有限责任公司