专利名称：以SecA动力泵为靶点的抗革兰氏阴性细菌药物筛选模型及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种secA缺失的温度敏感型重组大肠杆菌，其高效表 达革兰氏阴性细菌例如绿脓杆菌secA基因。本发明还涉及一种以SecA 动力泵为靶点的新型抗革兰氏阴性细菌药物微生物细胞水平筛选模 型，其利用高效表达绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型大肠 杆菌，以及野生型大肠杆菌和绿脓杆菌，用于针对SecA动力泵靶点对
药物;选。所述模型还可用于针对候选化合物的筛选。
背景技术：
当前，革兰氏阴性细菌仍然是医院与社区感染中最重要的致病菌， 而且耐药问题在革兰氏阴性细菌的感染治疗中也越来越成为一个难 题。耐药革兰氏阴性细菌多为条件致病菌，占医院临床检出的耐药病 原菌60%~ 81%[1、 9、 10]。常见的致病菌有绿脓杆菌、大肠杆菌 及肠杆菌属、阴沟杆菌、沙雷菌属、沙门菌属、枸椽酸菌属、肺炎杆 菌、不动杆菌、流感杆菌等。耐药机制主要有细菌细胞膜通透性改 变；细菌主动外排系统；PBPs改变；产生p-内酰胺酶、钝化酶、酯 酶、乙酰转移酶等灭活酶。而解决这一问题最为有效的方法就是寻找 和发现新的作用机制的、与已有的抗生素无交叉耐药的新型抗革兰氏 阴性细菌的药物。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),又名绿脓杆菌，是 假单胞菌属中的代表菌种。最早是在1882年从病人化脓的伤口中分离 出来，但到目前为止，它仍然是一种重要的院内感染条件致病菌，常 常感染免疫力低下的病人，引起菌血症，肺炎，泌尿系统感染。近几年的研究还表明绿脓杆菌与大多数嚢性纤维化病人的发病率和死亡率
有关[4],在成年的病人中，81%的感染了绿脓杆菌[5]，绿脓杆菌中磷 脂酶C的产生与病人肺功能的降低与病情的恶化相关[6]。由于绿脓杆 菌外膜通透性低并存在着外排多种物质的主动外排系统(Active Efflux Systems),使得绿脓杆菌具有先天的多重耐药性，而当细菌 与抗生素接触后，又可以产生抗生素的修饰酶；降低抗生素作用位点 的敏感性而获得的后天的耐药性，导致经常表现对p-内酰胺类、氯霉 素类、喹诺酮类、磺胺类等多种抗生素的多重高度耐药，临床治疗十 分困难， 一旦感染，死亡率很高，已经成为临床医生面临的治疗难题 之一。因此，迫切需要发现新的抗绿脓杆菌等革兰氏阴性细菌的药物。
从成千上万个微生物代谢产物中挑选所需的抗菌药物是非常艰难 的一个过程。目前开发新型有用的微生物药物，虽然仍有很大的潜力， 但研究工作的难度越来越大，耗时越来越长，需要的资金也越来越多。 因此，针对候选微生物的简单、快速、特异的筛选模型是关键。为摆 脱筛选的盲目性，提高效率，有必要进行定靶筛选，从细菌生存所必 须的组成成分或者临床有效抗生素的作用机理和细菌的耐药4几理来i殳 计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗 菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。
为获得新抗革兰氏阴性细菌药物，本发明人引入了一个崭新的药 物作用靶点，即以SecA动力泵为靶点，通过本发明所述筛选模型， 篩选新的抗绿脓杆菌或大肠杆菌以及其它耐药菌的新化合物。
发明内容
众所周知，蛋白质的翻译是在细胞质中进行的，但是研究表明在 革兰氏阴性细菌中，大约有三分之一的蛋白质必须穿过细胞内膜运送 到周质或分泌到细胞外才能发挥它们正常的功能["。细菌中含有多种 蛋白质转运的途径，但最主要的途径,皮称之为分泌途径(secretion pathway),简称为Sec途径。大多数的分泌蛋白和一些整合膜蛋白的 转运都是通过这条途径进行的[8]。分泌蛋白是以前体的形式合成的，其氨基端都含有信号肽。它们通过共翻译或翻译后转运的形式穿过细
胞内膜[9]。这一过程是由转运酶所催化的[IO]。转运酶是由多个亚基 组成的复合体，其中的核心部分包括SecY、 SecE和SecG组成的膜整 合区以及SecA二聚体组成的外周区[11]。而其它的组分包括SecD、SecF 和YajC都不是蛋白质转运所必须的，但与蛋白质转运信道的稳定性和 转运效率有关[12]。蛋白前体以非折叠的形式，通过ATP和PMF的能量 输入形式进行跨膜转运，最终信号肽在周质中被信号肽酶水解除去。 释放的成熟蛋白或在周质伴侣分子的作用下折叠成它正确的构象或继 续被运送到细胞外或嵌合到细菌外膜中。
SecA是蛋白质转运途径中的"动力泵"，它是一种ATP酶，可通过 水解ATP产生的能量推动着多肽链穿过SecYEG信道。目前的证据表明在 转运过程中SecA在水解ATP的同时还经历着插入和脱离细胞内膜 SecYEG通道的循环，这样每一次循环可推动20多个氨基酸的连续跨膜 运动[IO]。 SecA在细菌中不可缺少，而且是细菌中所特有的，因此它 将为我们筛选抗细菌的药物提供了一个崭新、低毒的靶点。
本发明筛选模型的建立基于如下机理，即抑制SecA的ATP酶活性 的化合物，必然会在一定程度上抑制蛋白质的转运和分泌，这其中也 包括抑制革兰氏阴性细菌的外膜蛋白，这样可有利于提高其外膜的通
透性或破坏绿脓杆菌等革兰氏阴性细菌外排泵。
因此，如果将SecA的ATP酶抑制剂与其它抗生素联合使用，很可能 会降低绿脓杆菌等革兰氏阴性细菌固有的多重耐药性，从而扩大了临 床上的用药范围。另外， 一旦蛋白质转运受阻，也一定会影响到绿脓 杆菌等革兰氏阴性细菌生物膜的形成，这也可以緩解由此产生的绿脓 杆菌等革兰氏阴性细菌的耐药问题。
为了从大量的微生物代谢产物和其它来源的样品中筛选SecA的
ATP酶活性抑制剂，需要首先建立简便易行并且低成本的初筛方法。
本发明的一个方面，涉及高效表达绿脓杆菌基因的secA缺失的温 度敏感型大肠杆菌。具体的，本发明人利用绿脓杆菌基因组计划中提 供的信息，设计引物扩增绿脓杆菌的secA基因，在secA缺失的温度敏
6感型大肠杆菌B121. 19中，克隆并高效表达绿脓杆菌secA基因。
在本发明的一个实施方案中，所述高效表达绿脓杆菌secA基因的 secA缺失的温度敏感型大肠杆菌B121. 19中，绿脓杆菌secA基因的表达 可以在非允许的温度下，互补温度敏感型大肠杆菌B121. 19中发生琥珀 突变的SecA的功能，使得该重组菌林B121. 19/pET20b/pasecA能够在 42"C下生长。
在本发明的又一方面，涉及一种以SecA动力泵为靶点的新型抗绿 脓杆菌药物微生物细胞水平筛选模型，其中利用本发明所述高效表达 绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型大肠杆菌作为检定菌林， 以及野生型大肠杆菌和绿脓杆菌为对照菌株，针对SecA动力泵耙点对 候选微生物的次级代谢产物进行微生物细胞水平的抗绿脓杆菌药物筛 选。
在本发明的一个实施方案中，采用本发明所构建的细胞水平抗绿 脓杆菌药物筛选模型，以所述重组菌抹B121. 19/pET20b/pasecA作为检 定菌，依据在42。C下是否抑制大肠杆菌和绿脓杆菌SecA蛋白的互补作 用，并联合使用野生型的大肠杆菌、绿脓杆菌作为对照菌林，成功建 立简便廉价而且有效的初筛模型。
本发明所述细胞水平抗绿脓杆菌药物筛选模型，可用于针对微生 物的次级代谢产物进行微生物细胞水平的抗绿脓杆菌药物筛选。还可 用于针对候选化合物的进行微生物细胞水平的抗绿脓杆菌药物筛选。
本发明所述筛选模型中，针对候选微生物的刺激代谢产物的微生 物细胞水平的篩选通过包括如下步骤的方法进行
1)候选次级代谢产物的产生以及候选化合物的制备
选择合适的发酵培养基，在适于微生物次级代谢产物产生和/或累 积的条件下培养微生物。
本领域普通技术人员，能够根据待培养的微生物类型，以及期望 的候选微生物所产生的次级代谢产物，选择合适的发酵培养基和培养 条件。为实现微生物的生长和次级代谢产物的累积，通常采用液体培 养基进行发酵培养。对于以产生大量次级代谢产物而著称的放线菌目中的微生物，包 括但不限于，例如链霉菌、小单孢菌、诺卡菌等为实现微生物的发酵
和次级代谢产物的累积，通常在26 - 30°C,例如为28r下，采用液体 培养基，振荡摇瓶培养例如约36 - 120小时，例如为约48 - 96小时，或 者例如约为72 - 96小时。
为便于进行篩选，通常将经过上述发酵获得的发酵液采用例如离 心沉淀等本领域公知的方法除去微生物菌体，以上清液作为样品经过 适当的梯度稀释用于进行筛选。
对于候选次级代谢产物累积在微生物体内的情形，可以通过将例 如离心沉淀等方式获得的微生物菌体，经过例如细胞破碎机等本领域 z〉知的方式细胞石皮损后，再次采用高速离心沉淀的方式去除细胞碎片， 以上清液作为样品经过适当的梯度稀释用于进行筛选。
对于候选产物为化合物的情形，可以将待测化合物以适当的溶剂 溶解后经过适当的梯度稀释，制成待测样品。本领域普通技术人员知 晓如何根据待选择的化合物性质选择适当的无机和或有机溶剂，包括 但不限于，水、生理盐水、磷酸緩沖盐液、二甲基亚砜，
2)篩选模型的制备
按照本领域普通技术人员知晓的方法，将固体培养基，例如TAG琼 脂培养基(10 g/L胰蛋白胨，5 g/L NaCl， A salts [IO]和O. 5%葡 萄糖，1.5%球脂)熔化，冷却到合适的温度，例如("。C左右)， 加入100jig/ml氨千青霉素和培养基体积0. 5-1. 5%的对数生长期的所 述高效表达绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型大肠杆菌作为 检定菌以及同样处于对数生长期的野生型大肠杆菌和绿脓杆菌作为对 照菌株，倒入单独的PETRI， s培养皿中，制成检定平板，待用。
3 )加样
将如上述步骤l )所得经过适当稀释的含有待测次级代谢产物的微 生物发酵产品，以适当的加样量加样于含有本发明所述筛选模型的培
8养基上。本领域普通技术人员知晓如何对含有待测次级产物的微生物 发酵产品进行适当稀释，例如浓度梯度稀释，或是进行适当地浓缩， 以便于用于本发明所述筛选模型。
为方便样品加样，通常采用按一定的顺序和/或及一定的间隔，在
如上述步骤2 )中所获得的涂布有检定菌抹和/或对照菌林的培养亚中 排列筛选用的例如无菌牛津杯或滤纸纸片等。事实上，只要能够便于 操作和方便观察实验结果，可以釆用本领域技术人员周知的任何方法 加样，所述样品的顺序和间隔完全能够由本领域普通技术人员依据常 规操作加以确定。
本发明所述筛选模型也可采用不同于上述具体加样方法的本领域 公知的其它方式进行加样，例如对于高通量药物筛选，也可以釆用机 械手或机器人按照相应的程序进行自动化点样。
4)检测及阳性样品判定
在预定的温度，如37。C (对于大肠杆菌和绿脓杆菌，对照菌)或 42°C (高效表达绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型大肠杆菌
检定菌)下，过夜培养后测定抑菌圏的大小。
作为初筛模型，抑菌圏直径大于9mm，优选大于10mm，更优选大于 llmm，特别优选大于12mm，甚至更优选大于13mm，最优选大于14mm的， 判定为具有针对SecA动力泵靶点的阳性样品。
以下结合具体实施例用于说明本发明所述的筛选模型以及相应的 筛选方法。
实施例 材料和方法
菌抹、质粒、培养基和试剂
绿脓杆菌PAOl菌林及其基因组DNA由美国佐治亚州立大学Dr. C. D. Lu惠赠;大肠杆菌DH5oc， BL21. 19 (secA13ts) [9〗，质粒pET20b，质粒pET5a/ecsecA均为美国佐治亚州立大学Dr. Tai实验室保存，温度 敏感性突变体大肠杆菌BL21. 19 (secA13ts)被用来表达大肠杆菌和绿 脓杆菌的secA基因。培养微生物细胞所用的是TAG液体培养基(IO g/L 胰蛋白胨，5 g/L NaCl， A salts [10]和O. 5%葡萄糖)和TAG液体培养 基(10g/L胰蛋白胨，5g/LNaCl， A salts [10]和O. 5%葡萄糖，1.5% 琼脂)，并加入100 ixg/ml氨苄青霉素。限制性内切酶NdeI和Hind III 购自Roche公司，TripleMaster PCR System购自eppendorf公司。 pGEM-T vector是美国p濯ega公司产品。Perfectprep Gel Cleanup Kit购自Qiagen公司。IPTG和X-gal是Sigma公司的产品。
本发明采用的分子生物学方法均按照产品供应商提供的方案或者 本领域公知的方法进行，参见例如分子克隆实验室指南(第二版)， 冷泉港出版社出版。
实施例l绿脓杆菌PAOl SecA基因的扩增和表达 PA01 secA基因扩增的引物设计
根据铜绿色假单胞菌(P. aeruginosa)基因组数据库(www. pseudomonas.com)中公开的序列数据，i殳计寡核苷酸引物
pasecAFl:5， -TCCCCACGTGTGGATGACCAAGTCCATATG-3，(SEQ ID
NO: 1 );
pasecARl: 5, - GGTGAACCAGGCGGGAAGCTTAGTC~3， (SEQ ID NO: 2)， 引物中下划线部分分别为NdeI和Hind III限制酶切位点。 PA01 SecA基因的PCR扩增
PCR反应体系包括10X反应緩冲液，dNTP混合物，pasecA Fl引 物，pasecA Rl引物，Triplemaster DNA聚合酶，PAOl基因组DNA以及 不含有核酸酶的双蒸水。反应的中体积为50pl。 PCR反应的条件为 94°C 5分钟，94。C l分钟，50°C l分钟，72°C 3. 5分钟，29个循环， 最后一步72。C IO分钟。
pGEM-T载体克隆的构建
10Triplemaster DNA聚合酶具有高保真3， -5，外切酶的活性，同时 它还保留着Taq酶的特性，其PCR产物的末端有一个单个的dA，因此可 以直接用pGEM-T载体克隆。连接反应体系如下5jul2X连接緩沖液，
pGEM-T栽体，2jal pcr产物，1 jli 1 T4连接酶，1jj1 ddH20。 PCR产物与pGEM-T载体的摩尔比应该约为3/1。 4'C反应过夜。
在冰水中解冻大约200 ja 1 DH5ot感受态细胞，加入10iul连接混 合物。通过轻轻的转动吸管头使其混匀。置于冰浴中40min。 42。C热击 45-60秒。再放入冰浴中冷却2min。加入LB液体培养基(室温)至lml， 37°C， 200rpm培养l小时。准备LB/氨千青霉素/IPTG/X-Gal (100mg/ml 氨苄青霉素，20jul 50mg/ml X-Gal， 20jj1 1M IPTG)平板。接种前 使其温度达到37。C。取200 u 1转化的细胞涂布在平板上，37'C培养过 夜。
挑取10个白色单菌落，接种至2ml含有100yg/ml氨千青霉素的 LB液体培养基中。37。C剧烈震摇培养12- 16小时。提取质粒DM，用Nde I和Hind III鉴定阳性质粒，命名为pGEM-T/ pasecA。
实施例2重组表达质并立pET20b/pasecA的构建
PA01 SecA蛋白表达质粒pET20b/pa secA的构建步骤具体如下
提取如实施例l所述制备的pGEM-T/pa secA质粒和pET20b载体。
37°C,分别用NdeI和Hind III消化两种质粒。
通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。利用Perfectprep⑧Gel Cleanup
Kit纯化待插入的片段和载体。用琼脂糖凝胶电泳估测插入片段和载
体的量。
将待插入片段与NdeI和Hind III消化后的pET20b, 14。C连接过 夜。片段和载体的摩尔比应该约为5: 1。使用10ja 1连接混合物转化DH5 oc感受态细胞。200jli 1转化细胞涂布含有氨苄青霉素的LB平板。37°C 培养过夜。选择10个单菌落，接种到2ml含有100jag/ml氨苄青霉素 的LB液体培养基中。37。C剧烈震摇12-16小时。提取质粒DNA，用NdeI 和Hind III鉴定阳性质粒。获得含有重组表达质粒pET20b/pasecA。用如上述获得的重组表达质粒pET20b/pasecA转化B121. 19感受态 细胞，获得用于本发明所述筛选模型的检定菌，并命名为 BL21. 19/pET20b/pasecA。所述检定菌是大肠埃希氏菌(^c力er/c力/a co7/)，该菌已经于2006年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏委员 会普通微生物中心(CGMCC,北京，中关村北一条，邮政编码100080 )， 保藏号为CGMCC No. 1838。
在本发明所述筛选模型中，还任选的采用了检定菌 BL21. 19/pET5a/ecsecA。所述检定菌是大肠埃希氏菌(^c力er/c力" co//)，该菌已经于2006年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏委员 会普通微生物中心(CGMCC，北京，中关村北一条，邮政编码100080 )， 保藏号为CGMCC No. 1839。
实施例3检定菌林pET20b/pasecA在BL21. 19中诱导表达绿脓杆菌 SecA蛋白
将如实施例2所述获得到所有转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的 LB平板。30t:培养过夜。选择10个单菌落进行划线纯化，挑取单菌落 接种到2ml TAG液体培养基中30X:培养过夜。取80 n l培养物接种到2ml 新鲜的TAG液体培养基中待OD600达到0. 8，加入lmM IPTG， "X2培养2 小时，釆用SDS-PAGE比较SecA蛋白的表达量。
绿脓杆菌SecA蛋白与大肠杆菌SecA蛋白的互补作用的验证 准备两个含有lmM IPTG和100pg/ml氨苄青霉素以及两个只含有 100 n g/ml氨节青霉素的TAG平板并分别平分成U份。将只含有空白质 粒的空白对照林BL21. 19/pET20b以及ll株如实施例2中构建的检定菌 BL21. 19/pET20b/ pasecA划线接种于对应的四个平板上，分别放于30 和42C培养过夜。
因为出发菌林大肠杆菌BL21. 19(secA13ts) [9]是一林secA基因发 生琥珀突变的温敏型菌抹，在30X:时能够正常生长，而在421C时，其 生长受到抑制。因此，空白对照株BL21. 19/pEn0b在^t:的条件下， 能够正常生长，而在42C时则不生长，在培养基平板上没有菌落出现。 而BL21. 19/pET20b/pasecA在30和42t:时均能很好地生长，初步说明在非允许的温度下(42°C )绿脓杆菌SecA蛋白能够互补大肠杆菌BL21. 19 中突变的SecA蛋白的功能。
为了进一步确定绿脓杆菌SecA蛋白与大肠杆菌SecA蛋白的互补作 用，分别糸匕取检定菌林BL21. 19/pET20b/pasecA和 BL21. 19/pET5a/ecsecA和空白对照林BL21. 19/pET20b单菌落，在含有 100Mg/ml氨千青霉素的TAG平板划线，直至出现单菌落。分别放于30 和42。C培养过夜。其中，菌林BL21. 19/pET5a/ecsecA用作阳性对照林， 该工程菌抹中所含的质粒包括大肠杆菌自身的secA基因，所以在非允 许的温度下(42。C)大肠杆菌野生型的SecA蛋白可以完全互补大肠杆 菌BL21. 19中突变的SecA蛋白的功能，能够正常生长。
空白对照林BL21. 19/pET20b在30。C的条件下，在培养基平板上可 出现单菌落，在42。C时则不生长，在培养基平板上没有菌落出现。阳 性对照BL21. 19/pET20b/ecsecA在30。C时可正常生长，而在WC时可得 到单菌落。而BL21. 19/pET20b/pasecA在30和WC时均能很好地生长， 都可得到单菌落。进一步说明在非允许的温度下("。C )绿脓杆菌SecA 蛋白能够互补大肠杆菌BL21. 19中突变的SecA蛋白的功能。
实施例4
利用本发明所述筛选模型进行微生物细胞水平上以SecA蛋白为靶 点的阳性样品-SecA蛋白抑制剂的篩选
选用实施例2中所得的能够高效表达绿脓杆菌SecA的大肠杆菌重 组工程菌B121. 19/pET20b/pasecA作为检定菌，野生型的大肠杆菌和绿 脓杆菌作为对照，进行微生物细胞水平上以S e c A蛋白为靶点的阳性样 品-SecA蛋白抑制剂的筛选
1)篩选模型的制备 -
检定菌的培养方法如下将分别保存于斜面培养基上待用的实施 例2中所得检定菌抹B121. 19/pET20b/pasecA、野生型大肠杆菌和绿脓 杆菌，接种至2ml LB/TAG液体培养基培养，3丌C,振荡培养过夜。 按照本领域普通技术人员知晓的方法，将固体培养基TAG琼脂培养基
13(10g/L胰蛋白胨，5 g/L NaCl， A salts [10]和O. 5%葡萄糖，1.5% 琼脂)熔化，冷却到合适的温度，例如45。C左右，加入10(^g/nil氨 苄青霉素和O. 5-1. 5。/。的对数生长期的所述高效表达绿脓杆菌secA基因 的secA缺失的温度敏感型大肠杆菌、作为检定菌以及同样处于对数生 长期的野生型大肠杆菌和绿脓杆菌作为对照菌林，倒入单独的PETRI， s培养皿中，制成检定平板，待用。待平板凝固后。将蘸有待测样品(从 自然环境分离得到的微生物的发酵样品或者候选化合物)的纸片按一 定的顺序及一定的间隔贴到含有检定菌的培养基上，在预定的温度[37 °C (使用大肠杆菌，绿脓杆菌作为检定菌时)或42'C (使用 B121. 19/pET20b/ pasecA和B121. 19/pET5a/ecsecA作为检定菌时)] 下，过夜培养后测定抑菌圏的大小。
实施例5利用筛选模型对微生物发酵样品进行筛选的方法和结果 利用实施例4所述筛选模型，对于含有次级代谢产物的候选微生物 发酵样品，通过如下方法进行筛选
将微生物菌林I06A-00985接种到放线菌发酵培养基A2 ( 0. 5%葡萄 糖，0. 5%酵母浸膏，0. 5%蛋白胨，0. 5%牛肉青，0. 4%玉米浆，1. 0%黄 豆饼粉，2. 0%淀粉，0.4% CaC03)中，28 。C摇瓶培养96小时，取7ml 发酵液在5， OOOrpm条件下离心，得到上清，用9mm纸片沾取发酵液上 清，放于含有本发明所述筛选模型的含有IOO ^g/inl氨苄青霉素的固 体TAG ( 10 g/L胰蛋白胨，5 g/L NaCl， A salts [IO]和O. 5%葡萄 糖)培养基上，其中所述筛选模型包括O. 5%检定菌，即实施例4中所列 举的B121. 19/pET20b/pasecA和阳性对照林B121. 19/pET20b/ecsecA， 以及野生型的大肠杆菌和绿脓杆菌；在预定的温度37。C (使用大肠杆 菌，绿脓杆菌作为检定菌时)或42。C (使用重组菌抹 B121. 19/pET20b/pasecA和B121. 19/pET5a/ecsecA作为检定菌时)下，
过夜培养后测定抑菌圏直径的大小。
结果表明，微生物菌林I06A-00985的发酵液在WC条件下抑制 B121. 19/pET20b/pasecA的生长，抑菌圈直径为17mm，但在同样条件下不抑制B121. 19/pET5a/ecsecA的生长，说明所述微生物发酵液特异性 抑制绿脓杆菌的SecA蛋白的活性。所述微生物发酵液还在37'C条件下 抑制绿脓杆菌PA01的生长，抑菌圏直径为ll. 5mm，但在同样条件下不 抑制大肠杆菌的生长。以上得到的两个抑菌圏直径值都大于9mm,因此， 微生物菌林106A-00985判定为本发明筛选模型所篩选得到的阳性菌 林。
实施例6利用筛选模型对待测化合物样品进行篩选的方法和结果 将待测化合物2004B69的10mg/ml的母液稀释500倍，将9mm纸片沾 取待测化合物稀释液，放于含有本发明所述筛选模型的含有IOO jag/ml 氨苄青霉素的固体TAG ( 10 g/L胰蛋白胨，5 g/LNaCl， A salts [10] 和O. 5%葡萄糖)培养基上，其中所述筛选模型包括O. 5%检定菌，即实 施例4中所列举的B121. 19/pET20b/pasecA和阳性对照林 B121. 19/pET20b/ecsecA，以及野生型的大肠杆菌和绿脓杆菌；在预定 的温度37'C (使用大肠杆菌，绿脓杆菌作为检定菌时)或42。C (使用 重组菌4朱B121. 19/pET20b/pasecA和B121. 19/pET5a/ecsecA作为检定
菌时)下，过夜培养后测定抑菌圈直径的大小。
结果表明，20ng/ml的化合物2004B69在42 。C条件下抑制 B121. 19/pET20b/pasecA的生长，抑菌圏直径为14mm，将化合物 2004B69稀释到15jug/ml和10ng/ml，抑菌圈直径仍可达到12mm和10mm。 但在同种条件下不抑制B121. 19/pET5a/ecsecA的生长。
上述实验结果说明，所述化合物2004B69可特异性抑制绿脓杆菌的 SecA蛋白的活性。但同样浓度的化合物2004B69在37'C条件下不抑制绿 脓杆菌PA01的生长，可能是该化合物不容易透过绿脓杆菌的外膜所造 成的。在以上得到的抑菌圏直径值大于9mm，所述化合物2004B69为本
发明筛选模型筛选得到的阳性化合物。
利用本发明所述筛选模型，本发明人从4507个放线菌、真菌，放 线细菌以及我们所分离得到的 一些难分离培养微生物的发酵样品以及 360个化合物样品中，初筛得到在细胞水平上作用于大肠杆菌SecA的阳性菌林320林，阳性化合物28个；作用于绿脓杆菌SecA的阳性菌林446
林，阳性化合物32个；抗绿脓杆菌的阳性菌林250抹，阳性化合物8个；
既作用于大肠杆菌SecA又作用于绿脓杆菌SecA并且抗绿脓杆菌的阳性
菌抹66林；这些阳性发酵样品将成为以绿脓杆菌SecA为靶点的酶水平
模型筛选的候选样品，其中作用于绿脓杆菌SecA的446林阳性菌林和65
个阳性化合物和只作用于绿脓杆菌SecA和绿脓杆菌的17林阳性菌株是
优选的研究对象。
参考文献
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1权利要求
1、一种高效表达绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型重组大肠杆菌，其中含有重组质粒pET20b/pasecA。
2、 权利要求l的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌是大肠埃希氏菌 (&c/ er2'c力/a co//),其保藏号为CGMCC No. 1838。
3、 一种以SecA动力泵为乾点的新型抗绿脓杆菌药物微生物细胞 水平筛选模型，其特征在于使用权利要求l所迷的重组大肠杆菌作为检 定菌。
4、 权利要求3的筛选模型，其中所述权利要求l的重组大肠杆菌处 于对数生长期，占培养基体积的O. 5-1.5%。
5、 权利要求3的篩选模型，其还采用野生型大肠杆菌和绿脓杆菌 作为对照。
6、 权利要求3的筛选模型用于针对SecA动力泵靶点对候选微生物 的次级代谢产物和/或候选化合物进行微生物细胞水平的抗绿脓杆菌 药物筛选的用途。
7、 一种以SecA动力泵为乾点的新型抗绿脓杆菌药物之微生物细胞 水平筛选方法，包括采用占培养基体积0， 5-1. 5%的对数生长期的权利 要求l所述的重组大肠杆菌作为检定菌，其中，分别在37C培养作为对 照菌林的野生型大肠杆菌和绿脓杆菌，在42t:下培养权利要求l所述的 重组大肠杆菌，测定抑菌圏的大小，确定阳性样品。
8、 权利要求7所述的筛选方法，其中培养时间为约12-24小时，优选为16 — 18小时。
9、权利要求7所述的筛选方法，其中所得抑菌團直径大于9mm，优 选大于10mm，更优选大于llmm，特别优选大于12mm，甚至更优选大于 13mm，最优选大于14mm的样品判定为具有针对SecA动力泵靶点的阳性样品o
全文摘要
本发明涉及一种高效表达革兰氏阴性细菌例如绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型重组大肠杆菌，一种以SecA动力泵为靶点的新型抗革兰氏阴性细菌药物微生物细胞水平筛选模型，其利用高效表达绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型大肠杆菌，以及野生型大肠杆菌和绿脓杆菌，用于针对SecA动力泵靶点对候选微生物的次级代谢产物进行微生物细胞水平的抗革兰氏阴性细菌药物筛选。所述模型还可用于针对候选化合物的筛选。
文档编号C12R1/19GK101580814SQ20081009781
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者余利岩, 刘红宇, 司书毅, 孙承航, 张玉琴, 李秋萍, 赵莉莉, 魏玉珍 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所