专利名称：：一种扬子鳄卵壳膜中提取dna的试剂盒及使用方法
技术领域：
：本发明涉及一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒及使用方法。
背景技术：
：扬子鳄w>^m&)属爬行纲、鳄目、鼍科、鼍属，因起源于距今两亿多年与恐龙同时代的中生代，而被称为"活化石"，是世界上现有23种鳄中最濒临灭绝的物种之一，被国际自然和自然资源保护联盟(IUCN)列为极危级，CITES附录I物种，属于国家一级保护野生动物。目前扬子鳄的野生种群数量约为120—140条，并仍以每年4%—6%的速率下降，濒于灭绝，急需人工恢复其基因流。扬子鳄词养种群在某些方面存在近亲衰退的现象(吴孝兵等，1999)，导致血缘关系混乱，谱系不清，因此进行扬子鳄的分子生态学研究，最大限度保持遗传多样性，对该物种的保护具有重要意义。目前，分子生态学在保护生物学及繁殖生态学中得到广泛的应用，进行分子生态学研究的首要工作是分析样品的采集。常用的取样方法有3种，即伤害性取样(destructivesampling)、非伤害性取样(nondestructivesampling)、非损伤性取样(noninvasivesampling)。伤害性取样就是通过杀死动物而获得新鲜肌肉、肝脏和血液等组织样品。这种取样方法对非珍稀动物来言是可行的，但对珍稀濒危动物而言既不科学也不可行。非伤害性取样是通过对捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛、耳、尾或趾等分析样品。该方法不致于导致动物死亡，但对珍稀濒危动物的生理、习性均造成伤害。非损伤性取样法，即在不捕获、触及、甚至未亲眼见到动物的情况下，收集不同形式的样品获取样品中的DNA。样品包括脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、含口腔脱落细胞的食物残渣、鹿角、鱼鳞等。由于非损伤性取样的广泛性、随机性和便利性，使其在物种鉴别、个体识别(亲子鉴定)、性别鉴定、种群遗传结构分析等方面得到广泛的应用。目前大多数DNA的提取方法对样品材料的要求较严格，需要足够的样本量，而不利于某些特殊领域的研究，例如珍稀瀕危野生动物的DNA分析，物种鉴定等领域。现有方法中，多利用生产试剂盒进行提取，这些试剂盒虽然能快速提取，但一般只适用于血液或其他组织材料，不适用于非损伤性材料DNA提取。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种通用性好、可靠性高的从扬子鍔卵壳膜中提取DNA的试剂盒及使用方法。本发明解决技术问题的技术方案为一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒，包括以下试剂(a)试剂A:为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；(b)试剂B:为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，所述的磷酸盐缓冲液(B1):含有137±5mMNaCl;2.7±0.5mMKC1;10±5mMNa2HP04;2±0.5mMKH2P04;所述的STE缓冲液(B2):含有1±0.5MTris-HClpH8.0、0.5±0.1MEDTA、5±1MNaCl;(c)试剂C:裂解液l,含有50士10mMTris-HClpH8.0、1±0.5mMEDTApH8.0、150±10mMNaCl、1±0.5mol/L二硫苏糖醇(DTT)、浓度是(w/v)为20±10%十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20士5mg/ml蛋白酶K;(d)试剂D:裂解液2，含有20±10mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2±0.1%卩画巯基乙醇；(e)试剂E:提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25:24:1;(f)试剂F:提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24:1。优选的试剂盒为(a)试剂A:为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；(b)试剂B:为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，所述的磷酸盐缓冲液(B1):含有137mMNaCl;2.7mMKCl;10±mMNa2HP04;2mMKH2P04;所述的STE缓冲液(B2):含有1MTris-HClpH8.0、0.5MEDTA、5MNaCl;(c)试剂C:裂解液1，含有50mMTris-HClpH8.0、1mMEDTApH8.0、150mMNaCl、1mol/L二硫苏糖醇(DTT)、浓度(w/v)为20e/。十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20mg/ml蛋白酶K;(d)试剂D:裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2%|3-巯基乙醇；(e)试剂E:提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25:24:1;(f)试剂F:提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24:1。所述的试剂盒的使用方法为(1)样品保存在野外，采集不同窝卵已孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存(-2(TC—7(TC)，避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；(2)样品预处理从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10-20分钟，去除含保存液的杂质。接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗漆，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温干燥；(3)第一次裂解取浸泡洗涤后2-4mn^的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55"C水浴振摇，消化12-24h;(4)第二次裂解将第一次裂解后的液体加入30pl的试剂D，继续消化6-8小时；(5)第一次提取将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取一次；(6)第二次提取将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取数次，至中央无蛋白层为止。(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2-3倍体积的冰冻无水乙醇，-10—-20°(:保存6小时，离心，所得沉淀用70%乙醇洗涤两次后，在超净台风干，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4'C保存备用。在非损伤性取样中，卵壳膜是一种理想的分析样品1、在野外，动物繁殖孵化期后，留在窝中的残留卵壳，样品充足，易于采集；2、卵壳膜样本在不接触甚至看不到动物的情况下获得，对动物的千扰和伤害小，同时在研究大型濒危野生动物时也保护了采样人的人身安全；3、在对濒危动物野生种群的个体数量、性别比例以及某些大型动物的个体活动范围等进行研究时，较捕获动物本身而言，采集卵壳膜可以降低采样的花费。本试剂盒提取的模板DNA纯度好，可用于基因扩增测序和分型，在对12SrRNA基因、线粒体D-loop区、Cyt6基因的扩增中，所有提取的壳膜DNA模板均能成功的扩增，得到与预期大小相同的片段产物，且浓度大，特异性强。在利用微卫星DNA标记特异性引物通过PCR扩增获得了分型数据，用于扬子鳄亲子鉴定。另外本方法还可以应用于其他卵生动物如龟鳖类，鸟类等DNA的提取。所得的模板DNA可广泛应用于卵生动物的种群遗传分析、分子进化、个体间亲缘关系进化等领域的各项研究。图1为实施例1的1%琼脂糖凝胶电泳示意图。图2为实施例2在12SrRNA基因扩增的电泳示意图。图3为实施例2在Cyt6基因扩增的电泳示意图。图4为实施例2在线粒体D-loop区扩增的电泳示意图。图5为实施例2微卫星Asi^i20位点的基因分型结果图。图6为实施例2微卫星As&8位点的基因分型结果图。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细的说明。实施例1:本实施例所用的试剂盒的试剂按下列配方进行配制(a)试剂A:为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；(b)试剂B:为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，所述的磷酸盐缓冲液(B1):含有137mMNaCl;2.7mMKCl;10mMNa2HPO4;2mMKH2P04;所述的STE缓冲液(B2):含有1MTris-HClpH8.0、0.5MEDTA、5MNaCl;(c)试剂C:裂解液1，含有50mMTris-HClpH8.0、1mMEDTApH8.0、150mMNaCl、1mol/L二硫苏糖醇(DTT)、质量浓度为20。/。十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20mg/ml蛋白酶K;(d)试剂D:裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2%(3-巯基乙醇；(e)试剂E:提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25:24:1;(f)试剂F:提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24:1。按以下步骤提取扬子鳄卵壳膜DNA:(1)样品保存在野外，采集不同窝卵已孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存(-20°C)避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；(2)样品预处理从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10分钟，去除含保存液的杂质。接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗涤，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温干燥；(3)第一次裂解取浸泡洗漆后2-4mm2的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55'C水浴振摇，消化12h;(4)第二次裂解将第一次裂解后的液体加入30pl的试剂D，继续消化6小时；(5)第一次提取将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液.，离心取上清液后，同法再提取一次；(6)第二次提取将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取2次，至中央无蛋白层为止。(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，-20匸保存6小时，离心，所得沉淀用70%乙醇洗涤两次后，在超净台风干，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4"C保存备用。将实施例取得的DNA模板进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图1所示。实施例2:本实施例所用的试剂盒的试剂按下列配方进行配制(a)试剂A:为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；(b)试剂B:为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，所述的磷酸盐缓冲液(B1):含有135mMNaCl;3.0mMKC1;10mMNa2HP04;1.5mMKH2P04;所述的STE缓冲液(B2):含有1.5MTris-HClpH8,0、0.5MEDTA、6MNaCl;(c)试剂C:裂解液1，含有50mMTris-HClpH8.0、0.5mMEDTApH8.0、100mMNaCl、1mol/LmM二硫苏糖醇(DTT)、浓度(w/v)为10%十二垸基苯磺酸钠(SDS)、20mg/ml蛋白酶K;(d)试剂D:裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为1%p-巯基乙醇；(e)试剂E:提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25:24:1;(f)试剂F:提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24:1。按以下步骤提取扬子鳄卵壳膜DNA:(l辨品保存在野外，采集不同窝卵已孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存(-l(TC)避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；(2)样品预处理从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10分钟，去除含保存液的杂质。接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗涤，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温干燥；(3)第一次裂解取浸泡洗涤后2-4mm2的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55'C水浴振摇，消化24h;(4)第二次裂解将第一次裂解后的液体加入20^的试剂D，继续消化8小时；(5)第一次提取将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取一次；(6)第二次提取将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取2次，至中央无蛋白层为止。(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，-20°(3保存8小时，离心，所得沉淀用70%乙醇洗涤两次后，在超净台风千，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4"C保存备用。将实施例2在l2SrRNA基因、、Cytb基因、线粒体D-loop区PCR扩增PCR反应体系为25jil，包括10xbuffer3)il，MgCl2(25mmol/L)2^1、dNTP(25mmol/L)1^1、上下游引物(10pmol/L)各1^1，DNA模板ljnK20-50ng)、TaqDNA聚合酶lU，加适量ddH20。PCR反应条件为94'C预变性4min;94°C45s，53。C-55。C退火温度40s，72°C40s，30个循环；最后72。C延伸10min。12SrRNA基因、、Cytb基因、线粒体D-loop区扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，如图2、3、4所示。将实施例2在微卫星荧光标记引物扩增PCR反应体系为25pl，包括10xbuffer3pl，MgCl2(25mmol/L)2pL、dNTP(25mmol/L)1^1、上下游引物(10pmol/L)各基因组DNAlpl(20-50ng)、TaqDNA聚合酶lU，加适量ddH20。PCR反应条件为94。C预变性4min;94°C45s，适宜退火温度40s，72°C40s，30个循环；最后72。C延伸10min。微卫星标记引物如表1所示。PCR产物应用ABI377自动测序仪全基因组扫描，做STR分型，当扩增产物在测序仪中电泳时，数据釆集软件会自动收集电泳中扩增产物所带的荧光信号，将信号直接转换成GeneScan中的电泳图，应用Genotyper2.1软件对基因型进行判读。如图5、图6所示。表1扬子鳄5个微卫星座位的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1.一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒，其特征在于包括以下试剂(a)试剂A为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；(b)试剂B为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，所述的磷酸盐缓冲液(B1)含有137±5mMNaCl；2.7±0.5mMKCl；10±5mMNa2HPO4；2±0.5mMKH2PO4；所述的STE缓冲液(B2)含有1±0.5MTris-HClpH8.0、0.5±0.1MEDTA、5±1MNaCl；(c)试剂C裂解液1，含有50±10mMTris-HClpH8.0、1±0.5mMEDTApH8.0、150±10mMNaCl、1±0.5mol/L二硫苏糖醇(DTT)、浓度是(w/v)为20±10％十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20±5mg/ml蛋白酶K；(d)试剂D裂解液2，含有20±10mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2±0.1％β-巯基乙醇；(e)试剂E提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25241；(f)试剂F提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为241。2、根据权利要求1所述的一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒为(a)试剂A:为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；(b)试剂B:为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，所述的磷酸盐缓冲液(B1):含有137mMNaCl;2.7mMKCl;10±mMNa2HP04;2mMKH2P04;所述的STE缓冲液(B2):含有1MTris-HClpH8.0、0.5MEDTA、5MNaCl;(c)试剂C:裂解液1，含有50mMTris-HClpH8.0、1mMEDTApH8.0、150mMNaCl、1mol/L二硫苏糖醇(DTT)、浓度(w/v)为20。/。十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20mg/ml蛋白酶K;(d)试剂D:裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2%(3-巯基乙醇；(e)试剂E:提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25:24:1;(f)试剂F:提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24:1。3、权利要求1或2所述的扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒的使用方法为(1)样品保存在野外，釆集不同窝卵己孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存(-20°C——7(TC)，避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；(2)样品预处理从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10-20分钟，去除含保存液的杂质。接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗涤，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温十燥；(3)第一次裂解取浸泡洗涤后2-4mn^的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55'C水浴振摇，消化12-24h;(4)第二次裂解将第一次裂解后的液体加入30pl的试剂D，继续消化6-8小时(5)第一次提取将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取一次；(6)第二次提取将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取数次，至中央无蛋白层为止；(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2-3倍体积的冰冻无水乙醇，-10—-20卩保存6小时，离心，所得沉淀用70%乙醇洗涤两次后，在超净台风干，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4'C保存备用。全文摘要本发明公开了一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒，包括以下试剂试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E、试剂F，及其试剂盒的使用方法，本试剂盒提取的模板DNA纯度好，可用于基因扩增测序和分型，在对12SrRNA基因、线粒体D-loop区、Cytb基因的扩增中，所有提取的壳膜DNA模板均能成功的扩增，得到与预期大小相同的片段产物，且浓度大，特异性强。在利用微卫星DNA标记特异性引物通过PCR扩增获得了分型数据，用于扬子鳄亲子鉴定。另外本方法还可以应用于其他卵生动物如龟鳖类，鸟类等DNA的提取。所得的模板DNA可广泛应用于卵生动物的种群遗传分析、分子进化、个体间亲缘关系进化等领域的各项研究。文档编号C12N15/10GK101368179SQ20081012255公开日2009年2月18日申请日期2008年5月31日优先权日2008年5月31日发明者吴孝兵,鹏晏,芸胡申请人:安徽师范大学