专利名称：：扬子鳄微卫星dna标记的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种分子标记技术，特别涉及一种扬子鳄微卫星DNA遗传标记。
背景技术：
：微卫星DNA又称为短串连重复序列(STR)、简单重复序列(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)，是指基因组中以l-6个核苷酸为单位串联重复组成的核苷酸序列；其中，最常见的是双核苷酸重复是(AC/TG)n、(AG/TC)n。不同的生物个体由于重复单元的重复次数不同而显示出多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的"链滑"(strandslippage)现象造成微卫星DNA多态性信息容量(polymorphicinformationcontent,PIC)较高。微卫星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为种群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记，与等位酶、RAPD等方法相比也有一定的优越性。由于微卫星具有数量多、在基因组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检测等优点被作为优良的遗传标记(geneticmarker)而得到广泛应用。根据重复单元的构成与分布，微卫星DNA序列被分为三种类型单一型(pure),复合型(compound),间断型(interrupted),例如单一型CACACACACACACACACACA复合型CACACACACACAGAGAGAGA间断型CACATTCACACATTCATTCA扬子鳄，又称鼍，俗称猪婆龙、土龙，英文名Chinesealligator,拉丁文名(^h'《Worsi/3朋w's)，主要分布在长江中下游地区，是中国特有的一种鳢，亦是世界上体型最小的鳄品种之一。它既是古老的，又是现在生存数量非常稀少、世界上濒临灭绝的爬行动物。在扬子鳄身上，至今还可以找到早先恐龙类爬行动物的许多特征。因此，人们称扬子鳄为"活化石"。因此，扬子鳄对于人们研究古代爬行动物的兴衰和研究古地质学和，的m，都有重要意义。已有学者采用不同的分子标记技术(包括线粒体控制区、AFLP、RAPD等)对扬子鳄的遗传多样性进行研究，但是上述遗传标记不能提供足够的遗传信息，如Wang等，2003:D-loopsequencevariationofmitochondrialDNAincaptiveChinesealligator.爿"a6"e/e"'c57/2_z.ca，30，425-430;Wu等，2002:GeneticvariationincaptivepopulationofChinesealligator,"h'卵tors7'/e/7si5"，revealedbyrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD).SjWogj.ca/6b/serra"OA106,435-441;Yan等，2006:AFLPanalysisofgeneticvariationoncaptive—bredChinesealligators:anapplicationtoselectindividualsforrelease.Z。o肠j柳25(6)，479-490。为了进一步解决扬子鳄的种群内遗传变异和种群间的遗传分化，需要开发新的分子遗传标记。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于分离克隆扬子鳄微卫星DNA标记，建立扬子鳄微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行扬子鳄的分类、遗传关系的分析。本发明解决技术问题的技术方案扬子鳄微卫星DNA标记，包括扬子鳄微卫星(CT/AG)n、(AC/GT)n、(GATA)。富集文库的构建，微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到25个含有微卫星重复序列的克隆，确定了10个多态性丰富的微卫星标记Asiul、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiul22、Asiu234;Asiul为464个核苷酸、Asiu2为356个核苷酸、Asiu4为469个核苷酸、Asiu20为529个核苷酸、Asiu44为155个核苷酸、Asiu45为276个核苷酸、Asiu84为533个核苷酸、Asiu96为327个核苷酸、Asiul22为297个核苷酸、Asiu234为310个核苷酸。图1、Asiu44位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图2、Asiu45位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图3、Asiul22位点的引物扩增20个扬子鍔基因组DNA的STR分型图图4、Asiu234位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图5、Asiu96位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图6、Asiu2位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图7、Asiul位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图8、Asiu4位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图9、Asiu20位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图图10、Asiu84位点的引物扩增20个扬子鳄基因组DNA的STR分型图在图l一图10中，1一20分别代表1一20个扬子鳄。具体实施例方式下面结合附图进一步详述本发明。1:扬子鳄微卫星DNA富集文库的构建a)基因组DNA的消化与连接参照Sambrook等(2002，MolecularCloning,3nd463—471)的方法提取扬子鍔基因组DNA，并用万印1431(购自Fermentas公司)限制性内切酶进行消化。消化后的产物加入接头6"awLA(5'-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)，5"ai/LB(5，-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3，)，10XligationBuffer,T4DNAligase(购自Promega公司)于PCR仪16°C连接过夜。b)以&i/LA为引物，以上述连接产物为模板，进行PCR反应，在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下〈lkb的片段，并用凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司)进行回收。c)以回收的DNA为模板，进行PCR扩增并对其进行纯化，(纯化试剂盒购自Axygen公司)。d)寡核苷酸杂交3种链霉素标记的特异性的寡核苷酸探针[(CA)12，(AG)12,(GATA)6]与上述纯化后的DNA68'C杂交过夜。e)磁珠富集将杂交液加入己平衡好的磁珠(购自Promega公司)中，25'C温育20min，并轻轻摇动。温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液，分别用洗液I(6XSSC，0.1%SDS)，洗液II(3XSSC，0.1%SDS)，洗液III(6XSSC)清洗；用预热到65"C双蒸水重悬磁珠，小心吸出含微卫星重复序列的双链DNA上清液。f)以上述双链DNA为模板，进行PCR扩增。2、含有微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计按照Sambrook等(2002，MolecularCloning,3nd，96—99,103—105)的方法进行微卫星DNA文库的克隆包括菌种复状、扩大培养、制备感受态细胞、倒平板、连接pMD18-T载体(购自Takara公司)、热激转化(42°C)以及菌落PCR，具体为g)菌种复状取4"C冰箱中保存的ADH5ct，用牙签挑取一个单克隆，加入5mlLB液体培养基，37t振荡培养过夜。h)扩大培养取1个250ml的锥形瓶加入50mlLB液体培养基，将培养过夜的菌液倒于锥形瓶中，37'C振荡培养2-3h，期间不断测0D6。。，当OD,达到0.3-0.4之间时将锥形瓶取出，立即冰浴15min，停止培养。i)制备感受态细胞取5ml菌液加到预冷的5mlEP管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0。C;4°C，4000rpm离心10min，回收细胞；倒出培养液，将EP管倒置于滤纸上lmin，流尽残留培养基；用预冷的O.lmol/LCaCl23ml悬浮细胞，立即水浴30min，用枪头将细胞轻轻打匀；重复步骤b、c;再用预冷的0.lmol/LCaCl2200ul悬浮细胞，用枪头打匀，此细胞即为感受态细胞。j)倒平板将LB固体培养基完全融化，冷却至506(TC，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基(比例为LB固体培养基1L;A卿青霉素100mg;IPTG24mg;X-Gal40mg)，混合均匀后倒在1只培养皿里，待培养基凝固后，置于37"C烘箱，晾干水蒸气。k)连接载体反应体系(IO"I)包括SolutionI(购自Takara公司)5txl，pMD18—Tvector(Takara公司)0.5ul，PCR产物3ul，ddH201.5nl，16。C连接3.5h。l)热激转化10nl连接液与100ul感受态细胞混匀于0.2mlEP管，冰浴30min;放入42。C水浴锅中热激转化90s，结束后冰浴5min;将转化后的产物转移至1.5mlEP管中，加入400ulLB液体培养基中，37'C振荡培养2.5h;取50u1菌液均匀涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG固体平板培养基；平板在37'C正放培养lh，以便琼脂吸收液体，然后倒置平板过夜。m)菌落PCR:牙签挑取培养皿上的262白色单菌落放入1.5mlEP管，每个EP管加入LB液体培养基lml，Amp青霉素O.lmg，37。C振荡培养至菌液混浊。PCR反应体系(25ul)包括lOXPCRBuffer3u1，dNTPMix5pmo1，MgCl25pmol，M13上下游引物各lOpmol(M13F:5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，，M13R:5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，)，菌液1u1，TaqDNA聚合酶lu(购自上海生工)，ddH2014ul。反应程序95。C预变性5min，以下31个循环，95°C30s，56°C30s，72°C30s，最后72'C延伸10min，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。n)对阳性克隆测序，得到25个序列微卫星重复，根据侧翼序列设计25对卫星引物，同时对上游引物5，端分别FAM、HEX、TE进行标记。3、利用扬子鳄微卫星DNA标记用于20个扬子鳄品种的分类，确定了10个多态性丰富的微卫星标记Asiul、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiul22、Asiu234。Asiul为464个核苷酸、Asiu2为356个核苷酸、Asiu4为469个核苷酸、Asiu20为529个核苷酸、Asiu44为155个核苷酸、Asiu45为276个核苷酸、Asiu84为533个核苷酸、Asiu96为327个核苷酸、Asiul22为297个核苷酸、Asiu234为310个核苷酸。o)参照Sambrook等(2002，MolecularCloning,3nd，463—471)的方法提取20个扬子鳄基因组DNA。P)分别用AsiuUsiu2、Asiu4、Asiu20、AsiuM、Asiu化、Asiu队Asiu%、Asiul22、Asiu23410个位点的10对引物，(引物序列见表1)使用PCR仪(PTC-200)扩增这20个扬子鍔的基因组DNA。q)将PCR产物经ABI377遗传分析仪(AppliedBiosystem公司)进行基因分型(Genotyping)，使用Genotype2.1软件(AppliedBiosystem公司)判读等位基因片段的具体数值。r)结果分析使用Cervus3.0软件(Kalinowski等，2007:RevisinghowthecomputerprogramCERVUSaccommodatesgenotypingerrorincreasessuccessinpaternityassignment.MolecularEcology,16，1099-1106.)计算期望杂合度和观察杂合度，使用Gen印op3.4软件(Raymond和Rousset，1995:GENEPOP(version1.2):populationgeneticssoftwareforexacttestsandecumenicism.JournalofHeredity,86,248-249.)计算哈代-温伯格以及连锁不平衡的值；以此来描述10个扬子鳄微卫星DNA多态位点的特征。由附图1一10可看出，本发明的10个微卫星序列长度在供试的20个扬子鍔中都出现了多样性，由此可见，本发明的这10个微卫星标记能够用于扬子鳄的品种分类和遗传关系分析。本发明提供了10个扬子鳄的新的微卫星位点及扩增这10个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于扬子鳄不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权鉴定的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。表l引物特性表位点，重复基序，引物序列，Mg2+，褪火温度。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表1中F表示5'端引物，R表示3'端引物，*表示荧光修饰。序列表<110>安徽师范大学<120>扬子鍔微卫星DNA标记<160>10<170>PatentlnVersion3.3<210>1<211>155〈212〉DNA<213>扬子鍔(Alligatorsinensis)■>1ggatcgctcattcatataccacacacacacaatgatatctatctatctatctatctatat60atatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtattcactaattcacacacataccacccacctacagt120tatacataggtgagttcctaagttgggtgttgtga155<210>2〈211〉276<212>DNA〈213>扬子鍔(Alligatorsinensis)■〉2tCCtg3CC3Cagcagct33gaB3Ctgtg3C肌gggC3gggCtt3g3tgggccgggtctgg60tttgaagcatgtcccttaatcctcaatttaaaataaaceiaacaacacacacacacacaca120cacacacacacacacccttcacaaaggactctagccctttacagctcttcctggctgaat180atctgatccctgctacacctagatgcctcatgcctgggccaaatccccatccggtgcaga240ccagtattgttcccccaaagtcagcagagctatgca276〈210>3<211>297〈212>DNA〈213>扬子鍔(Alligatorsinensis)〈400>3tcactsatgtgcatgg3城ggst3C3cac3cac3C3cacscacacsccc3gggttg3gg60gggtaagggtt3gsatgcc3gsgsgataaggsggatsggsc肪g8aaagBgc犯ceitgtc120acatcagtgctaggcattatcctggaMtggatacatggcaccttccattcactcctcct180actatattttgttg3tggggtaccatgcaacttggttgcatgtcatggaccaactcaaga譜atctggagccacccaccctacatggaaacacgtacctgagttgcaax;ag3gtctgtt297<210>4〈211〉310<212>腿〈213>扬子鍔(Alligatorsinensis)〈400〉4gatc卿3ttt3tgatggggaagggaccsgggctC3gt朋cataca^ccc犯ctcagagt60tacaaatgacggtggUttattg幼c鄉gg卿tggtgacacaa城cttattggttcc120ttcELcacacEicacacacactggcagtaggggttaaagagacttggtgcaggggctetaagt180ctgggac肌g3g柳gagtccaaatttggeigg3gg肌atgtgcaggtgateitctacctatc240ccatgctggaagttggtcctcgatggccagtcagggtctccttcagctcagtgttgtcca300gsgggg8tcg310〈210〉5〈211〉327<212〉腿〈213>扬子鍔(Alligatorsinensis)〈400〉5aacaccaccccttgaaagcagccatccctcctttaccattcaacctcaagccctgggtgcgag卿g卿g卿g卿gagacctttcggcatgcttttcccccctacagctggacgataagcacttctgt3ggac肌3g33C3gtgtgggggtctctggcc幼tctctagaggatcagggagcaactctgtaggcc犯aggttcct60cattcaagctgagagagagagagagagaga120tagggaaaggagaatgacttgccttagcat180ccaccccttgaaagcggccacccctcatgg240ctccactgggtgaccattggtcgaagcttg300327〈210〉6<211>356〈212〉DNA〈213〉扬子鍔(Alligatorsinensis)〈400〉6ggtcatgagttatcttatcatcgctctgtggattgttgcatattccactgctcattaacc60agggtgctaacacttcccttagc犯gtcacctatttggagggaagggtgttggggagggg120tgagtcctgagatgccttta3ga犯ctggtagctagc肌gttctgggtaBccttcagacc180cttggagaaaC3gggtg犯ggasgggasscEigcscscagcccsgttctctg3gaagg肌3240ggctttgaggaaactgctgccatgcgctactccccttctcttaatccgatgggaaaactg300agcacatctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtacacaga/tcagttagct356<210〉7<211>464〈212〉DNA〈213〉扬子鍔(Alligatorsinensis)■>7tttgcagaggttgcttgggtcctcatcttgaggagcagggattaatcattcagtgacact60gcaattactatccgatggtagggcatttatttggcatttaacatgtcattagagcaaata120actgtttctctcccc犯ggcagtgcatattgcaggaggccaagctttgacctggtggaag180attgcgcagtggagctgccccgtggcagcagcccttggttcagcgacgtgcaaagcttgc240tctagaaaccgtggagggtctcagctgggcacggcgcctccgctcgcscggggsgctctg300ccctgtgttg3gcccagggagcttctggtgtggatccctgagctgcttgg犯atgctctg360ca卿caggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt420gtgtgtgtgtgtgtgtscggggaggcggggg333cggac3tctt464<210>8〈211>469<212>■〈213〉扬子鍔(Alligatorsinensis)<400>8tagataagtttaaccctaagcaaaaaaagagtatctcttagtattttagaagacacacta60ctggttcaacaaccactagctttggctaggaattaattgacaaaacaaattttattagaa120aagcatgactcgtcagatcttaaacatgcccgttgaaagcattcca犯cttttctgtaag180aacttctcagttacagggtggagtcataatcagagagaccccaccaaactatagacttga240aaacttaggttcaagaccttgtttg犯tggatatttaattat"ttattcaaagtacagtag300ctc犯gcagsacatgag￡Lggga^gagsgELg3g3g3ga^犯g3g3g3gtC3t8Ctt犯t360agtcctggttcagccatcacttgagttggggtaaatagcaccttgtatcccaattgaagg420tatcctaaccaccagggctaagtacagacagct犯a犯gcctg犯gctg469<210〉9<211>529〈212〉DNA〈213〉扬子鍔(Alligatorsinensis)〈400〉9gagggcagacacagggctctgtccctgctcggcgtttggc3tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgtgcatgcgctttggctattgcatctctaaccacatatacttttattaacaataactaacctattcattttaagggctttgttgcatgatcacaagtgcatgacggccgtcatgcaggtcatacatggtccctgccctaggagccccctgcccctgggacacagctgcaccgggctcc卿gg卿aggccggggttgcactgcctcgaatcccacccctgccccattgttcttgaca60gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtacgc120atatattcagagactttaactgggtttgat180gaccacagctgaaagagcagccttgatgtt240ttacccttaggacctgctaaaggcagttaa300taaaggttcttctcgttttttttttttctt360agggtgtgtttcggggctctttcctctgat训agagcccagtcatcagctctgtgccaggag480ggcccctcccccaccgtcc52919〈210〉10〈211〉533〈212〉腿<213〉扬子鍔(Alligatorsinensis)〈400〉10atatgggcggcccttctctggactcgcttgagctttt犯aaagtcagatgcttctggatt60catatcttggctgatatctatattttaccatcctgtgctgtagaactcggttggccacct120tg犯卿gggcsg卿ctag犯tg,gtgg卿ctgctcttccccttcagggttgc卿180tggatatagtcggatacattggcagcagcaatgccaaggatttgtatagcgtgaccctac240tgtggcttctc郷agggaatccacaattccaaaaaagtgctgccgcttcagctcaagtg300gcga卿ctttgtgcttgctcaggtttgaaggctctggacttgttcctagtgtgtgtgtg360tgtgtgcaattacagggagttgtggtccctcacaaaacagtcccttggaggacatgaact420ctggtggaccccgg卿tttgggctgagcttgtc他tgagggg组atgtgatttgttg480犯ttaatatgtgcgattcgaagcttggggtctctggcc犯tctctagaggate53权利要求1.扬子鳄微卫星DNA标记，其特征在于所述的微卫星标记编号分别为Asiu1、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234，其核苷酸序列为Asiu44ggatcgctcattcatataccacacacacacaatgatatctatctatctatctatctatat60atatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtattcactaattcacacacataccacccacctacagt120tatacataggtgagttcctaagttgggtgttgtga155Asiu45tcctgaccacagcagctaagaaactgtgacaagggcagggcttagatgggccgggtctgg60tttgaagcatgtcccttaatcctcaatttaaaataaacaaacaacacacacacacacaca120cacacacacacacacccttcacaaaggactctagccctttacagctcttcctggctgaat180atctgatccctgctacacctagatgcctcatgcctgggccaaatccccatccggtgcaga240ccagtattgttcccccaaagtcagcagagctatgca276Asiu122tcactaatgtgcatggatatggatacacacacacacacacacacacacccagggttgagg60gggtaagggttagaatgccagagagataaggaggataggacaagaaaagagcaacatgtc120acatcagtgctaggcattatcctggaattggatacatggcaccttccattcactcctcct180actatattttgttgatggggtaccatgcaacttggttgcatgtcatggaccaactcaaga240atctggagccacccaccctacatggaaacacgtacctgagttgcaacagagtctgtt297Asiu234gatcagaatttatgatggggaagggaccagggctcagtaacatacaacccaactcagagt60tacaaatgacggtggttttattgaacaggggagatggtgacacaatatcttattggttcc120ttcacacacacacacacactggcagtaggggttaaagagacttggtgcaggggctaaagt180ctgggacaagagagagagtccaaattggaggaggaaatgtgcaggtgatatctacctatc240ccatgctggaagttggtcctcgatggccagtcagggtctccttcagctcagtgttgtcca300gaggggatcg310Asiu96aacaccaccccttgaaagcagccatccctcagggagcaactctgtaggccaaaggttcct60ctttaccattcaacctcaagccctgggtgccattcaagctgagagagagagagagagaga120gagagagagagagagagagagacctttcggtagggaaaggagaatgacttgccttagcat180catgcttttcccccctacagctggacgataccaccccttgaaagcggccacccctcatgg240agcacttctgtaggacaaagaacagtgtggctccactgggtgaccattggtcgaagcttg300gggtctctggccaatctctagaggatc327Asiu2ggtcatgagttatcttatcatcgctctgtggattgttgcatattccactgctcattaacc60agggtgctaacacttcccttagcaagtcacctatttggagggaagggtgttggggagggg120tgagtcctgagatgcctttaagaaactggtagctagcaagttctgggtaaccttcagacc180cttggagaaacagggtgaaggaagggaaacagcacacagcccagttctctgagaaggaaa240ggctttgaggaaactgctgccatgcgctactccccttctcttaatccgatgggaaaactg300agcacatctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtacacagatcagttagct356Asiu1tttgcagaggttgcttgggtcctcatcttgaggagcagggattaatcattcagtgacact60gcaattactatccgatggtagggcatttatttggcatttaacatgtcattagagcaaata120actgtttctctccccaaggcagtgcatattgcaggaggccaagctttgacctggtggaag180attgcgcagtggagctgccccgtggcagcagcccttggttcagcgacgtgcaaagcttgc240tctagaaaccgtggagggtctcagctgggcacggcgcctccgctcgcacggggagctctg300ccctgtgttgagcccagggagcttctggtgtggatccctgagctgcttggaaatgctctg360caaagcaggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt420gtgtgtgtgtgtgtgtacggggaggcgggggaaacggacatctt464Asiu4tagataagtttaaccctaagcaaaaaaagagtatctcttagtattttagaagacacacta60ctggttcaacaaccactagctttggctaggaattaattgacaaaacaaattttattagaa120aagcatgactcgtcagatcttaaacatgcccgttgaaagcattccaaacttttctgtaag180aacttctcagttacagggtggagtcataatcagagagaccccaccaaactatagacttga240aaacttaggttcaagaccttgtttgaatggatatttaattatttattcaaagtacagtag300ctcaagcagaacatgagagggagagagagagagagagagaaagagagagtcatacttaat360agtcctggttcagccatcacttgagttggggtaaatagcaccttgtatcccaattgaagg420tatcctaaccaccagggctaagtacagacagctaaaaagcctgaagctg469Asiu20gagggcagacacagggctctgtccctgctcaatcccacccctgccccattgttcttgaca60ggcgtttggcatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtacgc120gcgtgcatgcgctttggctattgcatctctatatattcagagactttaactgggtttgat180aaccacatatacttttattaacaataactagaccacagctgaaagagcagccttgatgtt240acctattcattttaagggctttgttgcatgttacccttaggacctgctaaaggcagttaa300atcacaagtgcatgacggccgtcatgcaggtaaaggttcttctcgttttttttttttctt360tcatacatggtccctgccctaggagcccccagggtgtgtttcggggctctttcctctgat420tgcccctgggacacagctgcaccgggctccagagcccagtcatcagctctgtgccaggag480aagggaagaggccggggttgcactgcctcgggcccctcccccaccgtcc529Asiu84atatgggcggcccttctctggactcgcttgagcttttaaaaagtcagatgcttctggatt60catatcttggctgatatctatattttaccatcctgtgctgtagaactcggttggccacct120tgaaagagggcagagactagaatgagcgtggagactgctcttccccttcagggttgcaag180tggatatagtcggatacattggcagcagcaatgccaaggatttgtatagcgtgaccctac240tgtggcttctcaggagggaatccacaattccaaaaaagtgctgccgcttcagctcaagtg300gcgaagactttgtgcttgctcaggtttgaaggctctggacttgttcctagtgtgtgtgtg360tgtgtgcaattacagggagttgtggtccctcacaaaacagtcccttggaggacatgaact420ctggtggaccccggaagtttgggctgagcttgtctaatgaggggaatatgtgatttgttg480aattaatatgtgcgattcgaagcttggggtctctggccaatctctagaggatc5332.根据权利要求1所述的扬子鳄微卫星DNA多态位点，其特征在于所述的Asiul、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiul22、Asiu234十个位点的引物序列为AsiulF:CTCTCCCCAAGGCAGTGCATATTAsiulR:AGATGTCCGTTTCCCCCGCCTCAsiu2F:CAGACCCTTGGAGAAACAsiu2R:AGCTAACTGATCTGTGTAAsiu4F:TCAGTTACAGGGTGGAGTAsiu4R:TGGGATACAAGGTGCTAAsiu20F:GGCTCTGTCCCTGCTCAAAsiu20R:CTGCTCTTTCAGCTGTGGTCAsiu44F:GGATCGCTCATTCATATACAsiu44R:CACCCMCTTAGGMCTCACCAsiu45F:CCGGGTCTGGTTTGAAGCAAsiu45R:GGGCTAGAGTCCTTTGTGAsiu84F:GTCGGATACATTGGCAGCAsiu84R:CTGTTTTGTGAGGGACCAsiu96F:GTTCCTCTTTACCATTCAsiu96R:GCTAAGGCAAGTCATTCTCAsiul22F:TCACTAATGTGCATGGATATGGAsiul22R:ATCCTCCTTATCTCTCTGAsiu234F:ACAGGGGAGATGGTGACAsiu234R:TGGACTCTCTCTCTTGT。全文摘要本发明公开了扬子鳄微卫星DNA标记，包括扬子鳄微卫星(CT/AG)<sub>n</sub>、(AC/GT)<sub>n</sub>、(GATA)<sub>n</sub>富集文库的构建，微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到25个含有微卫星重复序列的克隆，确定了10个多态性丰富的微卫星标记Asiu1、Asiu2、Asiu4、Asiu20、Asiu44、Asiu45、Asiu84、Asiu96、Asiu122、Asiu234；本发明可应用于扬子鳄不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权鉴定的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。文档编号C12N15/11GK101368205SQ20081012255公开日2009年2月18日申请日期2008年5月31日优先权日2008年5月31日发明者吴孝兵,鹏晏,朱海涛申请人:安徽师范大学