专利名称：一种植物耐寒与抗旱蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一个植物抗旱及耐寒相关蛋白及其编码基因与应用，特别 涉及利用该基因增强植物抗旱性与耐寒性的方法。
二背景技术：
粮食问题是当今世界所面临的几大难题之一。通过提高单产或扩大种植面积、增加农 业投入改造中低产田等途径来增加粮食产量都会碰到需要克服逆境限制或减轻逆境危害的 问题。因此，认识植物对逆境的反应机制，提高植物的抗逆性，已成为农业进一步增产的重 要基础研究，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。
低温和干旱是影响和限制作物生产的两个重要逆境因子，对生产造成重大损失。除了利 用传统的育种方法外，利用基因工程技术提高作物的耐寒和抗旱能力具有重要的理论与经济 意义，而这项工作的关键在于对植物抗逆分子机理的认识及关键基因的克隆。
拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。 拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物 研究。因此，对拟南芥抗旱性和耐寒性分子生物学机制的研究对提高作物的耐寒和抗旱能力 具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库 (www. arabidopsis. org)寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究 领域的热点之一,也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约l. 3亿个碱基对，2. 9万个 基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方 法。通过对突变体的研究，发现了一些抗旱基因及耐寒基因的功能，如DREE， CBF， ABRE等。 CN1293095C公开了一种植物抗旱相关蛋白及其编码基因与应用。
目前，还未找到有效的同时具有抗旱功能和耐寒功能的基因，面对日益严重的农作物 干旱及抗寒问题，寻找新的抗旱及抗寒功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。 申请人:根据拟南芥数据库公布的基因组序列，发现基因AT1G16850是一个功能未知的基因。 基因表达分析显示，冷处理可诱导其转录水平显著提高，而干旱处理则抑制该基因转录，表 明该基因可能涉及耐寒和抗旱的调控。为此，我们研究了该基因功能，并发现该基因具有调 控植物耐寒和抗旱的作用。
三
发明内容
本发明的目的是提供一种新的植物耐寒及抗旱相关蛋白及其编码基因。本发明所提供的
植物耐寒及抗旱相关蛋白的编码基因，命名为A/f7^-7 丄e顺ers- i/ c/"ce" iW;
AT1G16850)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋 白质-
(1) 序列表中的SEQ ID No: 2;
(2) 将序列表中SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与植物耐寒及抗旱相关的蛋白质。
序列表中的序列2由152个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加。
LWT2-l的编码基因也属于本发明的保护范围。 Z/f7^-7的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一；
(1) 序列表中SEQ ID No: 1的DNA序列;
(2) 编码序列表中SEQ ID No: 2蛋白质序列的多核苷酸；
(3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；
(4) 与序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列具有90y。以上同源性、且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。
序列表中的序列1由702个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'端第11位至469位 碱基，编码序列SEQ ID No: 2的蛋白质。
含有本发明Z/f7^-7的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增Z/T7^-7 中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物耐寒及抗旱性的方法。
本发明所提供的增强植物耐寒及抗旱性的方法，是抑制植物中的上述植物耐寒及抗旱 性相关蛋白编码基因的表达。
抑制植物中的上述植物耐寒及抗旱性相关蛋白编码基因Z/^^-7的表达可通过多种方法 实现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的 基因沉默方法等。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制Z/f7^-7 表达均可。
利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为耐寒和抗旱;利 用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的A^^-7转入植物中，
植物就表现出冷和旱敏感。
本发明的/^7^-/基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时,在其转录起始核苷酸前 可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及 筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等) 或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶 植物,也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜 宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物苗期叶片失水 程度和抗寒能力来筛选转化植株。携带有本发明Z/f7^-7基因的表达载体可通过使用Ti质粒、 Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法 转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
本发明的植物耐寒及抗旱相关蛋白及其编码基因为农作物耐寒及抗旱育种提供基因 与技术的支持(保障)。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
四
图1为厶野生型植株的在正常光照培养条件下不同时期(A生长16d; B生长 30 d; C生长40 d)的比较照片
图2为J^^-厶野生型植株的耐寒性比较(A -6。C处理；B -8。C处理；C -l(TC处理；D 存活率；E电导率)
图3为7r^-入野生型植株在不同生长时期(A培养2周；B培养3周；C培养4周D失 水率)的抗旱性
图4为J时2-7、野生型植株的渗透调节能力比较照片
五具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。 实施例1、 LWT2-1及其编码基因的获得
以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提取其总RNA， 用紫外分光光度计检测RNA浓度。按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司)试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链。以提取 出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应20 Ul反应体系，内含IOXPCR缓冲液 2 yl， dNTPs (lOmM)混合物0. 4 u 1,引物1和引物2各2 ul， Tag酶(5U/ul) 0. 2 ul， 其余加双蒸水至20ul。其中，引物l: 5， -AMACATCAAAATGGCTGAAAAAG-3'，引物2: 5，-TCATTAAACTGACTGCTGAGAAATG -3'。在Life Express基因扩增仪上扩增先94"C预变性3 min，再94。C 30 sec， 54°C30 sec, 72°C60 sec，共计30个循环，最后72 。C延伸10 min, 将获得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的cDNA片段连接于pGEM-T载体， 得到含有目的片段的载体pT-Z/T7^-7,进行测序鉴定，结果表明PCR得到的cDNA片段具有序 列表中序列SEQ ID No: 1的DNA序列，为Z/rri1-7的cDNA基因，由702个碱基组成，其编 码序列为自5'端第11位碱基到第469位碱基，编码具有序列表中序列SEQ ID No: 2的氨 基酸残基序列的蛋白质。
实施例2、培育耐寒性及抗旱性增强的拟南芥
1、 Z^7i"-/基因被敲除的纯合突变体Jw^-7的获得
从美国拟南芥种质资源中心获得了 T-DNA插入突变体种子(SALK一023905; http:〃www. axabidopsis. org/servlets/Tair0bject" type二germplasm&id二4626493 )。为鉴 定Z/f7^-7基因被敲除的纯合突变体，播种SALK_023905种子并提取单株植株DNA，以此为 模板，用3对引物对其进行PCR扩增。其中，引物1 LBb 1: 5' -GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3， 弓|物 2 : LWT2-LP 5， -AAGCACMACGTGGTTACCTG -3，， 弓|物 3 : LWT2-RP 5' -GTCGCTTTGCTATGCTCAAAG-3'。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，获得Z/T7^-7基因 被敲除的纯合突变体JwC-7。从表型来看，该突变体与野生型(WT)植株在营养生长期没有 显著差异(图1A)，但开花时间较野生型延迟约5d (图1B， C)。用该基因的cDNA序列构建 35S强动子的过表达载体并转化突变体，该转基因植株形态上恢复了野生型表型，在低温和 干旱条件下也恢复了野生型植株症状，证实了该基因确实控制抗旱及耐寒性状。
2、 2^2-7与野生型植株的耐寒性比较
将野生型(WT)与hC-7同时播种于直径为90mm的花盆中，置于22。C恒温光照(光周期为 16小时光照，8小时黑暗)培养。培养3周的野生型与Jr^-厶从培养室中取出后，同时放 入不同温度(-6°C， -8""C， -l(TC)的变温室，保持10小时进行冷冻处理，然后取出立即放 入4'C暗室，维持12小时后，取出并放回22'C恒温光照培养室，再恢复培养l周。在不同低温 处理条件下，该突变体耐寒能力显著增加(图2A、图2B、图2C)。在一6。C、 一8T、 一10。C处 理条件下，7rz^-7和野生型的存活率分别为98. 5%和76. 3%; 73. 2%和51. 2%; 58. 3%和19. 1% (图2D)。电导率测定结果也显示，在不同低温处理条件下，7r^-7的电导率明显低于野生 型(图2E)，说明在低温条件下其细胞伤害较小。上述结果表明/^^-/耐寒能力显著增强。
3、 J^i"-7与野生型植株的抗旱性比较
将野生型(WT)与^t -7同时播种于120mmX20鹏(直径X高度)的花盆中，置于22。C 恒温光照培养室。正常培养一段时间(2周，3周，4周)的野生型与7时2-A此后在其它条
件不变的情况下，保持7 10天不浇水，野生型出现了严重的枯萎而JWi"-7只是稍微萎蔫， 然后浇水恢复培养3 5天。结果如图3A、 3B、 3C所示，野生型植株的存活率很低，叶片枯黄， 几乎全死，而JW^-/植株经恢复后，叶片变绿，几乎全部存活。离体叶片水分损失分析的结 果表明，突变体叶片失水较野生型明显缓慢(图3D)。由此可见，与野生型相比，Jr^-7的 抗旱能力明显提高。
4 、 J『C-厶野生型植株的渗透调节能力比较
将Jw"-7、野生型(WT)的种子分别播种含有O、 400mmol/L的甘露醇的MS培养基上,4 'C下春化2天后，取出放入22'C的长日照(光周期为16小时光照，8小时黑暗)条件下培养2 周,观察比较植株根系及整株生长情况以确定它们的渗透调节能力。图4的结果表明，在甘露 醇浓度为400mmol/L时，"tiW植株明显好于野生型。说明ZPfT2-7基因缺失后，其植株渗 透调节能力增强，有利于抗旱。
序列表1 SEQ IDNo:l
(Nucleotide Sequence, Sequence Length (bp) : 702)
1AAAACATCAAAATGGCTGAAAAAGTAAAGTCTGGTCAAGTTTTTAACCTA
51TTATGCATATTCTCGATCTTTTTCTTCCTCTTTGTGTTATCAGTGAATGT
101TTCGGCTGATGTCGATTCTGAGAGAGCGGTGCCATCTGAAGATAAAACGA
151CGACTGTTTGGCTAACTAAAATCAAACGGTCCGGTAAAAATTATTGGGCT
201AAAGTTAGAGAGACTTTGGATCGTGGACAGTCCCACTTCTTTCCTCCGAA
251CACATATTTTACCGGAAAGAATGATGCGCCGATGGGAGCCGGTGAAAATA
301TGAAAGAGGCGGCGACGAGGAGCTTTGAGCATAGCAAAGCGACGGTGGAG
351GAAGCTGCTAGATCAGCGGCAGAAGTGGTGAGTGATACGG CGGAAGCTGT401GAAAGAAAAGGTGAAGAGGAGCGTTTCCGGTGGAGTGACG CAGCCGTCGG451AGGGATCTGAGGAGCTATAAATACGCAGTTGTTCTAAGCTTATGGGTTTT
501AATTATTTAAATAATTAGTGTGTGTTTGAGATCAAAATGACACAGTTTTG
551GGGGAGTATATCTCCACATCATATGTTGTTTGCATCACATGGTTTCTCTG
601TATACAACGACCAGATCCACATCACTCATTCTCGTCCTTCTTTTTGTCAT
651GAATACAGAATAATATTTTAGATTCTACATTTCTCAGCAGTCAGTTTAAT
701GA
序列表2 SEQ ID No: 2
MetAlaGluLysValLysSerGlyGinValPheAsnLeuLeuCys15
工lePheSerliePhePhePheLeuPheValLeuSerValAsnVal30
SerAlaAspValAspSerGluArgAlaValProSerGluAspLys45
ThrThrThrValTrp!LeuThrLyslie!LysArgSerGlyLysAsn60
TyrT;rpAlaLysValArgGluThrLeuAspArgGlyGinSerHis75
PhePheProProAsnThrTyrPheThrGlyLysAsnAspAlaPro90
MetGlyAlaGlyGluAsnMetLysGluAlaAlaThrArgSerPhe105
GluHisSerLysAlaThrValGluGluAlaAlaArgSerAlaAla120
GluValValSerAspThrAlaGluAlaValLysGluLysValLys135
ArgSerValSerGlyGlyValThrGinProSerGluGlySerGlu150
Glu !Leu
权利要求
1、一种植物耐寒与抗旱蛋白，其特征在于氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No2所示。
2、 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列包括不 超过10个氨基酸残基的取代和/或缺少和/或添加。
3、 由权利要求l所述的植物耐寒与抗旱蛋白的编码基因，其特征在于选自下列核苷酸 下列之一(1) 序列表中SEQ ID No: 1的DNA序列;(2) 编码序列表中SEQ ID No: 2蛋白质序列的多核苷酸。
4、 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于在高严谨条件下与SEQ ID No: l限定 的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5、 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于与SEQ ID No: l限定的DNA序列具有 90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
6、 由权利要求3所述的编码基因增强植物耐寒与抗旱性的方法，其特征在于是抑制植 物中耐寒与抗旱相关蛋白编码基因的表达。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于抑制植物中耐寒与抗旱相关蛋白编码基因 表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，或者反义核酸技术沉默基因的方法，或 者siRNA介导的基因沉默方法。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐寒与抗旱蛋白及其编码基因与应用。植物耐寒与抗旱蛋白是序列表中SEQ ID No2，其编码基因是序列表中SEQ ID No1 DNA序列。本发明利用该耐寒与抗旱蛋白的编码基因增强植物耐寒与抗旱性，如抑制植物中上述植物耐寒及抗旱性相关蛋白的编码基因的表达，为农作物耐寒即抗旱育种提供基因与技术支持。
文档编号C12N15/29GK101348523SQ20081012252
公开日2009年1月21日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者姜绍通, 孔维文, 曹树青, 力 江, 简红勇, 边小会, 陈正义 申请人:合肥工业大学