专利名称：：倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌及相应重组脂肪酶的构建法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种倾向性水解甘油三酯sn-2位酯键脂肪酶工程菌及相应重组脂肪酶的构建方法。
背景技术：
：随着世界经济水平的提高，动物性食品的摄入增加，进而导致膳食脂肪的摄入量大幅上升。中国疾病预防控制中心(CDC)调查报告显示，2002年中国居民每日油脂摄入量约为44g，所含能量占膳食总能量的35%，高于世界卫生组织推荐的上限30%。脂肪摄入量过高，导致机体患肥胖、高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病。这些疾病及其并发症的治疗，不但给患者家庭带来沉重的经济负担，也带来沉重的社会负担。1,3-甘油二酯(DAG)是天然油脂中的微量组成成分。众多科学研究发现，1,3-DAG的摄入可以降低肥胖患者的体重和体脂组成，降低2型糖尿病患者血糖代谢相关指标，例如降低其血清胰岛素水平和瘦素水平等，还可降低空腹血清总胆固醇和总甘油三酯(TAG)的浓度。因此，1,3-DAG的摄入可以显著改善因普通油脂摄入过多所导致的各类代谢综合症。同时，1,3-DAG在风味、色泽等方面与TAG基本一致，且具有与TAG相同的能量密度和生物利用度，并对机体无任何毒副作用。鉴于1，3-DAG所具有的健康功效，其制备得到了国内外学者的广泛关注。目前国内外已有多项关于1,3-DAG制备的专利和文章，所涉及到的方法主要有直接酯化法、甘油解法、TAG先分解后合成法和部分水解法等。直接酯化法是甘油和FA在1,3-特异性脂肪酶(米黑根毛霉脂肪酶)的催化下，直接发生酯化反应生成1，3-DAG。该方法的优点是产物中1，3-DAG的含量非常高，但缺点是所需的底物成本非常高，还需要不断除去反应体系中生成的水使反应得以进行，这增加了专利实施的难度，如中国专利CN1560020A，CN1615365。甘油解法是指在1，3-特异性脂肪酶的作用下，TAG和甘油之间发生酰基转移而生成1,3-DAG。该方法所需成本较高，同样限制了它的应用，如中国专利CN1438308A，CN1544412A。甘油三酯先分解后合成法是指甘油三酯在蒸汽或无选择性脂肪酶(如南极假丝酵母脂肪酶B)的作用下彻底分解生成甘油和FA，两者在1,3-特异性水解酶的作用下酯化生成1，3-DAG。该法所需的底物成本较低，但反应过程中需要不断除去水分，工艺流程较为繁琐。如果采用蒸汽对TAG进行水解的话，天然油脂中的其它营养成分如维生素E、植物甾醇等遭到破话，还需向最终产物中重新添加此类物质，成本相应增加，如中国专利CN1267322A。直接水解法是指在化学催化剂或脂肪酶的作用下，TAGsn-2位酰基被直接水解下来生成1,3-DAG。如果采用化学催化剂进行催化，水解所得产物中1,3—DAG含量较低，而且为了防止高温下脂肪酸氧化，反应需要在真空或惰性气体的保护下进行，增加了成本，如中国专利CN1635068A、CN1585814。如果采用脂肪酶对TAG进行催化水解，由于目前尚未发现sn-2位酰基特异性水解的脂肪酶，导致产物中的DAG是1,3-DAG和1,2-DAG的混合物。从代谢途径来看，1,2-DAG和TAG—样，经酶消化后都转化成sn-2位的MAG和FA，二者进入血液以后，都用于合成TAG。因此，过量摄入也会引起血脂升高等问题。南极假丝酵母脂肪酶A(CAL-A)是目前已知最具TAGsn-2位酰基水解倾向的脂肪酶。专利ZL200610049242.5摸索了CAL-A水解TAG制备1,3-DAG的条件，并成功制备高1,3-DAG含量的食用油。但由于CAL-A在其原始菌株中产量非常低，大大限制了该方法的工业化应用。巴斯德毕赤酵母表达系统(P/c/nV^ortw^)具有表达量高、可对外源蛋白进行修饰及调控表达等优点，越来越受到分子生物学界的重视，目前已经有300多种外源蛋白在该系统中得到成功表达。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，以及利用该工程菌制备重组脂肪酶的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，包括以下步骤1)、CAL-A基因的克隆以南极假丝酵母基因组为模板，利用一对特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物的上游引物和下游引物分别如下上游引物(LPU):AATAAG0147TCGCGGCGCTGCCCAACCCCTACGAC，为SEQIDNO:1;下游弓l物(LPD):AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATCGACCGTGGGAACTG;为SEQIDNO:2;2)、重组载体的构建-利用限制性内切酶对PCR产物和载体进行双酶切、连接，构建重组载体；然后将上述重组载体转化进入大肠杆菌中，通过PCR鉴定，筛选出阳性重组载体；3)、转化将上述阳性重组载体，采用限制性内切酶进行线性化，并将其电转进入宿主菌中；然后采用PCR鉴定，筛选出阳性工程菌。作为本发明的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法的改进步骤2)中的载体为pPIC9K或pPICZa，步骤3)中的宿主菌为毕赤酵母菌GS115或X33。作为本发明的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法的进一步改进步骤2)中的PCR鉴定引物为步骤1)中的特异性引物和该载体自身的标准引物。作为本发明的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法的进一步改进步骤3)中的限制性内切酶为Sa/1或&cI。作为本发明的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法的进一步改进步骤3)中的PCR鉴定引物为步骤1)中的特异性引物、该载体自身的标准引物、步骤l)中的特异性引物和该载体自身的标准引物的组合。本发明还同时提供了利用上述任意一种方法获得的工程菌制备重组脂肪酶的方法将所得的阳性工程菌接种至BMGY培养基中，30T:过夜培养至OD6(K)为26;然后离心收集菌体，再用BMMY培养基稀释至OD6oo为1，每隔12h添加占总体积0.5%的甲醇诱导表达，诱导120小时后，将培养液离心，得重组脂肪酶的粗酶液。作为本发明的制备重组脂肪酶的方法的改进将重组脂肪酶的粗酶液进行浓縮和纯化，得重组脂肪酶。作为本发明的制备重组脂肪酶的方法的进一步改进浓縮步骤采用中空羧甲基纤维素膜，纯化步骤采用离子交换层析。本发明是通过将CAL-A基因与酵母表达载体构建重组载体，并将其转化进入组氨酸缺陷型毕赤巴斯德酵母中，构建工程菌；然后采用甲醇进行诱导表达，大量制备了重组CAL-A。本发明的工程菌的构建方案可以概括成如下步骤1.从NCBI数据库中搜索出编码CAL-A的基因序列；2.设计一对特异性引物，以扩增编码该脂肪酶的基因序列；3.挑选合适的载体及宿主菌；4.利用限制性内切酶对PCR产物和载体进行双酶切、连接，构建重组载体；5.将重组载体转化进入大肠杆菌中，通过PCR鉴定，筛选出阳性重组载体；6.提取阳性重组载体，采用合适的限制性内切酶进行线性化，并将其电转进入毕赤酵母中；7.采用PCR鉴定，筛选阳性工程菌。发明人利用了所得的工程菌采用甲醇诱导重组酵母，考察了甲醇添加量、添加批次、诱导时间对重组脂肪酶产酶量的影响，从而优化了产酶的条件。发明人采用中空羧甲基纤维素膜对重组脂肪酶的粗酶液进行浓縮，再采用离子交换层析对粗酶液进行纯化，并研究了重组脂肪酶的最适反应温度和pH、热稳定性和pH稳定性、以及不同化学物质对重组脂肪酶活性的影响。本发明所得的重组脂肪酶能用于水解甘油三酯食用油(TAG)，从而制备1，3-DAG;最后可用棒状薄层色谱和高效液相色谱来检测反应体系中各种甘油酯的组成比例。甘油三酯食用油为动物油、植物油、微生物油、动物油精炼脂肪、植物油精炼脂肪和微生物油精练脂肪中的至少一种；植物油可选用菜籽油、大豆油、棉籽油、玉米油、亚麻籽油、红花籽油、棕榈油、椰子油、橄榄油、米糠油、葵花籽油、茶籽油、花生油、可可酯或类可可酯；动物油可选用牛油、羊油、猪油、鱼油或乳酯。综上所述，本发明的方法是一种在毕赤巴斯德酵母表达系统对CAL-A进行表达的方法。与现有的技术和专利相比，本发明具有以下优点1.采用酵母分泌型载体PPIC9K等为载体，与目的基因片段构建重组载体并转化进入组氨酸缺陷型毕赤巴斯德酵母中。诱导过程中，重组脂肪酶分泌进入培养基中，可直接离心收集，避免了胞内酶所需的难度较大的酵母细胞破壁过程。2.分泌型载体PPIC9K自身分泌的杂蛋白较少，有利于所得重组脂肪酶的纯化。实验证明，诱导表达的上清仅需中空羧甲基纤维素膜超滤浓縮和离子交换层析两步纯化，即可得到电泳纯的重组脂肪酶。3.所得重组脂肪酶最适反应温度比原始脂肪酶有所提高。原始脂肪酶的最适反应温度约为50-70度，而重组脂肪酶的最适反应温度为75度。4.所得重组脂肪酶对重金属离子的毒害作用具有一定的抵抗性。在所有测试的金属离子中，只有Hg+离子对重组脂肪酶的活性具有较强的抑制作用。5.所得重组脂肪酶对甘油三酯sn-2位酰基水解的倾向性比原始脂肪酶略高。6.所得工程菌诱导过程简单，仅用价格低廉的甲醇即可进行诱导表达，生产成本较低。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是本发明的重组脂肪酶诱导表达曲线图。具体实施例方式实施例1、一种倾向性水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，依次进行以下步骤1)、CAL-A基因的克隆选用pPPIC9K上的￡coRI和iVwI为限制性酶切位点，设计一对特异性引物。上游引物(LPU):AATAAG0^47TCGCGGCGCTGCCCAACCCCTACGAC下游引物(LPD):AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATCGACCGTGGGAACTG以Camfetoa加ar"!'ca基因组为模板，进行PCR扩增。PCR体系如下Buffer(无Mg2+)5^L、Mg2+溶液5^L、dNTP溶液4|aL、上游弓l物1|aL、下游弓l物1^L、模板1、Taq酶0.5^L，加水补足50pL。扩增条件如下95°C5min;94°C1min，65°C1min，72°C1min，30个循环；72。C保温10min。扩增完毕后，采用Takara公司的试剂盒(TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer.2.0)进行纯化。2)、重组载体的构建'使用限制性内切酶￡coRI和油/1分别对pPIC9K和上述PCR产物进行酶切，酶切体系如下pPIC9K或PCR产物30nL、10xBuffer10pL、五coRI2pL、M&I2|liL，加水补足lOO)aL。30。C酶切3h后，采用步骤l)中的试剂盒进行纯化。将双酶切的pPIC9K和PCR产物进行连接，连接体系如下PCR产物lpL、pPIC9K1iliL、10XBuffer1pL、DNA连接酶0.5pL，加水补足10^L。对照连接体系中的PCR产物用水替代。16'C连接12h，然后将连接产物转化进入大肠杆菌DH5a。转化步骤如下1.向100nL大肠杆菌DH5a感受态细胞中加入5|aL连接体系，混匀并冰浴30min;2.将感受态细胞放置于42'C的水浴锅中，精确保温45s。3.将感受态细胞冰浴1min，然后加入600|xLLB培养基，立即放入37。C水浴锅中保温5min，再将其放入37'C摇床中，剧烈振荡培养1h;4.吸取200pL，涂布于含Kan抗生素的LB平板，37。C进行培养，直到长出单菌落。采用菌落PCR法对筛选平板上的单菌落进行鉴定。在PCR鉴定以前，挑取单个菌落于0.3ml含抗生素培养基的1.5ml离心管中，37'C摇床培养至培养基微浑，然后以该培养液为模板进行PCR鉴定，PCR体系及流程同步骤1)。采用步骤l)中的一对特异性引物、pPIC9K载体的标准引物分别进行扩增(这是为了确保正确性，因此仅仅使用上述任意一种引物也是可以的)，并利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。若PCR扩增出与编码脂肪酶的基因片段大小一致的条带(即步骤l)中的PCR条带的大小)，则表明该菌落为阳性转化子。挑取该阳性重组子于LB培养基中进行培养，并大量提取重组载体。3)、毕赤酵母的转化采用限制性内切酶Sa/I对上述重组载体进行酶切线性化，酶切体系同步骤2)，并将其与80pLGS115感受态细胞混合，冰浴5min后进行电转，电转条件为1.5KV下电击5ms。电转结束后，立即加入lml冰预冷的山梨醇溶液并将菌体混匀，转移至1.5mL的离心管中，然后将菌体悬液涂布于MD平板上，每200pL涂布一块平板，30。C培养，直至长出单菌落。挑取单菌落，分别点到MM和MD平板上，以鉴定重组转化子的表型。在MD平板上生长正常而在MM平板上生长缓慢的为Muts型，在MD和MM平板上均生长正常的转化子为Mut+型。挑取Mut+型重组子于YPD培养基中进行培养，并以其基因组为模板进行PCR扩增鉴定，鉴定流程同步骤l)。分别采用步骤l)中的一对特异性引物、pPIC9K载体的标准引物、一条特异性引物和一条标准引物为组合进行PCR扩增(这是为了确保正确性，因此仅仅使用上述任意一种引物也是可以的)，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增出目的片段大小条带(即步骤1)中PCR产物大小)的转化子即为阳性转化子。实施例2、一种利用实施例1所获得的工程菌制备重组脂肪酶的方法，采用酵母菌的诱导表达，具体步骤如下将实施例1所得的阳性转化子接种至BMGY培养基中，30。C过夜培养至OD6QQ为2到6，然后离心收集菌体。将所得的菌体用BMMY培养基稀释至OD6oo为1，每隔12h添加占总培养液体积0.5%的甲醇诱导表达。每隔24小时取1.5ml培养液离心，上清即为重组脂肪酶的粗酶液。诱导持续至第5天停止。实施例3、采用氢氧化钠滴定法测定脂肪酶活性聚乙烯醇橄榄油乳化液的制备向100mL超纯水中加入4g聚乙烯醇，微波加热溶解，成聚乙烯醇溶液。然后将聚乙烯醇溶液与橄榄油以4:1(w:w)的比例混合，高速组织匀浆机搅拌3次，每次lmin，间隔3min;得聚乙烯醇橄榄油乳化液。脂肪酶活性测定步骤如下在三角烧瓶中加入0.025mol/L，pH7.5的磷酸缓冲液5mL和聚乙烯醇橄榄油乳化液4mL，40。C水浴5min。然后加入实施例2所得的1mL粗酶液，反应15min，加入95%乙醇15mL终止反应，再加入酚酞指示剂3滴。用0.05mol/L氢氧化钠滴定至溶液成粉红色，减去空白消耗的氢氧化钠。将每分钟分解橄榄油释放1pmol游离脂肪酸所需酶量定义为1个脂肪酶活单位(U)[136]。酶液的酶活可用以下公式计算酶液活力_消耗的氢氧化钠的体积(mL)x0.05x1000具体内容如图l所示。结果发现，随诱导时间的延长，发酵液上清中重组脂肪酶的活性逐渐升高，到第5天时，发酵液上清中的酶活达到10.68U/mL，而原始Ow^faa"torc"ra中脂肪酶A几乎检测不到。实施例4、重组脂肪酶的纯化采用中空纤维膜对实施例2所得的粗酶液进行超滤浓縮，超滤膜的截流分子量为10kD。当酶液浓縮至较小体积时，不断加入25mmol/L的磷酸缓冲液，对浓縮液进行透析洗涤。离子交换层析使用DEAE-cellulose介质。先用20mmol/LpH6.0的磷酸缓冲液进行平衡，然后将用20mmol/LpH6.0的磷酸缓冲液透析好的浓縮酶液施于离子交换柱上端，之后用00.5mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速为2mL/min。收集所有的洗脱液，间隔10管测定酶活性，并采用SDS-PAGE进行检测，将只有重组脂肪酶条带的收集管进行合并，得纯的重组脂肪酶。实施例5、重组脂肪酶的性质1)、重组脂肪酶的最适反应温度和热稳定性在308(TC范围内，以1(TC为梯度，测定不同温度下的酶活。当测得最适温度后，再加测最适温度加减5T时的酶活。以测定酶活最高时温度下的酶活力定义为100%,计算其它温度下酶的相对活性。将酶液在3080'C下，以IO'C为梯度保温30min后，再于40。C下测定其活力。以在O。C下保存的脂肪酶活力定义为100%，计算其他温度下处理后酶的相对剩余活性。结果发现，重组脂肪酶的最适反应温度为75度，比原始脂肪酶(50-70°C)略高；重组CAL-A具有很好的热稳定性，只有当环境温度超过70'C时，才会对其活性产生影响。而原始脂肪酶在60"C以下具有较好的稳定性。2)、重组脂肪酶的最适反应pH及pH稳定性在pH3.010.0的缓沖液中，40。C下测定该脂肪酶活性。以测定酶活力最高时pH值下的酶活定义为100%，计算其它pH值下的相对活性。将重组脂肪酶液分别在pH3.010.0的相应缓冲液体系中25'C保存16h，再于4(TCpH7.5下测定其酶活，做出酶的相对活力曲线。结果发现，重组脂肪酶的最适反应pH为7，与原始脂肪酶相同；重组脂肪酶在pH4-8的范围内具有较好的稳定性，与原始脂肪酶基本一致。3)、不同化学物质对重组脂肪酶活性的影响将酶液加入到含不同化学物质的溶液中于25'C处理30min，然后在磷酸缓冲液反应体系中测定酶活。以水为对照物，计算其它化学物质对脂肪酶活力的影响。结果如下表1所示表l、不同化学物质对重组脂肪酶活力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例6、重组脂肪酶对甘油三脂sn-2位酯键水解能力的测定向油水比为3:1(w/w)的混合液中添加2%的重组脂肪酶(油w%)，60'C反应35h后，反应体系中U-DAG的含量约为13.60%,1,2(2,3)-DAG的含量为4.73%。由此可见，重组脂肪酶水解TAGsn-2位酰基的能力是水解sn-l(3)位酰基能力的2.83倍，比原始脂肪酶高(原始脂肪酶为1.84倍)最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若千个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQIDNO:1aataaggaattcgcggcgctgcccaacccctacgac36SEQIDNO:2aaggaaaaaagcggccgccatcgaccgtgggaactg3权利要求1、一种倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，其特征是包括以下步骤1)、CAL-A基因的克隆以南极假丝酵母基因组为模板，利用一对特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物的上游引物和下游引物分别如下上游引物AATAAGGAATTCGCGGCGCTGCCCAACCCCTACGAC，下游引物AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATCGACCGTGGGAACTG；2)、重组载体的构建利用限制性内切酶对PCR产物和载体进行双酶切、连接，构建重组载体；然后将上述重组载体转化进入大肠杆菌中，通过PCR鉴定，筛选出阳性重组载体；3)、转化将上述阳性重组载体，采用限制性内切酶进行线性化，并将其电转进入宿主菌中；然后采用PCR鉴定，筛选出阳性工程菌。2、根据权利要求1所述的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，其特征是所述步骤2)中的载体为pPIC9K或pPICZa，步骤3)中的宿主菌为毕赤酵母菌GS115或X33。3、根据权利要求2所述的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，其特征是所述步骤2)中的PCR鉴定引物为步骤l)中的特异性引物或该载体的标准引物。4、根据权利要求3所述的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，其特征是所述步骤3)中的限制性内切酶为S"/I或SacI。5、根据权利要求4所述的倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，其特征是所述步骤3)中的PCR鉴定引物为步骤l)中的特异性引物、该载体的标准引物或步骤l)中的特异性引物和该载体的标准引物的组合。6、利用权利要求15中任意一种方法获得的工程菌制备重组脂肪酶的方法，其特征是将所得的阳性工程菌接种至BMGY培养基中，30'C过夜培养至OD6oo为26;然后离心收集菌体，再用BMMY培养基稀释至OD6o。为1，每隔12h添加占总体积0.5。/。的甲醇诱导表达，诱导120小时后，将培养液离心，得重组脂肪酶的粗酶液。7、根据权利要求6所述的制备重组脂肪酶的方法，其特征是将重组脂肪酶的粗酶液进行浓縮和纯化，得重组脂肪酶。8、根据权利要求7所述的制备重组脂肪酶的方法，其特征是所述浓縮步骤采用中空羧甲基纤维素膜，所述纯化步骤采用离子交换层析。全文摘要本发明公开了一种倾向水解TAGsn-2位酯键酶工程菌的构建方法，包括以下步骤1)CAL-A基因的克隆；2)重组载体的构建利用限制性内切酶对PCR产物和载体进行双酶切、连接，构建重组载体；然后将重组载体转化进入大肠杆菌中，通过PCR鉴定，筛选出阳性重组载体；3)转化将阳性重组载体采用限制性内切酶进行线性化，并将其电转进入宿主菌中；然后采用PCR鉴定，筛选出阳性工程菌。本发明还同时提供了利用上述方法所得工程菌制备重组脂肪酶的方法。本发明所得的重组脂肪酶能用于水解甘油三酯食用油。文档编号C12N1/19GK101407819SQ20081012229公开日2009年4月15日申请日期2008年11月17日优先权日2008年11月17日发明者张治国,徐同成,铎李申请人:浙江大学