专利名称：：饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测方法。
背景技术：
：因为隐孢子虫和贾第虫对生活用水和饮用水的污染而导致相关病症在英美等发达国家的暴发流行，且已对公众的健康构成了严重威胁，隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊(简称"两虫")也已成为倍受关注的介水传播生物危险因素之一。在我国新颁布的《生活饮用水卫生标准》中，己经将隐孢子虫和贾第虫作为水质非常规指标而规定了其限值，但是根据目前我国的饮用水处理工艺及水源水质和供水水质现状来看，存在"两虫"爆发的潜在风险很高，因此从保障饮用水安全角度考虑，研究两虫的检测方法具有很重要和很迫切的现实意义。目前常用的"两虫"检测方法有美国EPA1623方法、颗粒计数法和酸性染色法等。美国EPA1623方法是当前应用最广，发展最成熟的方法，同时也被我国推荐使用，该方法用免疫磁珠收集水样中的卵囊和孢囊，然后进行荧光镜检，具有很高的特异性，但该方法的缺点在于无法判断卵囊和孢囊的活性，这样也就无法用其衡量饮用水处理工艺对其杀灭效果，而且实验材料昂贵，成本很高，推广起来有一定难度；美国很多实验室采用颗粒计数法代替EPA1623方法用于水样的检测，该法自动化程度高，可用于在线检测，但易受与"两虫"粒径近似的颗粒物的干扰，误差较大，缺乏一定的精确度，而且同样无法区分"两虫"的死活；酸性染色法简便易行，结果明显，不需要复杂的仪器设备，检出率也较高，但同样也无法检测"两虫"的活性，适用于流行病学调査而不适用于对饮用水工艺处理效果的评价。
发明内容本发明为了解决现有的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测方法成本高、精确度低以及无法确定隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊活性的问题，而提供了一种饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法。本发明饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法按照以下步4骤进行一、先用200~500目的筛网过滤水样，然后用孔径为1.53.5(im的滤膜进行抽滤；二、将步骤一抽滤后的滤膜置于烧杯中，用510mL、pH值为7.2的缓冲溶液进行清洗，收集清洗下的附着物；三、将步骤二收集的附着物放置于离心管中，在转速为2000~4000r/min的条件下离心1020min，弃上清液；四、进行蔗糖梯度离心，在转速为15002500r/min的条件下离心515min，然后吸取离心管内的两层液面之间的中间层，放入到1.5mL的离心管中；其中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为12%16%和20%25%，上下两层蔗糖溶液体积相同；五、向步骤四的1.5mL的离心管中加入100pL、pH值为7.2缓冲溶液，10(iL、质量浓度为2g/L的DAPI溶液和10pL、质量浓度为2g/L的PI溶液混合均匀，在37"C条件下温育2h，然后在转速为2000~4000r/min、离心时间为5~15min的条件下离心浓縮至9ll^iL;六、将步骤五中离心浓縮得到的9ll|iL的样品滴于血球计数板上，在波长为330385nm紫外激发光源下和波长为520~550nm的绿光激发光源下进行荧光显微镜观察；即实现了对饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测。本发明方法对饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法的优点如下1、本发明方法能够检测出隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊有无活性。本发明通过荧光显微镜在绿色荧光下观察到发出亮红色的荧光的卵囊或孢囊，即为PI阳性的卵囊或孢囊，而不发光为PI阴性的卵囊或孢囊；通过荧光显微镜观察在紫外激发光下观察到发出天蓝色荧光的卵囊或孢囊，即为DAPI阳性的卵囊或孢囊个体，而不发光为DAPI阴性的卵囊或孢囊个体；其中，DAPI阳性PI阴性的个体为具有活性的隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊个体，DAPI阴性PI阳性的个体为死亡的隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊个体，从而确定出隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊有无活性。通过本发明的方法检测出自来水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊有无活性，从而更有利于自来水厂掌握自来水处理工艺中对"两虫"的去除和灭活情况，进一步降低了具有活性的"两虫"个体在饮用水中存在的概2、本发明方法精确度高。本发明的方法在荧光显微镜下观察到隐孢子虫卵囊大小为46)am，呈圆形或椭圆形，内部可见有子孢子；贾第虫孢囊大小为8~12pm，呈椭圆形，内有24个深色的核；本发明方法采用DAPI溶液和PI溶液作为染色剂，能够清楚的观察到隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊大小、形态；本发明的方法在荧光显微镜下，可以清晰的看见被染色的卵囊和孢囊，而其他不含DNA的杂质则无法被染色，也就不会发出激发荧光，而其他水中的生物体的干扰也可以通过"两虫"的形态特征进行排除，检测结果精确度高。3、本发明的方法对饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测成本低。本发明的检测方法不需要复杂的仪器设备，方法简单容易掌握，极大的减少了设备的投入，降低了检测成本。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式一种饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测方法按照以下步骤进行一、先用200~500目的筛网过滤水样，然后用孔径为1.53.5(am的滤膜进行抽滤；二、将步骤一抽滤后的滤膜置于烧杯中，用510mL、pH值为7.2的缓冲溶液进行清洗，收集清洗下的附着物；三、将步骤二收集的附着物放置于离心管中，在转速为20004000r/min的条件下离心1020min，弃上清液；四、进行蔗糖梯度离心，在转速为15002500r/min的条件下离心515min，然后吸取离心管内的两层液面之间的中间层，放入到1.5mL的离心管中；其中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为12%~16%和20%25%，上下两层蔗糖溶液体积相同；五、向步骤四的1.5mL的离心管中加入100pL、pH值为7.2缓冲溶液，10pL、质量浓度为2g/L的DAPI溶液和lO)iL、质量浓度为2g/L的PI溶液混合均匀，在37'C条件下温育2h，然后在转速为20004000r/min、离心时间为5~15min的条件下离心浓縮至9ll|iL;六、将步骤五中离心浓縮得到的9llpiL的样品滴于血球计数板上，在波长为330~385nm紫外激发光源下和波长为520550nrn的绿光激发光源下进行荧光显微镜观察；即实现了对饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检本实施方式的所用水样在24h内放置于4°C以下的温度避光保存。本实施方式在显微镜下可以观察到隐孢子虫卵囊大小为4~6|am，呈圆形或椭圆形，内部可见有子孢子；贾第虫孢囊大小为812pm，呈椭圆形，内有24个深色的核。本实施方式通过荧光显微镜在绿色荧光下观察到发出亮红色的荧光的卵囊或孢囊，即为PI阳性的卵囊或孢囊，而不发光为PI阴性的卵囊或孢囊；通过荧光显微镜观察在紫外激发光下观察到发出天蓝色荧光的卵囊或孢囊，即为DAPI阳性的卵囊或孢囊个体，而不发光为DAPI阴性的卵囊或孢囊个体；其中，DAPI阳性PI阴性的个体为具有活性的隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊个体，DAPI阴性PI阳性的个体为死亡的隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊个体。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中先用300400目的筛网过滤水样，然后用孔径为2~3pm的滤膜进行抽滤。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中先用300目的筛网过滤水样，然后用孔径为2~3(im的滤膜进行抽滤。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中pH值为7.2的缓冲溶液为磷酸缓冲液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一不同的是歩骤三中将步骤二收集的附着物在转速为3000r/min的条件下离心15min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中在转速为2000r/min的条件下离心10min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为13%~15%和21%~24%。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为15%和24%。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中在转速为3000r/min条件下、离心时间为10min的离心浓縮。其g步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中离心浓縮至10pL。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十一本实施方式一种饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测方法按照以下步骤进行一、先用300目的筛网过滤水样，然后用孔径为3)im的滤膜进行抽滤；二、将步骤一抽滤后的滤膜置于烧杯中，用10mL、pH7.2的缓冲溶液进行清洗，收集清洗下的附着物；三、将步骤二收集的附着物放置于离心管中，然后在转速为3000r/min的条件下离心15min，弃上清液；四、进行蔗糖梯度离心，在转速为2000r/min的条件下离心10min，然后吸取离心管内的两层液面之间的中间层，放入到1.5mL的离心管中；其中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为15%和24%，上下两层蔗糖溶液体积相同；五、向步骤四的1.5mL的离心管中加入100pL、pH值为7.2缓冲溶液，10jiL、质量浓度为2g/L的DAPI和10)iL、质量浓度为2g/L的PI混合均匀，在37°C条件下温育2h，在转速为3000r/min、离心时间为10min的条件下离心浓縮至911pL;六、取步骤五离心浓缩后的样品滴于血球计数板上，在波长为330nm紫外激发光源下和波长为530nm的绿光激发光源下进行荧光显微镜观察计数；即实现了对饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测。取蒸馏水作为水样进行对比实验，其中，第一组取10L蒸馏水，向水样中加入50个隐孢子虫卵囊和50个贾第虫孢囊，然后用本发明的具体实施方式十一的活性检测方法对加入隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的水样进行检测，第二组取10L蒸馏水，向水样中加入50个隐孢子虫卵囊和50个贾第虫孢囊，然后用现有的美国EPA1623方法对加入隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的水样进行检测；第三组取10L蒸镏水，向水样中加入50个隐孢子虫卵囊和50个贾第虫孢囊，然后用颗粒计数法对加入隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的水样进行检测；第四组取10L蒸馏水，向水样中加入50个隐孢子虫卵囊和50个贾第虫孢囊，然后用酸性染色法对加入隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的水样进行检测。这四组的检测结果如表l、2所示，其中表1为隐孢子虫卵囊的检测结果，表2为贾第虫孢囊的检测结果。表l隐孢子虫卵囊的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2贾第虫孢囊的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表1中可以看出，本发明的活性检测法对隐孢子虫卵囊的检出个数是15，活体数目为ll，检出率为30%，从表2中可以看出，本发明的活性检测法对贾第虫孢囊的检出个数是13，活体数目为8，检出率为26%，本发明的活性检测法与现有的美国EPA1623法、颗粒计数法和酸性染色法相比较，本发明的方法检出隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的数目多，检出率高，.且能够确定检测出的隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊有无活性，检测结果精确度高，本发明的方法在检测过程中没有使用复杂的仪器设备，方法简单容易掌握，极大的减少了设备的投入，降低了检测成本。权利要求1、饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测方法按照以下步骤进行一、先用200～500目的筛网过滤水样，然后用孔径为1.5～3.5μm的滤膜进行抽滤；二、将步骤一抽滤后的滤膜置于烧杯中，用5～10mL、pH值为7.2的缓冲溶液进行清洗，收集清洗下的附着物；三、将步骤二收集的附着物放置于离心管中，在转速为2000～4000r/min的条件下离心10～20min，弃上清液；四、进行蔗糖梯度离心，在转速为1500～2500r/min的条件下离心5～15min，然后吸取离心管内的两层液面之间的中间层，放入到1.5mL的离心管中；其中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为12％～16％和20％～25％，上下两层蔗糖溶液体积相同；五、向步骤四的1.5mL的离心管中加入100μL、pH值为7.2缓冲溶液，10μL、质量浓度为2g/L的DAPI溶液和10μL、质量浓度为2g/L的PI溶液混合均匀，在37℃条件下温育2h，然后在转速为2000～4000r/min、离心时间为5～15min的条件下离心浓缩至9～11μL；六、将步骤五中离心浓缩得到的9～11μL的样品滴于血球计数板上，在波长为330～385nm紫外激发光源下和波长为520～550nm的绿光激发光源下进行荧光显微镜观察；即实现了对饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测。2、根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤一中先用300400目的筛网过滤水样，然后用孔径为2~3pm的滤膜进行抽滤。3、根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤一中先用300目的筛网过滤水样，然后用孔径为3nm的滤膜进行抽滤。4、根据权利要求1或2所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤二中11值为7.2的缓冲溶液为磷酸缓冲液。5、根据权利要求4所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤三中将步骤二收集的附着物在转速为3000r/min的条件下离心15min。6、根据权利要求5所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤四中在转速为2000r/min的条件下离心10min。7、根据权利要求1、2、5或6所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤四中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为13%~15%和21%~24%。8、根据权利要求7所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤四中蔗糖溶液由上至下质量浓度依次为15%和24%。9、根据权利要求8所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征在于步骤五中在转速为3000r/min、离心时间为10min的条件下离心浓縮。10、根据权利要求9所述的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，其特征步骤五中离心浓縮至10pL。全文摘要饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的活性检测方法，本发明涉及一种饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测方法。本发明的方法解决了现有的饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测方法成本高、精确度低以及无法确定隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊活性的问题。本发明的方法按照以下步骤进行一、水样预处理；二、洗脱；三、浓缩；四、隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的提纯；五、染色；六、镜检观察孢子虫卵囊和贾第虫孢囊，即实现了对饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的检测。本发明方法不需要复杂的仪器设备，方法简单容易掌握，极大的减少了设备的投入，降低了检测成本，且能够检测出隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊有无活性，检测结果精确度高。文档编号C12Q1/02GK101430281SQ20081020972公开日2009年5月13日申请日期2008年12月17日优先权日2008年12月17日发明者吴明松,张玉玲,李绍峰,高云霞,黄君礼申请人:哈尔滨工业大学