专利名称：乙醇诊断/测定试剂(盒)及乙醇浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种乙醇诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乙醇浓度的方
法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
乙醇具成瘾性，酒滥用和酒依赖是当今世界范围内最严重的社会经济和公共卫生
问题之一。在西方国家，酒精相关性肝病已成为死亡的第六位原因。在我国，近20年来，随
着社会经济发展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依赖的患病率日趋增高。 生物样品中乙醇的定量测定方法主要有化学比色法，酶终点比色法，均相酶免疫
测定法(EIA)，气相色谱法(GC)和呼出气乙醇分析。此外血清渗透量法可作乙醇半定量分析。 有多种化学比色法曾用于乙醇定量测定，微量扩散法是其中较简单实用的一种， 微量溢出的乙醇可使铬酸还原成蓝色的氧化铬。 根据所用的试剂酶不同，乙醇的酶法测定分为二种乙醇氧化酶法和乙醇脱氢酶 法，与乙醇氧化酶法相比，乙醇脱氢酶法的专一性高，不会与甲醇和丙酮起催化反应。
—般认为气相色谱法可作为参考方法，尤其在准确性和精密度要求高的法医学乙 醇测定中应用最广。GC法的独特优点在于特异、灵敏，且能同时分析多种挥发性醇类物质， 如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和异丙醇。 其他乙醇的测定方法还有均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimm皿oassay)、 渗透量法、呼出气乙醇分析法；用呼出气乙醇分析仪检测乙醇操作简单、快速，在交通执法 部门应用较多。这类仪器中一种是根据红外光吸收原理设计的，该法测定的乙醇浓度与酶 法测得的血乙醇浓度相关性很好。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出 一 种利用酶循环倍增法
(EnzymaticRecycling&Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)
及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成喷嗒胺色原(Indamine dye)或
醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定乙醇
浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙醇诊断/测定试剂(盒)，采用该试
剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乙醇浓度测定，而且测定速度
快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明乙醇浓度测定方法如下 乙醇+氧酒精氧化酶乙醛+过氧化氡 乙醛+水过氧化氡酶乙醇+过氧化氢 过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水
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这个方法应用酒精氧化酶(alcohol oxidase ;EC 1. 1. 3. 13)(偶)联过氧化氢酶 (Catalase ;EC 1. 11. 1. 6)及过氧化物酶(peroxidase ;EC 1. 11. 1. 7)酶促反应速率比色 法。酒精氧化酶作为作用酶，功能为将乙醇酶解产生乙醛。过氧化氢酶作为循环酶过氧化
氢酶的酶促作用将乙醛再次变回乙醇，使乙醇不断地被重复循环利用，因此连续不断地产
生二个过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase ;EC 1. 11. 1. 7)作为显色酶，通过和过氧化氢 的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在 400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处测定染料_吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小速度，得出乙醇浓度大小
测定结果。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分
关系的本发明乙醇诊断/
缓冲液
稳定剂 过氧化物酶 酒精氧化酶 过氧化氢酶 还原型色原体组合
合.
定试剂(盒)较为理想
100,1/L 500,1/L 30000U/L 10000U/L 12000U/L 0. 1-20,1/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N， N-双乙基-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2 ，4-双氯石碳酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羟基 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3， 5-双氯石碳酸磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3， 5-双氯_2-羟基. 3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2， 2， -AZIN0-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺 4_氨基抗砒 石碳酸 4_氨基抗砒
N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺 4_氨基抗砒 N， N-双乙基-m-甲苯胺 4_氨基抗砒 2 ，4-双氯石碳酸 4_氨基抗砒 2，4，6-仨溴-3-羟基 4_氨基抗砒 3， 5-双氯石碳酸磺酸 4_氨基抗砒 3， 5-双氯_2-羟基 4_氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4_氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4_氨基抗砒
双甲基苯胺
4_氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4_氨基抗砒
2， 2， -AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4_氨基抗砒
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 4_氨基抗砒
3_甲基-乙基.
本发明的乙醇诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、酒精氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。
试剂2 缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、酒精氧化酶、过氧化氢酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、酒精氧化酶、过氧化氢酶在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。 也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。
试剂2 缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、过氧化氢酶、过氧化物酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、酒精氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、酒精氧化酶、过氧化氢酶在试剂1、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一 本实施例的乙醇诊断/测定试剂为单试剂，包括 [OO"]三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
酒精氧化酶 10000U/L
过氧化氢酶 12000U/L
过氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37 。C ，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测
试副波长600nm，被测乙醇样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，
检测方法为比色速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测
主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出乙醇的浓度大小。 实施例二0110] 本实施例的乙醇诊断/测定试剂为双试剂，包括 0111] 试剂l
0112]三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液lOOmmol/L 0113] 稳定剂 50mmol/L 0114] 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0. 2mmol/L 0115] 试剂2
0116]三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液lOOmmol/L 0117]稳定剂 500mmol/L 0118] 酒精氧化酶 10000U/L 0119] 过氧化氢酶 12000U/L 0120] 过氧化物酶 30000U/L 0121]4-氨基抗祉匕 0.6mmol/L
0122] 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 0123] 在全自动生化分析仪上设定温度37°C ，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测 试副波长600nm，被测乙醇样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)， 检测方法为比色速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。 —0124] 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出乙醇的浓度大小。
0125: 0126: 0127: 0128: 0129:
0130: 0131:
0132: 0133: 0134: 0135: 0136: 0137: 0138: 0139:
0140: 0141:
0142'
实施例三
本实施例的乙醇诊断/测定试剂为三试剂，包括
盐酸缓冲液lOOmmol/L 50mmol/L 0. 6mmol/L
盐酸缓冲液lOOmmol/L 500,1/L 12000U/L 30000U/L
试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷-稳定剂
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-稳定剂 过氧化氢酶 过氧化物酶
双甲基苯胺 2mmol/L 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 酒精氧化酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37 °C ，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测 试副波长660nm，被测乙醇样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)， 检测方法为比色速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出乙醇的浓度大小。 申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均 能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001 ;吸光度时间反应曲线应呈上 升曲线直至终点；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达15mmol/L ;试剂测试的不准确 度，其相对偏差不超过±3% ;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《1% ;试剂 的灵敏度可达O. 0500±0. 0250 AA/mmol/L ;试剂在2-8"下保存，活性可以稳定一年；—— 本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
一种酶循环倍增法、酶比色法及酶联法技术的乙醇浓度测定方法，其方法如下乙醇+氧 酒精氧化酶 乙醛+过氧化氢乙醛+水 过氧化氢酶 乙醇+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出乙醇浓度大小测定结果。
2. —种乙醇诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括还原型色原体组合 0. 1——20mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会 反应作用。其特征在于试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、酒精氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于由缓冲液、稳定剂、酒精氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂 试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、酒精氧 化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、 酒精氧化酶、过氧化氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、酒精氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、过氧化 氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、酒精氧化酶组成。过 氧化物酶、还原型色原体组合酒精氧化酶、过氧化氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。
6. 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于还包括稳定剂 l-4000mmol/L或0. 1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一 种。
7 根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于所述还原型色原体组 合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙醌亚胺色原+水缓冲液 稳定剂过氧化物酶 酒精氧化酶 过氧化氢酶石碳酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N， N-双乙基-m-甲苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2 ，4-双氯石碳酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2， 4， 6-仨溴-3-羟基-苯磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`3， 5-双氯石碳酸磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`3，5-双氯_2-羟基-苯磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐`3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2， 2， -AZIN0-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)`3- 甲基-2-苯噻唑酮腙`4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺 4_氨基抗砒石碳酸`4_氨基抗砒N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺`4_氨基抗砒N， N-双乙基-m-甲苯胺`4_氨基抗砒`2 ，4-双氯石碳酸`4_氨基抗砒`2， 4， 6-仨溴-3-羟基-苯磺酸`4_氨基抗砒`3， 5-双氯石碳酸磺酸4_氨基抗砒3，5_双氯_2-羟基-苯磺酸 4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4_氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4_氨基抗砒双甲基苯胺4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4_氨基抗砒2， 2， -AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4_氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4_氨基抗砒 3_甲基_乙基國
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环倍增法、酶比色法及酶联法技术的乙醇诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乙醇浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括缓冲液、酒精氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出乙醇浓度的大小。
文档编号C12Q1/26GK101762543SQ20081024426
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司