用于鉴定、扩增和去除成体干细胞和癌干细胞的方法

专利名称：用于鉴定、扩增和去除成体干细胞和癌干细胞的方法
用于鉴定、扩增和去除成体干细胞和癌干细胞的方法本发明涉及生物化学、药学和肿瘤学领域。本发明特别地涉及新的干细胞标志物 用于分离干细胞的用途。本发明还涉及获得的干细胞和它们在例如，研究或治疗中的用途， 例如用于制备治疗受损或患病组织的药物中的用途。本发明还涉及适合癌症治疗、并且更 具体地适合癌干细胞治疗的方法。成体干细胞(综述于1中)在成年人和成年小鼠的许多器官(如果不是全部)中发现了成体干细胞。尽管不 同的组织中成体干细胞的确切特征有相当大的变化，但是成体干细胞共有下述特征它们 保持未分化的表型；它们的后代能够向相关组织中存在的全部谱系分化；它们在整个生命 周期中保持自维持(self-maintenance)的能力；以及它们能够在损伤后再生相关的组织。 干细胞位于特定的位置，即干细胞小生境(niche)。所述小生境通常提供合适的细胞-细胞 接触和信号以维持“干性(sternness)”。某些组织表现出高水平的稳态更新。良好的实例是造血系统、皮肤和肠上皮。假 定在这类组织中的干细胞不断地促进自我更新过程。在稳态条件下，诸如脑、心肌或骨骼肌 的其它组织表现出非常少的增殖活性，如果有的话。这类组织中的干细胞很可能是休眠的， 并且只在失去分化的细胞时变得有活性，例如，损伤时。骨髓干细胞在过去的30年里一直是大量研究的主题。对其它成体干细胞的研究 最近才有代表性地开始。有限数目的成体干细胞研究取得了不错的进展，即，表皮干细胞、 毛囊干细胞、神经元干细胞和乳腺干细胞。在引人注目的实证中，显示了单个乳腺干细胞在 导入乳腺脂肪垫时再生了全部乳腺上皮(2)。干细胞的研究有两个先决条件1)必须可能识别和分离活的原代干细胞。特异性标志物(其组合)的可用性是必 需的。如在人和小鼠骨髓的初期研究所示例的，细胞表面标志物的组合允许分选强富集的 细胞群体。2)体外细胞培养或体内移植测定随后允许证明全部分化的细胞类型的长期增殖。 通常，根据这些测定系统，再分离并连续地测定干细胞来证明长期的干性和自我更新。作为成体干细胞的非限制性实例，更详细地讨论了肠干细胞。肠干细胞肠上皮是成体中最快速地自我更新的组织。少数干细胞被认为位于每个肠隐窝的 基底处以确保连续和无限的更新。与其它快速自我更新的组织相比，肠干细胞是相当令人 困惑的。没有关于这些细胞的离体或移植测定，肠干细胞的全部知识源自隐窝的原位组织 学分析。肠干细胞比填充隐窝上部位置的它们的增殖后代分裂得更慢。尽管有结肠干细胞 位于隐窝底部的共识，但是干细胞在小肠中的定位仍然是有争议的问题。利用长期DNA标 签保留(Long Term DNA label Retention)测定，Potten和同事提供了支持位于+4位置 的帕内特(Paneth)细胞区室直接上方的的定位证据(综述于3、4中)。谱系追踪研究使 得Bjerknes和Cheng认为不同的细胞类型，即所谓的隐窝基底柱状细胞，可以代表真实的 干细胞。这些隐窝基底柱状细胞在隐窝的最底部与帕内特细胞互相混合(5)。
最近才提出肠干细胞的某些候选基因标志物即Musashi (6,7)和磷酸 化-PTEN(8)。我们和其它人发现，Musashi表达区域含有每个隐窝30至50个细胞，这比存 在的干细胞多得多(参见下文)，而磷酸化-PTEN标志物可能表示人为产物(9)。取决于所用的试验方法，成体隐窝中的干细胞的数目估计为1个至6个(10)。这 些年来，干性是否是通过不对称分裂自我延续的一组属性，或者隐窝底部是否充当为位于 其中的祖细胞提供这些属性的小生境仍然是争论的问题。通过甲基化标签的分析进行的一 个隐窝中的细胞谱系研究(11)表明，干细胞随机地以不对称的方式分裂(即，一个子干细 胞加一个分化祖细胞)或者以对称的方式分裂(即，两个子干细胞或两个分化祖细胞)。值 得注意的是，尽管从上述的研究推断出存在不对称和对称的细胞分裂，但是迄今为止在肠 上皮的有丝分裂中尚未观察到决定因素的不对称分布的正式证据。当定向祖细胞达到结肠直肠隐窝上三分之一(或小肠中的绒毛)时，它们分化成 吸收细胞(结肠细胞/肠细胞)或分泌谱系细胞(杯状细胞、肠内分泌细胞、帕内特细胞 (Paneth cells))。从这一位置向上，分化的细胞继续朝向沿着隐窝-绒毛轴延伸的连贯带 (coherent band)中的绒毛迁移，或者在结肠直肠上皮表面组成六角形状的聚簇。作为这个 规则的例外，帕内特细胞朝着小肠中的隐窝底部迁移(综述于12中)。癌干细胞(综述于13、14中)癌干细胞假说假定，少量储存的自持细胞(self-sustaining cells)能够专门地 自我更新并维持肿瘤。这些癌干细胞能够扩增癌干细胞池，但是也产生组成肿瘤主体的异 质细胞类型。癌干细胞可以对已开发的用于根除组成肿瘤主体的快速分裂细胞的治疗相对 耐受。癌干细胞还可以是最可能转移的细胞。因此，癌干细胞假说要求我们重新考虑我们 诊断和治疗肿瘤的方式。治疗将必须靶向刺激肿瘤生长和转移的“少数”干细胞群体，而不 是肿瘤的主体。癌干细胞假说处在快速发展的领域的中心，并且可能改变基础和临床研究 者看待癌症的方式。在20世纪90年代，John Dick和其他人对急性髓细胞性白血病(AML)的研究支 持该病中癌干细胞的存在(15、16)。造血谱系图和不同细胞类型与谱系的细胞表面标志物 的可用性极大地促进了确定造血恶性肿瘤中细胞起源的努力。推定的AML干细胞被证明能 够在受照射的N0D/SCID小鼠中再生人AML。AML干细胞表现出类似于正常人造血祖细胞的 ⑶34+CD38—表型，这表明AML干细胞与正常干细胞之间的密切的相似性。最近，还在许多实体瘤中鉴定了癌干细胞。Clarke和同事将来自人乳腺肿瘤的分 级的细胞移植到N0D/SCID小鼠中。少至几百个的CD44+CD247低细胞能够在小鼠中建立肿 瘤，而来自不同级分的上万个细胞不能诱导肿瘤(17)。这个实例后面有多个关于实体瘤的 其它研究。例如，利用也在正常神经干细胞中发现的CD133标志物，从人成神经管细胞瘤和 成胶质细胞瘤分离了能够在N0D/SCID小鼠中连续地产生可移植的脑瘤的脑瘤干细胞(综 述于18中)。Hoechst染料排出的侧群(side population) (SP)细胞的分选和CD44的分 选允许在前列腺癌中分离癌干细胞(综述于19中)。在文献中对于癌干细胞的定义有些混乱。在此处，我们采纳在最近的AACR研究会 上达成的共识(14)，其规定癌干细胞“是肿瘤内的细胞，具有自我更新和产生组成肿瘤的癌 细胞的异质谱系的能力。因此癌干细胞只能够依据它们重演不断生长的肿瘤的产生的能力 试验性地定义”。文献中的可选择的术语包括肿瘤起始细胞和致瘤细胞。癌干细胞活性的测定需要处理自我更新和肿瘤增殖的潜力。目前，金标准测定是免疫缺陷小鼠中的连续异 种移植。作为癌干细胞的非限制性实例，更详细地讨论了结肠癌干细胞。结肠癌干细胞癌干细胞假说能够被外推至人结肠癌吗？两个最近的研究暗示确实是这样的。 John Dick和同事研究了⑶133作为结肠直肠癌细胞的标志物的用途(20)。⑶133或 Prominin，是与多种组织和癌症中的干细胞群体和祖细胞群体有关的标志物。他们发现在 5%至20%的人结肠癌细胞上表达了⑶133。随后的连续异种移植测定证明，⑶133+细胞 而不是CD133-细胞能够在免疫缺陷的小鼠中引发肿瘤形成。经计算，分离的CD133+群体 中癌干细胞的发生率稍低于0.5%。沿着类似的路线，De Maria和同事发现，⑶133+细胞 包含少于2. 5%的人结肠癌细胞，并且还证明这些细胞能够被连续地移植到免疫缺陷的小 鼠中(21)。而且，利用含有EGF和FGF2的无血清培养基，能够将CD133+细胞在培养中维持 长时间段。这些研究暗示，结肠癌可能代表了实体瘤的另一实例，其中少量的癌干细胞负责 维持肿瘤。CD133标志物表达的分选明显地富集了癌干细胞，但是所得的细胞混合物非常不 纯。因此，分选的细胞制备物(preparation)中癌干细胞的确切属性仍然是不清楚的，例如 它们的细胞循环状态，或者它们对化学疗法或放射疗法的抗性。US 2004/0058392和EP 1 400 807描述了在结肠癌细胞系Lsl74T中确定的一系 列TCF靶基因(22)。在这些申请中，推测在结肠癌细胞和肠隐窝中表达的这些分子将代表 干细胞标志物。几种所述标志物编码细胞表面蛋白。US 2004/0058392和EP 1 400 807的 发明人设想，这些蛋白能够用作选择肠道中高丰度的干细胞群体的标志物。然而，结果是这 些蛋白的绝大部分不适合作为干细胞选择标志物，因为它们不是由干细胞(特异性地)表 达的。例如，全部的分裂隐窝细胞表达CD44蛋白(23)，cMyb (24)和GPX2 (25)也是如此。 非分裂的肠内分泌细胞表达c-Kit蛋白(26)。全部的分裂细胞表达EphB2，而非分裂的帕 内特细胞表达EphB3(27)。绒毛中的基质细胞表达BMP4 (28)。Claudinl的表达几乎无处不 在(29)。本发明提供了鉴定成体干细胞和/或组织干细胞以及癌干细胞的标志物。鉴定的 成体干细胞和/或组织干细胞在受损或患病组织的修复中是有用的。本发明还提供了允许 分离成体干细胞和/或组织干细胞和/或癌干细胞的方法。本发明还提供了用于培养或维 持或繁殖(分离的)成体干细胞和/或组织干细胞和/或癌干细胞的体外方法。本发明还 提供了允许鉴定和根除癌干细胞标志物的方法。本发明的一个目的是提供用于鉴定成体干 细胞和癌干细胞的方法的新标志物。本发明的另一目的是提供适合维持/培养/繁殖/扩 增成体干细胞的方法。本发明的另一目的是根除癌干细胞。成体干细胞通常是从组织分离 的，因此又被称为组织干细胞。表面受体Lgr5和Lgr6在多种组织标记成体干细胞，并且在多种类型的癌症中标 记癌干细胞。本发明人披露了表面分子Lgr5(又称为Grp49)和Lgr6的表达模式在多种组 织中独立地标记成体于细胞，并且在多种类型的癌症中独立地标记癌干细胞。诸如LH、FSH 和TSH的受体的糖蛋白激素受体属于大G蛋白偶联受体(GPCR)超家族，但是在携带对配 体结合重要的大富亮氨酸胞外结构域中是独特的。人基因组中这些含有富亮氨酸重复的G蛋白偶联受体被称为LGR。系统发生分析表明存在三种LGR亚型已知的糖蛋白激素受体； LGR4至LGR6 ；以及LGR7所代表的第三亚型(30)。LGR5和LGR6是本发明的主题。科学文 献中没有描述这两类受体的配体；因此，这类受体通常被称为孤儿受体(orphan)。人、小鼠 和大鼠受体的序列示于图10中。人LGR4包含951个氨基酸，其中447个氨基酸与LGR5中 的对应氨基酸相同，并且其中485个氨基酸与LGR6中的对应氨基酸相同。人LGR5包含907 个氨基酸，其中387个氨基酸与LGR6中的对应氨基酸相同。LGR6由967个氨基酸组成。这 些受体的预测结构示于图11中。三个受体中，LGR4/GPR48是研究得最多的基因。根据科学 文献，LGR4/GPR48在多种组织中广泛地表达(31、32)，并不是特异性地与干细胞有关。在遗 传小鼠模型中，LGR4/GPR48被描述为对子宫内生长(32)、雄性生育(33)和肾脏发育(34) 是重要的。已经敲除了 LGR5/GPR49。由于舌头和下颚缺陷，突变体胎儿在出生后死亡(35)。 LGR5/GPR49在肝癌和结肠癌中是过量表达的(22、36、37)。除了初始克隆和序列分析以外， 还没有对LGR6进行研究(30)。在第一实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)成体干细胞的方法，该方法 包括下述步骤-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离。本发明的方法允许获得(或分离)细胞集合(collection)，该细胞集合包含、优选 地仅包含至少50 %的干细胞、更优选至少60 %、更优选至少70 %、更优选至少80 %、最优选 至少90 %的干细胞，例如90 %至99 %的干细胞或者95 %至99 %的干细胞，所述方法包括下 述步骤-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr6和/或Lgr5结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离。分离的干细胞集合包含、并且优选地仅包含多于50%的干细胞，更优选至少 60 %、更优选至少70 %、更优选至少80 %、最优选至少90 %的干细胞，诸如90 %至99 %的 干细胞，或者95%至99%的纯多能干细胞，其能够保持未分化的表型。所述细胞在整生命 周期中保持自维持的能力；并且能够在损伤后再生相关的组织。它们的后代，或非干细胞 子代细胞，能够朝向相关组织中存在的全部谱系分化。能够从细胞悬液分离所述细胞集合， 该细胞悬液包含干细胞和非干细胞子代细胞，例如定向的或分化的子代祖细胞(daughter progenitor cell)。成体干细胞优选地是从胚后组织获得的干细胞。优选出生后的组织。 在诸如人的灵长类中，优选地从至少一岁的个体获得成体干细胞，优选发育期后的个体。在 本发明的优选实施方案中，所述干细胞是成体干细胞和/或癌干细胞。包含多于50%的多能干细胞的干细胞集合的主要优势是，与包含少于50%的纯 多能干细胞的干细胞集合相比，所述群体包含较少的能够不利地影响干细胞的自维持能力 和/或干细胞的分化能力的细胞。这些具有不利影响的细胞包括非干细胞子代细胞或与干 细胞共分离的其它非干细胞。
纯或几乎纯的成体干细胞的群体另外的优势是有限的细胞数目能够用作治疗其 中相应的组织已经被侵袭的疾病的治疗剂，该治疗剂的组合物是公知的。优选地，所述干细胞是组织干细胞，诸如例如肠干细胞、皮肤干细胞或视网膜干细 胞。本发明优选地提供了用于分离组织干细胞的方法，所述方法包括上文所述的步骤。所 述干细胞不包括人胚胎干细胞。当分离成体干细胞和/或组织干细胞时，优选地从来自待 分离的组织干细胞和/或成体干细胞的特定组织的细胞集合开始。通常，组织干细胞和/ 或成体干细胞定向形成所述组织的细胞，然而，能够例外地操作组织干细胞和/或成体干 细胞来产生其它组织的细胞。干细胞是在多细胞有机体中发现的原始细胞。它们保持了通过有丝细胞分裂自我 更新的能力，并且能够分化成多种范围的特化的细胞类型。哺乳动物干细胞的三种广泛类 别是胚细胞(源自胚泡)、成体干细胞(在成体组织中发现的)和脐带血干细胞(在脐带 中发现的)。干细胞的定义要求，干细胞至少能够自我更新(经历多个细胞分裂周期而维持 未分化状态的能力)并且具有无限的潜能(分化成任何成熟细胞类型的能力，即是全能、多 能(pluripotent)、专能(multipotent)或单能的)。在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该方法包 括-任选地从正常组织样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中，所述干细胞是成体干细胞，更优 选哺乳动物成体干细胞，甚至更优选人成体干细胞。这些成体干细胞通常充当身体的修复 系统并且补充特化的细胞。在儿童以及成人中发现了成体干细胞，并且大部分成体干细胞 是谱系限制的(专能的)，并且通过它们的组织来源来命名，例如皮肤干细胞或视网膜干细 胞。能够通过任何已知的方法来获得组织或器官样本，例如活组织检查。而且，能够从 任何可能的组织或器官获得组织或器官样本，例如但不限于心脏、视网膜、乳房、卵巢、肺、 脑、眼、胃、胰腺、肝脏、包括结肠和直肠组织的肠、皮肤、毛囊和肾上腺髓质。本文所用的短语“正常组织或器官样本”意指健康的、未转化的 (non-transformed)、非恶性、非癌性或非致瘤的组织或器官样本，即健康的、未转化的、非 恶性、非癌性或非致瘤的组织或器官样本。任何病理学家、本领域的技术人员能够确定组织 是否是健康未转化的、非恶性、非癌性或非致瘤的。在优选的实施方案中，所用的组织或器官样本的来源是哺乳动物人。甚至更优选 地，所述组织是成体组织(即，出生后的哺乳动物，即，非胚胎/胎儿组织)。骨髓和(脐带)血液能够被视为天然细胞悬液。例如，能够通过将器官组织机械 破碎成小碎片来从实体器官获得细胞悬液。任选地，能够通过诸如EDTA的化学制剂和/或 通过使用，例如胰蛋白酶、分散酶、胶原酶或胰酶制剂的酶制剂的酶性消化来将这些碎片进 一步分散成单个的细胞。操作步骤能够包括在破碎和/或酶性消化操作步骤前、期间或后 的组织或细胞培养。由于并不总是需要从所用的结合化合物中分离干细胞，因此所述步骤代表了所附的权利要求中任选特征。当需要从Lgr5和/或Lgr6结合化合物分离干细胞时，能够通过 对本领域技术人员公知的多种方法来进行分离。合适的实例是(机械)搅拌、酶性消化、添 加过量的结合化合物或其衍生物，通过改变PH或盐浓度来进行的洗脱。既然本发明人提供了 Lgr5或Lgr6是干细胞(独特的)标志物的证据，能够结合 Lgr5和/或Lgr6的化合物(S卩，Lgr5或Lgr6结合化合物)能够用于鉴定、标记和分离干 细胞。Lgr5或Lgr6结合化合物的一个合适的实例是能够结合Lgr5或Lgr6的抗体或抗 体衍生物或抗体片段，即对Lgr5或Lgr6具有亲和力的抗体或其衍生物或片段。由于Lgr5 和Lgr6是跨膜表面蛋白，所以这类抗体或其衍生物或片段优选地具有对朝向外部的蛋白 部分的亲和力，即结合任何胞外部分。在优选的实施方案中，所述抗体或抗体衍生物或抗体 片段具有对Lgr5和/或Lgr6的高亲和力。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该 方法包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中，所述Lgr5和/或Lgr6结合化合 物是能够结合Lgr5和/或Lgr6的抗体或抗体衍生物或抗体片段。能够通过对本领域技术人员公知的方法来提供抗体或它们的衍生物和/或它们 的片段，所述方法包括正常或转基因小鼠或兔中的杂交瘤技术或噬菌体展示抗体技术。在 一实施方案中，使用了基因免疫。这种技术包括向非人的动物给药编码至少一种感兴趣的 抗原的核酸序列或其功能性等同物。该动物产生所述编码的抗原，该抗原刺激动物针对所 述抗原的免疫系统。因此，在所述动物中引发起了针对所述抗原的免疫应答。随后，优选地 从所述动物获得对感兴趣的抗原特异性的T细胞、B细胞和/或抗体。任选地，进一步加工 所述T细胞、B细胞和/或抗体。在一优选的实施方案中，将获得的感兴趣的B细胞用于杂 交瘤技术，其中将所述获得的B细胞与肿瘤细胞融合来获得产生杂种抗体的细胞。合适的抗体片段的实例是ScFV、Fab或(Fab) 2片段。合适的衍生物的实例是嵌合 抗体、纳米抗体(nanobody)、双功能抗体或人源化抗体(humanized antibody)。仍然在另一优选的实施方案中，所用的抗体是单克隆抗体。在另一优选的实施方案中，Lgr5和/或Lgr6结合化合物包括抗体或抗体衍生物 或抗体片段，该抗体或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的重链⑶R1、⑶R2和/或 ⑶R3序列，优选地还包含互补免疫球蛋白轻链分子，从而根据Kabat来确定⑶R序列(Kabat et al. /'Sequences of Proteins of Immunological Interest胃胃 的胃白的;^ 列)，"U. S. Dept. of Health and Human Services,National Institute ofHealth,1987)。 优选地，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的重链的重链CDR1序列和重 链⑶R2序列及重链⑶R3序列。发明人发现，包含如图27所示的重链⑶R1、⑶R2和/或 CDR3序列的、诸如例如ScFV、Fab或(Fab) 2片段的抗体或抗体衍生物或抗体片段组成了对 它们的靶蛋白具有高特异性的高亲和力结合化合物。在另一优选的实施方案中，Lgr5和/或Lgr6结合化合物包含抗体或抗体衍生物或抗体片段，该抗体或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的轻链CDR1、CDR2和/或CDR3 序列，并且优选地还包含互补免疫球蛋白重链分子，从而根据Kabat来确定⑶R序列(Kabat et al. /'Sequences of Proteins of Immunological Interest胃胃 的胃白的;^
列)，"U. S. Dept. of Health and Human Services,National Institute ofHealth,1987)。 优选地，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的轻链的轻链CDR1序列和轻 链⑶R2序列及轻链⑶R3序列。发明人发现，包含如图27所示的轻链⑶R1、⑶R2和/或 CDR3序列的、诸如ScFV、Fab或(Fab) 2片段的抗体或抗体衍生物或抗体片段组成了对它们 的靶蛋白具有高特异性的高亲和力结合化合物。在一优选的实施方案中，Lgr5和/或Lgr6结合化合物包括如表4或5所示的抗 体。因此本文还提供了使用如表4或5所示的抗体的本发明的方法，以及使用包括如 图27所示的至少一种CDR序列的抗体或抗体衍生物或抗体片段的本发明的方法。优选地， 所述抗体或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的轻链和/或重链的CDR1序列和CDR2 序列和⑶R3序列。在一具体的实施方案中，包含如图27所示的重链和/或轻链⑶R1、⑶R2和/或 CDR3序列的结合化合物是大鼠单克隆抗体。在优选的实施方案中，包含如图27所示的重 链和/或轻链CDR1、CDR2和/或CDR3序列的结合化合物是嵌合单克隆抗体、去免疫化单克 隆抗体或人源化单克隆抗体。产生包含如图27所示的重链和/或轻链CDR1、CDR2和/或 CDR3序列的嵌合单克隆抗体、去免疫化单克隆抗体或人源化单克隆抗体或其衍生物或片段 的方法在本领域是公知的。例如，能够产生包含啮齿类可变区的嵌合抗体，该可变区包含与 诸如人的非啮齿类恒定区融合的标示的⑶R序列(Morrison et al. 1984. Proc Natl Acad Sci USA 81 =6851-6855 ；该参考文献通过引用的方式在此处被并入)。包含如图27所示的 重链和/或轻链CDR1、CDR2和/或CDR3序列的结合化合物的去免疫化方法对本领域技术 人员也是已知的，例如，来自Giovannoni，2003. Neurology 61 :S13_S17的方法；该参考文 献通过引用的方式在此处被并入。主要通过将CDR区移植至人免疫球蛋白构架区来实现非 人抗体的人源化，例如，如通过引用的方式并入本文的US6548640、US5530101和US5859205 所示。还能够在具有编码免疫球蛋白重链和/或轻链基因的人序列的动物中产生抗 Lgr5或Lgr6的人抗体，所述动物例如小鼠的转基因品系，其中小鼠抗体基因的表达被抑制 并且被人抗体基因表达有效地取代。Medarex的HuMAb -小鼠技术、Kirin的TC Mouse 技术以及KM-Mouse 技术，即合并了 HuMAb小鼠与TC小鼠的特性的杂种小鼠提供了实例。本发明还提供了本发明的结合化合物在从包含干细胞和定向或分化的子代祖细 胞的细胞群体中鉴定或分离干细胞中的用途；从而所述分离的干细胞包含至少50%的纯 多能干细胞。Lgr5或Lgr6结合化合物的另一实例是Lgr5或Lgr6配体。这种Lgr5或Lgr6配 体能够不加修饰地使用，能够被制备成和/或用作融合蛋白(即，配体融合蛋白)，或者能够 与第二部分偶联使得，例如，细胞得以分开。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该 方法包括
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-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中，所述Lgr5和/或Lgr6结合化合 物是Lgr5或Lgr6配体，例如，配体融合蛋白。本领域技术人员能够非常好地制备Lgr5或Lgr6配体融合蛋白，例如通过标准分 子生物学技术来制备。Lgr5或Lgr6配体的合适的实例是胰岛素肽家族的成员，例如Ins 15或松弛素3。 另一合适的实例是半胱氨酸结蛋白，例如头发生素(NogginhGremlinl或Gremlin2、Dan或 Cerberus.这些配体的核苷酸序列和氨基酸序列是公知的，因此本领域技术人员，例如能够 制备配体融合蛋白。优选地，配体融合蛋白的第二部分导入了允许容易地鉴定和追踪该融合蛋白的特 征，例如诸如抗体Fc尾部或葡萄球菌A蛋白或谷胱甘肽S-转移酶的蛋白(片段)，诸如 Myc、FLAG或HA标签或寡聚组氨酸标签的短抗原性肽标签，诸如碱性磷酸酶的酶标记，诸如 绿色荧光蛋白的荧光蛋白标签。还能够将小的化学部分偶联至用于干细胞鉴定和/或分离 的配体。这些部分能够被被特异性抗体识别并结合，或者能够具有对用于细胞分离的物质 特异性的亲和力，或者能够是例如，发荧光的。在甚至更优选的在实施方案中，使融合蛋白 的第二部分通过间隔子(spacer)连接至Lgr5或Lgr6配体。甚至更优选地，所述间隔子包 含酶可消化的序列。这使得第二部分与Lgr5或Lgr6配体能够容易地分开。Lgr5或Lgr6结合化合物的另一实例是具有对Lgr5或Lgr6的亲和力的小化合物。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该 方法包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中，所述Lgr5或Lgr6结合化合物是 具有对Lgr5或Lgr6的亲和力的小分子。合适的实例是小化学分子或小非化学分子或小蛋白。在优选的实施方案中，所述小分子对Lgr5或Lgr6的亲和力是高亲和力，即Kd为 至少10_7的亲和力。如上文已经描述的，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该方法包 括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中，所述细胞优选地是(成体)(组 织)干细胞。能够通过上文所述的方法获得的干细胞的非限定性实例是皮肤、包括结肠和直肠 在内的肠、眼、视网膜、脑、乳房、毛囊、胰腺、胃、肝、肺、心脏、肾上腺髓质或卵巢干细胞。以前，获得或分离胃、肠或视网膜干细胞一直是不可能的。因此，在优选的实施方案中，所述获 得的或分离的干细胞是胃、肠或视网膜干细胞。取决于期望的成体干细胞和/或组织干细胞以及Lgr5和/或Lgr6的存在与否，能 够用至少1种、至少2种、至少3种或者甚至更多种(不同的)结合化合物来实施本发明的 方法。表1提供了不同类型的成体干细胞和/或组织干细胞上存在或不存在Lgr5或Lgr6 的概述。基于表1，本领域技术人员能够非常好地选择一个或多个靶标志物和一个或多个对 应的结合化合物以从特定的正常组织或器官获得或分离干细胞。表1 成体和/或组织干细胞标志物Lgr5和Lgr6的分布 例如，如果本领域技术人员要获得乳房干细胞，则能够单独地使用Lgr5或Lgr6的 结合化合物，或使用其任何组合，因为该乳房干细胞包含两种所述标志物。在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该方法包 括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液
-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中 所述Lgr5和/或Lgr6结合化合物是Lgr5结合化合物，其中所述干细胞是脑、肝、 视网膜、胃、肠、胰腺、卵巢、毛囊、肾上腺髓质、皮肤、膀胱、骨、耳、肌肉、前列腺、胎盘或乳房 干细胞；或者 所述Lgr5和/或Lgr6结合化合物是Lgr6结合化合物，并且其中所述干细胞是 脑、皮肤、肺、乳房、毛囊、骨髓、眼或心脏干细胞；或者 所述Lgr5和/或Lgr6结合化合物是至少一种Lgr6结合化合物与至少一种Lgr5 结合化合物的组合，其中所述干细胞是脑、乳房、皮肤、结缔组织、子宫或毛囊干细胞。仍然在另一优选实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该 方法包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中所述干细胞是在表1中鉴定的任 何干细胞，并且其中所用的Lgr5和/或Lgr6结合化合物对应于如表1所示的期望的干细 胞，其条件是如果所述干细胞是肠或毛囊细胞，则所述Lgr5或Lgr6结合化合物不唯一地靶 向Lgr5 (即，不只是Lgr5结合化合物)。在优选实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该方法包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中使用了一种结合化合物。仍然在另一优选实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该 方法包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触_鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中使至少两种不同的结合化合物与 所述细胞悬液接触。所述两种不同的结合化合物能够针对同一种标志物(即，针对Lgr5或 针对Lgr6)。例如，能够使用抗两种不同表位的两种抗体，所述抗体共同地提供(优选基本 上完全)捕获期望的干细胞。然而，所述两种不同的结合化合物还能够针对两种不同的干 细胞标志物(即，一个针对Lgr5的结合化合物和一个针对Lgr6的结合化合物)。当使用 两种或三种或甚至更多种结合化合物时，所述结合化合物可以来自相同类型的结合化合物 (例如，全部是抗体、小分子或配体融合蛋白)或者可以来自不同类型的结合化合物(例如， 抗Lgr6的抗体和结合Lgr5的配体融合蛋白)在优选的实施方案中，使能够结合Lgr5或Lgr6的至少两种不同的抗体或抗体衍 生物或抗体片段与细胞悬液接触。
15
允许所述结合化合物与所述细胞悬液接触后(保持一定量的时间或在不同的条 件下，例如PH、温度、盐等)，随后鉴定获得的结合复合物。例如，这通过利用FACS分析来进 行。荧光活化细胞分选(FACS)是专门类型的流式细胞术。它提供了基于每个细胞特定的 光散射和荧光特性，每次一个细胞地将生物细胞的异种混合物分选至两个或更多个容器的 方法。荧光活化细胞分选仪是有用的科学仪器，因为它提供了对来自单独细胞的荧光信号 的快速、客观和定量的记录以及对特别感兴趣的细胞的物理分离。在优选实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该方法包 括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，其中将FACS用于鉴定和分选与Lgr5或 Lgr6结合化合物结合的细胞。分离干细胞的其它选择利用与干细胞上的Lgr5或Lgr6结合的结合化合物并联合 磁珠分选、免疫亲和柱细胞分离或淘选。对于通过FACS的分析，为结合化合物提供了荧光标签，对于通过磁珠分选的分 析，为结合化合物提供了磁珠(例如，包被了抗体的磁珠)，对于免疫亲和，结合化合物与固 体支持物结合，对于淘选，结合化合物与组织培养皿结合。既然我们知道Lgr5和/或Lgr6是成体干细胞的标志物，这种知识还能够用于培 养成体干细胞的方面。Lgr5和/或Lgr6的配体以及Lgr5和/或Lgr6的小分子激动剂能 够用作正常(即健康的、非转化的、正常的)成体干细胞生长的刺激物。因此，本发明还提供了用于维持或培养组织或器官干细胞的方法，该方法包括为 组织或器官干细胞提供Lgr5和/或Lgr6配体或者Lgr5和/或Lgr6的小分子激动剂。本文使用术语“维持”来描述干细胞的数目基本上没有变化的情况。本文使用术语 “培养”来描述干细胞的量增加的情况，即其中所述细胞被扩增但保持它们的干细胞表型。为组织或器官干细胞提供了 Lgr5和/或Lgr6配体后，在允许维持或扩增的条件 (温度、培养基、PH)下，将细胞在组织培养中进行孵育。能够通过任何合适的方法来获得干细胞，但是优选通过任何本文所述的方法来获 得，即，用于获得(或分离)干细胞的方法，其包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离。在优选的实施方案中，本发明提供了用于维持或培养组织或器官干细胞的方法， 该方法包括为组织干细胞提供Lgr5和/或Lgr6配体或Lgr5和/或Lgr6的小分子激动 剂，其中所述配体是胰岛素肽家族的成员。Lgr5或Lgr6配体的合适实例是胰岛素肽家族的 成员，诸如Insl5或松弛素3。另一合适的实例是半胱氨酸结蛋白，诸如头发生素、Gremlinl 或 Gremlin2、Dan 或 Cerberus。本发明还提供了(分离的)干细胞或分离的干细胞的集合，优选地来自哺乳动物来源，甚至更优选人干细胞或人成体干细胞，其中至少50%的细胞是Lgr5或Lgr6阳性的 多能干细胞。优选地，至少60%的细胞是Lgr5或Lgr6阳性的多能干细胞。更优选地，至 少70%的细胞是Lgr5或Lgr6阳性的多能干细胞。更优选地，至少80%的细胞是Lgr5或 Lgr6阳性的多能干细胞。更优选地，至少90%的细胞是Lgr5或Lgr6阳性的多能干细胞。 更优选地，至少95%的细胞是Lgr5或Lgr6阳性的多能干细胞。如上文所示，能够增加该集 合的纯度。在优选的实施方案中，本发明提供了(分离的)干细胞或分离的干细胞的集合， 其中所述干细胞含有结合的特异性Lgr5和/或Lgr6结合化合物。优选如上文所述的特异 性Lgr5和/或Lgr6结合抗体或其片段或衍生物。本发明还提供了干细胞的培养物，包含 对Lgr5和/或Lgr6特异性的结合抗体，或所述Lgr5和/或Lgr6结合抗体的至少20个氨 基酸的特异性片段。在优选的实施方案中，所述干细胞是，或者所述干细胞的集合包括脑、肝、视网膜、 胃、包括结肠和直肠在内的肠、卵巢、毛囊、肾上腺髓质、皮肤、膀胱、骨、结缔组织、耳、肌肉、 前列腺、胎盘、子宫或乳房干细胞，这些干细胞在它们的细胞膜中包含Lgr5。在特别优选的实施方案中，所述干细胞是，或者所述干细胞的集合包括脑、肺、皮 肤、乳房、毛囊、结缔组织、子宫、骨髓、眼或心脏干细胞，这些干细胞在它们的细胞膜中包含 Lgr60在另一优选的实施方案中，所述干细胞是，或者所述干细胞的集合包括脑、乳房、 皮肤、结缔组织、子宫或毛囊干细胞，这些干细胞在它们的细胞膜中包含Lgr6。仍然在另一实施方案中，本发明提供了干细胞或干细胞的集合，其中至少50%、优 选至少60 %、更优选至少70 %、更优选至少80 %、更优选至少90 %、更优选至少95 %的细胞 是通过本发明的方法可获得的Lgr5或Lgr6阳性的多能干细胞，所述本发明的方法即(i)用于获得(分离)干细胞的方法，该方法包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，和/或(ii)用于维持或培养组织干细胞的方法，该方法包括为组织干细胞提供Lgr5和 /或Lgr6配体或Lgr5和/或Lgr6的小分子激动剂。根据本发明分离的干细胞或干细胞的集合能够用作治疗其中相应的组织已被侵 袭的疾病的治疗剂。然而，所获得的干细胞对其它用途也是非常有用的。仍然在另一有用的实施方案中，本发明提供了通过任何本文所述的方法获得的干 细胞或干细胞的集合在制备用于治疗受损或患病组织的药物中的用途。优选地，所述干细胞是人干细胞。甚至更优选地，所述受体也是人。表2提供了不 同的干细胞和能够使用这些干细胞治疗的疾病的概述。表2.使用Lgr5+和/或Lgr6+干细胞的治疗应用 因此，本发明提供了通过任何本文所述的方法获得的干细胞或干细胞的集合在制 备用于治疗受损或患病组织的药物中的用途，_其中所述干细胞是肠干细胞，并且其中所述组织损伤是肠上皮的损伤、肝脏的损 伤或胰腺的损伤，或者-其中所述干细胞是视网膜干细胞，并且其中受损的组织是受损的视网膜；这种 方法在治疗由于视网膜缺陷导致的失明中是有用的；或者_其中所述干细胞是脑干细胞；或者-其中所述干细胞是乳房干细胞；或者_其中所述干细胞是毛囊干细胞并且所述受损组织是毛囊；这种方法对于治疗脱 发是特别有用的，并且包括通过本文所述的方法分离毛囊干细胞、繁殖所获得的干细胞以 及将新的毛囊植入到头皮；或者_其中所述干细胞是胃干细胞；或者_其中所述干细胞是肝干细胞；或者-其中所述干细胞是卵巢干细胞；或者-其中所述干细胞是用于提供皮肤移植物的皮肤干细胞；或者_其中所述干细胞是表2中所述的任何细胞，要治疗的疾病是表2中提及的对应的 治疗应用，例如，干细胞是视网膜干细胞而疾病是由于视网膜缺陷导致的失明。基因治疗也能够用于涉及修复受损或患病组织的方法。例如，能够使用腺病毒或 逆转录病毒基因递送载体来向干细胞递送遗传信息(如DNA和/或RNA)。本领域技术人员 能够替代或修复在基因治疗中靶向的特定基因。例如，可以将正常基因插入基因组中的非特定位置来替代无功能的基因。这种方法是常用的。仍然在另一实例中，能够通过同源重 组来将异常的基因交换为正常的基因，或者通过将基因的功能恢复正常的选择性逆向突变 来修复异常的基因。另一实例是改变特定基因的调节(打开或关闭基因的程度)。优选地， 通过基因治疗方法处理离体干细胞，然后将该干细胞转移至需要治疗的哺乳动物(优选人 类)。因此，本发明还提供了用于修饰干细胞的基因组序列的方法，该方法包括提供本 发明的方法的干细胞的集合，使所述集合与核酸接触以修饰基因组序列，并分离其中基因 组序列已经被修饰的干细胞。本发明还提供了用于修饰组织细胞的基因组序列的方法，该 方法包括在体外为组织细胞的集合提供用于修饰所述基因组序列的核酸序列，该方法还包 括按照本发明的方法从所述组织细胞的集合中分离干细胞。本发明还提供了通过本发明的方法可获得的分离的基因组修饰的干细胞，并且其 中至少50%、优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选 至少95%的细胞是能够保持未分化的表型的多能干细胞。本发明还提供了可通过本发明 的方法获得的分离的基因组修饰的干细胞，并且其中至少50%、优选至少60%、更优选至 少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少95%的细胞是本文所定义的成体 干细胞和/或组织干细胞。仍然在另一有用的实施方案中，本发明提供了通过本文所述的任何方法获得的干 细胞在制备用于治疗受损或患病组织的药物中的用途，还包括遗传修饰所述干细胞，优选 离体和/或优选地通过基因治疗方法进行遗传修饰。本发明还提供了用于治疗组织或器官 损伤的组合物，该组合物包含本发明所述的分离的基因组修饰的干细胞。仍然在可选择的实施方案中，本发明提供了用于治疗组织损伤的组合物，该组合 物包含通过本发明的方法可获得的组织干细胞，所述本发明的方法即，(i)用于获得(或分离)干细胞的方法，该方法包括-任选地从组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离，和/或(ii)用于维持或培养组织干细胞的方法，其包括为组织干细胞提供Lgr5和/或 Lgr6配体或者Lgr5和/或Lgr6的小分子激动剂。本发明的干细胞对于研究目的也是非常有益的。合适的研究目的的实例是进一步 鉴定干细胞标志物或开发以本发明的干细胞作为靶标的基因疗法或任何其它研究目的。本发明还提供了 Lgr5和/或Lgr6作为分离组织干细胞的标志物的用途，以及 Lgr5和/或Lgr6结合化合物用于分离组织干细胞的用途。本发明还提供用于治疗需要治疗的个体的方法，该方法包括给予所述个体足量的 通过本发明的方法获得/可获得的干细胞。在另外的实施方案中，本发明提供了重组动物，该重组动物包含受Lgr5或Lgr6启 动子调控的第一报道基因以使所述报道基因产物表达于表达Lgr5或Lgr6的细胞中、编码 可调节的蛋白的序列以及在可调节的蛋白激活时表达的第二报道基因，所述编码可调节蛋 白的序列与第一报道基因可操作地连接，以使可调节蛋白在表达Lgr5或Lgr6的细胞中与
19第一报道基因产物共表达。本发明的重组动物允许用第一报道分子来染色组织或器官干细胞，并且允许在可 调节的蛋白激活后用第二报道基因产物来染色非干细胞子代细胞，例如，定向或分化的子 代祖细胞。报道基因是编码容易被测定的产物的基因。报道基因通常用于确定特定的核酸构 建体(construct)是否被成功地导入细胞、器官或组织，和/或特异性地检测其中报道基因 已被导入并表达的细胞。表达产物通常是独特的，在这一意义上，未被修饰的细胞或不表达 报道基因的细胞不被特异地检测。报道基因又被称为标志基因。当使用两种或更多种报道 基因时，不同的报道基因通常是不同的，在这一意义上，它们的表达产物能够被容易地相互 区分。因此，第一报道基因和第二报道基因通常是不同的。本文所用的可调节的蛋白是在信 号的存在下功能被改变的蛋白。已经鉴定和/或人工地生成了许多不同的可调节的蛋白。 公知的实例是tet-阻遏物系统，其中四环素或其类似物的存在与否通过调控tet阻遏物蛋 白对tet阻遏物结合序列的结合能力来调控tet-操纵子的活性。在本实例中，该tet阻遏 物蛋白是可调节的蛋白，而四环素的存在与否是信号。尽管该tet阻遏物系统是公知的，但 是还有许多其它可调节的蛋白。两种或更多种蛋白在细胞中的共表达目前是很常见的。能够产生融合蛋白。优选 地使用多顺反子。目前通常利用至少一种所谓的内部核糖体进入位点(IRES)来实现这个 目的。可选择的方法包括使用再起始位点和/或含有两个或更多个可读框的RNA的可变剪 接。本发明还提供了重组干细胞，该重组干细胞包含受Lgr5或Lgr6启动子调控的第 一报道基因以使所述报道基因产物表达于表达Lgr5或Lgr6的细胞中、编码可调节的蛋白 的序列、以及在可调节的蛋白激活时被表达的第二报道基因，所述编码可调节的蛋白的序 列与第一报道基因可操作地连接，以使可调节的蛋白在表达Lgr5或Lgr6的细胞中与第一 报道基因产物共表达。能够从分离的干细胞生成所述干细胞，或者优选地从本发明的重组动物分离所述 干细胞。优选地，所述可调节的蛋白是能够被诸如他莫西芬或4-羟基他莫西芬的雌激素 或其类似物的给药活化的CRE-ERT2。在本优选实施方案中，第二报道基因的表达受活化的 CRE-ERT2调节，通过去除阻止第二报道基因在失活状态的表达的阻遏物序列来调节。在优 选的实施方案中，所述第一报道基因的产物是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白，或更优选的增 强的绿色荧光蛋白。在另外的优选实施方案中，所述第二报道基因包括LacZ，其编码能够通 过提供诸如X-gal的合适底物而被识别的半乳糖苷酶。优选地，将所述第二报道基因 插入活化后提供稳健、延长的转基因表达的基因组区域，例如，转基因动物是小鼠时的ROSA 基因座。在优选的实施方案中，本发明提供了重组动物，该重组动物包含如在用于追踪其 中所述的干细胞的重组动物的上下文的实例中所指定的核酸。在优选的实施方案中，所述重组动物是非人的动物。优选哺乳动物，更优选啮齿 类。更优选大鼠或小鼠。本发明还提供了本发明的重组动物或重组干细胞用于追踪干细胞和干细胞的后代的用途。本发明还提供了用于鉴定干细胞的后代的方法，该方法包括提供本发明的重组 动物或重组干细胞，活化可调节的蛋白，并鉴定不表达Lgr5和/或Lgr6及第一报道分子， 但表达第二报道蛋白的细胞。本发明人披露了 Lgr5 (又称为Grp49)的表达以及Lgr6的表达不仅标记成体干细 胞，也标记多种不同肿瘤中的癌干细胞。仍然在另一实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞的方法，该方 法包括下-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离。优选地，所述癌干细胞参与包括结肠癌、直肠癌和结肠直肠癌在内的肠癌，诸如基 底细胞癌的皮肤癌，食道癌，乳腺癌，前列腺癌，成神经管细胞瘤和其它脑癌，肝癌，胃癌，视 网膜癌，头颈癌，睾丸癌，毛囊癌，卵巢癌，肾上腺髓质癌(嗜铬细胞瘤)或肺癌。因此，在 优选的实施方案中，所述癌干细胞是包括结肠癌干细胞、直肠癌干细胞和结肠直肠癌干细 胞在内的肠癌干细胞，诸如基底细胞癌干细胞的皮肤癌干细胞，食道癌干细胞，乳腺癌干细 胞，前列腺癌干细胞，成神经管细胞瘤干细胞和其它脑癌干细胞，肝癌干细胞，胃癌干细胞， 视网膜癌干细胞，头颈癌干细胞，睾丸癌干细胞，毛囊癌干细胞，卵巢癌干细胞，嗜铬细胞瘤 干细胞或肺癌干细胞。如上文所述，在文献中关于癌干细胞定义存在一些混乱。本文中，我们采用在最近 的AACR研究会上达成的共识(14)，其规定癌干细胞“是肿瘤内的细胞，具有自我更新和产 生组成肿瘤的癌细胞的异质谱系的能力的细胞。因此癌干细胞只能够依据它们重演不断生 长的肿瘤的产生的能力试验性地定义”。文献中的可选择的术语包括肿瘤起始细胞和致瘤 细胞。优选地，癌干细胞活性的测定需要处理自我更新和肿瘤增殖的潜力。目前，金标准测 定是免疫缺陷小鼠中的连续异种移植。例如，通过活组织检查或外科方法来获得实体瘤样本，并且例如通过从优选人的 哺乳动物采集血液、尿、脑脊髓液或淋巴样品来获得液体瘤样品。取样的组织或器官是，例如结肠、乳房、前列腺、脑、肝、胃或肺。对于关于Lgr5或Lgr6的信息，能够考虑本申请的较早的部分。在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞或癌干细胞的 集合的方法，该方法包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中所述癌干细胞是哺乳动物癌干 细胞，优选人癌干细胞，并且其中癌干细胞的集合包含至少50 %的癌干细胞，该癌干细胞能 够重演(recapitulate)不断生长的肿瘤的生成。在优选的实施方案中，所述癌干细胞的集 合包含至少60%的癌干细胞、优选至少70%的癌干细胞、更优选80%的癌干细胞、更优选90%的癌干细胞、更优选95%的癌干细胞，所述癌干细胞能够重演不断生长的肿瘤的生成。脊髓和(脐带)血液能够被视为天然的细胞悬液。例如，能够通过将器官组织机 械破碎成小碎片从实体瘤获得细胞悬液。任选地，能够通过诸如EDTA的化学制剂和/或通 过使用例如分散酶、胶原酶或胰酶的酶制剂的酶性消化来将这些碎片进一步分散成单个的 细胞。操作步骤能够包括破碎和/或酶性消化操作步骤前、期间或后的组织或细胞培养。当细胞悬液已经可用时，则可以省略所述方法的这个步骤(任选的特征)。由于并不总是需要从所用的结合化合物中分离所述癌干细胞，因此所述步骤代表 了所附的权利要求中任选的特征。当需要从Lgr5和/或Lgr6结合化合物分离癌干细胞时， 能够通过本领域技术人员公知的多种方法来进行分离。合适的实例是(机械)搅拌，酶性 消化，添加过量的结合化合物或其衍生物，通过改变PH或盐浓度来进行的洗脱。既然本发明人已经表明，Lgr5或Lgr6是癌干细胞的标志物，可以将能够结合Lgr5 或Lgr6的化合物(S卩，Lgr5或Lgr6结合化合物)用于鉴定、标记和分离干细胞。Lgr5或Lgr6结合化合物的一个合适的实例是能够结合Lgr5或Lgr6的抗体或抗 体衍生物或抗体片段，即对Lgr5或Lgr6具有亲和力的抗体或其衍生物或片段。由于Lgr5 和Lgr6是跨膜表面蛋白，所以这类抗体或其衍生物或片段优选地具有对朝向外部的蛋白 部分的亲和力，即结合所述蛋白的任何胞外部分。在优选的实施方案中，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段具有对Lgr5和/或Lgr6 的高亲和力，即Kd至少为10_7的亲和力。优选地，亲和力小于等于10_9。然而，也能够使用 约10_8的亲和力。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞的方法， 该方法包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中，所述Lgr5或Lgr6结合化合物 是能够结合Lgr5或Lgr6的抗体或抗体衍生物或抗体片段。能够通过本领域技术人员公知的方法来提供抗体或它们的衍生物或它们的片段， 所述方法包括杂交瘤技术、单链抗体/噬菌体展示技术。作为非限定性实例，试验部分描述了 Lgr5特异性和Lgr6特异性抗体。因此，本文 还提供了使用如表4或5所述的抗体的本发明的方法，以及使用抗体或抗体衍生物或抗体 片段的本发明的方法，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段包含至少一个如图27所示的CDR 序列。优选地，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的轻链和/或重链的 CDR1序列和CDR2序列和CDR3序列。合适的抗体片段的实例是ScFV、Fab。合适的衍生物的实例是嵌合抗体、纳米抗体、 双功能抗体或人源化抗体。仍然在另一优选的实施方案中，所用的抗体是单克隆抗体。Lgr5或Lgr6结合化合物的另一实例是Lgr5或Lgr6配体，该Lgr5或Lgr6配体能 够不加修饰地使用，但是也能够能够被制备成和/或用作融合蛋白或者能够与第二部分偶 联以允许细胞分离。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞的方法，该方法包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中所述Lgr5或Lgr6结合化合物是 Lgr5或Lgr6配体。本领域技术人员能够非常好地制备Lgr5或Lgr6配体融合蛋白，例如通过标准分 子生物学技术来制备。Lgr5或Lgr6配体的合适的实例是胰岛素肽家族的成员，例如Ins 15或松弛素3。 另一合适的实例是半胱氨酸结蛋白，例如头发生素、GremliruDan或Cerberus。基于这些配 体已知和公开的核苷酸和氨基酸序列，本领域技术人员能够很容易地制备融合蛋白。优选地，第二部分引入了允许容易地鉴定和追踪融合蛋白的特征，例如诸如抗体 Fc尾部或葡萄球菌A蛋白或谷胱甘肽S-转移酶的蛋白(片段)，诸如Myc、FLAG或HA标签 或寡聚组氨酸标签的短抗原性肽标签，诸如碱性磷酸酶的酶标签，荧光蛋白标签(例如，绿 色荧光蛋白)。还能够将小化学部分偶联至用于癌干细胞鉴定和/或分离的配体。这些部 分能够被特异性抗体识别并结合，或者能够具有对用于细胞分离的物质的特异性亲和力， 或者能够具有例如，发荧光的、放射性的或磁性特征。在甚至更优选的在实施方案中，使融 合蛋白的第二部分通过间隔子连接至所述Lgr5或Lgr6配体。甚至更优选地，所述间隔子 包含酶可消化的序列。这允许容易地分离第二部分与Lgr5或Lgr6配体。Lgr5或Lgr6结合化合物另一实例是对Lgr5或Lgr6具有亲和力的小化合物。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞的方法， 该方法包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中所述Lgr5和/或Lgr6结合化合 物是具有对Lgr5和/或Lgr6的亲和力的小分子。这种小分子是，例如合成的肽或小化合 物。在优选的实施方案中，所述小分子对Lgr5或Lgr6的亲和力是高的，即Kd为至少 10_7的亲和力。任选地，将这种小分子与第二部分偶联，该第二部分导入了允许容易地鉴定和追 踪融合蛋白的特征，例如诸如抗体Fc尾部或葡萄球菌A蛋白或谷胱甘肽S-转移酶的蛋白 (片段)，诸如Myc、FLAG或HA标签或寡聚组氨酸标签的短抗原性肽标签，诸如碱性磷酸酶 的酶标签，荧光蛋白标签(例如，绿色荧光蛋白)。取决于期望的癌干细胞与现在已知的Lgr5或Lgr6的存在与否，本发明的方法能 够使用至少1种、至少2种、至少3种甚或更多种(不同的)结合化合物。表3提供了不同 类型的肿瘤上存在或不存在Lgr5或Lgr6的概述。基于该表，本领域技术人员能够非常好 地选择一种或多种靶标志物以及一种或多种对应的结合化合物，因而能够获得或分离癌干 细胞。
23
表3 干细胞标志物Lgr5和Lgr6在肿瘤中的分布。数据源自Lgr5或Lgr6的表 达在正常组织对肿瘤组织的比较，该比较是通过微阵列(Genelogic)或通过定量PCR进行 的。 如果本领域技术人员要获得乳腺癌干细胞，能够单独地使用Lgr5或Lgr6的结合 化合物，或使用其任何组合，因为乳腺癌干细胞包含两种所述的标志物。在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞的方法，该方法 包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞_任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中 所述Lgr5或Lgr6结合化合物是Lgr5结合化合物，并且其中所述癌干细胞是脑 干细胞、肝干细胞、视网膜干细胞、胃干细胞、结肠干细胞、头和/或颈干细胞、睾丸干细胞、 前列腺干细胞、卵巢干细胞、皮肤干细胞、毛囊干细胞、白血病干细胞、软骨肉瘤干细胞、肌 肉/软组织干细胞、子宫干细胞或乳房干细胞；或者
所述Lgr5或Lgr6结合化合物是Lgr6结合化合物，并且其中所述癌干细胞是脑 干细胞、肺干细胞、头和/或颈干细胞、睾丸干细胞、乳房干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、 前列腺干细胞、软骨肉瘤干细胞、子宫干细胞、成视网膜细胞瘤干细胞或卵巢干细胞；或者 所述Lgr5或Lgr6结合化合物是至少一种Lgr6结合化合物与至少一种Lgr5结 合化合物的组合，并且其中所述癌干细胞是脑干细胞、皮肤干细胞、头和/或颈干细胞、睾 丸干细胞、乳房干细胞、前列腺干细胞、卵巢干细胞、软骨肉瘤干细胞、子宫干细胞或毛囊干 细胞。在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞的方法，该方法 包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中使用了一种化合物。仍然在另一优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞的方 法，该方法包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中使至少两种不同的结合化合物 与所述细胞悬液接触。所述两种不同的结合化合物能够针对同一种标志物(例如，针对 Lgr5)。例如，能够使用针对两种不同表位的两种抗体，所述抗体共同捕获(优选基本完全 地)期望的干细胞。然而，所述两种不同的结合化合物也能够针对两种不同的干细胞标志 物(例如，针对Lgr6和Lgr5)。当使用两种或三种甚或更多种结合化合物时，所述结合化合 物可以来自相同类型的结合化合物(例如，全部是抗体、小分子或配体(融合蛋白))，或者 来自不同类型的结合化合物(例如，针对Lgr6的抗体和结合Lgr5的配体融合蛋白)。在优选的实施方案中，使能够结合Lgr5和/或Lgr6的至少两种不同的抗体或抗 体衍生物或抗体片段与细胞悬液接触。允许结合化合物与细胞悬液相互作用后(保持一定量的时间或在不同的条件下， 如PH、温度、盐等)，随后鉴定获得的结合复合物。这可以利用例如FACS分析来完成。荧 光活化细胞分选(FACS)是专门类型的流式细胞术。它提供了基于每个细胞特定的光散射 和荧光特性，每次一个细胞地将生物细胞的异质混合物分选至两个或更多个容器的方法。 荧光活化细胞分选仪是有用的科学仪器，因为它提供了对于来自单独细胞的荧光信号的快 速、客观和定量的记录以及对于特别感兴趣的细胞的物理分离。在优选的实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)癌干细胞或癌干细胞的 集合的方法，该方法包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离，其中FACS用于鉴定和分选与Lgr5或
25Lgr6结合化合物结合的细胞，并且其中所述集合包含至少50%的癌干细胞，该癌干细胞能 够重演(recapitulate)不断生长的肿瘤的生成。优选地，所述集合包含至少60%、更优选 至少70 %、更优选至少80 %、更优选至少90 %、更优选至少95 %的癌干细胞，该癌干细胞能 够重演不断生长的肿瘤的生成。用于鉴定结合的复合物的其它选择是磁珠分选、(免疫)亲和柱细胞分离，或(免 疫)亲和淘选。对于通过FACS的分析，结合化合物优选地具有荧光标签，对于通过磁珠分选的分 析，结合化合物优选地具有磁珠(例如，包被了抗体的磁珠)。仍然在另一实施方案中，本发明提供了包含嵌入在它们的细胞膜中的Lgr5和/或 Lgr6的癌干细胞(的集合)，其中所述集合包含至少50 %的癌干细胞，该癌干细胞能够重 演不断生长的肿瘤的生成。在优选的实施方案中，所述集合包含至少60%的纯癌干细胞、 优选至少70%的纯癌干细胞、更优选至少80%的纯癌干细胞、更优选至少90%的纯癌干细 胞、更优选至少95%的纯癌干细胞。更优选地，所述集合由具有所示纯度的(癌)干细胞组 成。例如，通过本文所述的方法，即用于获得(或分离)癌干细胞的方法来获得癌干细胞的 这种集合，该方法包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离。能够通过上文所述的方法获得的癌干细胞的实例是结肠癌干细胞、直肠癌干细 胞、肠癌干细胞、皮肤癌干细胞、视网膜癌干细胞、脑癌干细胞、乳腺癌干细胞、睾丸癌干细 胞、毛囊癌干细胞、胃癌干细胞、头和/或颈癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞、前列腺癌 干细胞、食道癌干细胞、肾上腺髓质癌干细胞、心脏癌干细胞或卵巢癌干细胞。若需要，在合适的环境条件(例如，pH和温度)下，通过在Lgr5和/或Lgr6配体 存在下培养所述细胞来维持或繁殖(扩增)所述癌干细胞。Lgr5或Lgr6配体的合适实例 是胰岛素肽家族的成员，例如，Insl5或松弛素3。另一合适的实例是半胱氨酸结蛋白，例如 头发生素、Gremlin、Dan 或 Cerberus。因此，仍然在另一实施方案中，本发明提供了用于维持或培养癌干细胞的方法，该 方法包括为癌干细胞提供Lgr5和/或Lgr6配体或者Lgr5或Lgr6的小结合分子。本发明还提供了本发明的(分离的)癌干细胞的集合，还包含与所述癌干细胞表 达的Lgr5和/或Lgr6有关的Lgr5和/或Lgr6结合化合物。本发明还提供了(分离的) 癌干细胞的培养物，该培养物包含Lgr5和/或Lgr6结合化合物。优选地，所述Lgr5和/ 或Lgr6结合化合物是特异性的Lgr5和/或Lgr6结合抗体或其片段或衍生物。在优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的方法分离的重组肿瘤干细胞， 其包含受Lgr5或Lgr6启动子调控的报道基因，从而使该报道基因产物表达于表达Lgr5或 Lgr6的细胞中。能够将报道基因构建体插入分离的肿瘤干细胞的基因组中，其中该报道基 因被可操作地连接至Lgr5或Lgr6启动子。可选择地，例如，能够通过用包含报道基因构建 体的腺病毒载体感染肿瘤干细胞来提供所述报道基因构建体。将报道基因构建体插入细胞 的基因组的方法对本领域技术人员是公知的，并且包括例如通过包含报道基因构建体的逆转录病毒的插入的随机插入，或者通过同源重组。在另一优选的实施方案中，本发明提供了重组干细胞，该重组干细胞包含受Lgr5 或Lgr6启动子调控的第一报道基因以使该报道基因的产物表达于表达Lgr5或Lgr6的细 胞中、编码可调节的蛋白的序列、以及在可调节的蛋白活化时表达的第二报道基因，所述编 码可调节的蛋白的序列与第一报道基因可操作地连接，从而使可调节的蛋白在表达Lgr5 或Lgr6的细胞中与第一报道基因产物共表达。优选地，所述第一报道基因产物是诸如绿色荧光蛋白的荧光蛋白，或者更优选增 强的绿色荧光蛋白。优选地，所述可调节的蛋白是CRE-ERT2。第二报道基因优选地包含 LacZ o例如，将分离的(并且任选地培养的)癌干细胞用于这种细胞的例如，生物化学、 分子生物学或标志物水平的进一步的分析。而且，分离的癌干细胞在鉴定能够用于癌症治疗，特别是癌干细胞治疗的化合物 中也是非常有用的。基于Lgr5和/或Lgr6嵌入在癌干细胞的细胞膜中的知识，能够设计 并制备能够抑制、阻断或结合Lgr5和/或Lgr6的化合物。随后，能够测试这些化合物杀死 或功能性阻断或抑制在它们的细胞膜中包含Lgr5和/或Lgr6的癌干细胞的能力。本发明的重组肿瘤干细胞特别优选用于鉴定化合物，因为它们的存在能够在添加 了化合物后被容易地监测。所述重组肿瘤细胞适合用于诸如高通量测定的测定，其中以节 约成本的方式测试了多个化合物。因此，在另一实施方案中，本发明提供了用于测试可能的抗癌干细胞化合物的作 用的方法，该方法包括下述步骤在体外用所述可能的抗癌干细胞化合物接触(处理)本发 明的一组癌干细胞，并测试所述处理的癌干细胞是否能够产生不断生长的肿瘤，其中所述 可能的癌干细胞化合物优选地被设计为Lgr5或Lgr6抑制剂，或设计为Lgr5或Lgr6结合 化合物。仍然在另一实施方案中，本发明提供了用于测试可能的抗癌干细胞化合物的作用 的方法，该方法包括下述步骤在体外使本发明的癌干细胞的集合与所述可能的抗癌干细 胞化合物接触，并测试所述处理的癌干细胞是否能够产生不断生长的肿瘤，该方法还包括 使所述可能的抗癌干细胞化合物与组织或器官干细胞接触，并选择特异性地影响肿瘤干细 胞的化合物。这一方法中所用的癌干细胞包含它们的细胞膜上的Lgr5和/或Lgr6，或者是通过 包括下述步骤的用于获得(或分离)癌干细胞的方法可获得的-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将癌干细胞与所述结合化合物分离例如，能够从(小)化合物文库获得待测试的化合物，或者能够基于Lgr5或Lgr6 的(结构)知识，或者基于Lgr5或Lgr6的(天然)配体的(结构)知识来设计待测试的 化合物。下文将更详细地讨论抗癌干细胞化合物。仍然在另一实施方案中，本发明提供了 Lgr5或Lgr6抑制剂或者Lgr5或Lgr6结合化合物。优选地，这类抑制剂或结合化合物是通过用于测试可能的抗癌干细胞化合物的 作用的方法可获得的，该方法包括下述步骤用所述可能的抗癌干细胞化合物在体外接触 (处理)本发明的一组癌干细胞，并测试所述处理的癌干细胞是否能够产生不断生长的肿 瘤，其中所述可能的癌干细胞化合物优选地，但不是必需地被设计为Lgr5或Lgr6抑制剂或 者Lgr5或Lgr6结合化合物。Lgr5或Lgr6抑制剂的第一个实例是Lgr5或Lgr6蛋白的抑制剂。优选地，所述 Lgr5或Lgr6蛋白抑制剂是能够结合Lgr5或Lgr6的抗体或抗体衍生物或抗体片段，更优选 能够结合暴露于癌干细胞的外部的Lgr5或Lgr6的部分的抗体或抗体衍生物或抗体片段。 仍然在另一优选的实施方案中，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段结合所述Lgr5或Lgr6 蛋白，并且通过防止Lgr5或Lgr6的天然配体的结合来功能性地阻断所述Lgr5或Lgr6蛋 白。在一实施方案中，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段包含至少一个如图27所示的CDR 序列。优选地，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的轻链和/或重链的 CDR1序列和CDR2序列和CDR3序列。在另一实施方案中，所述抗体是如表4或5所示的抗 体。合适的抗体片段的实例是scFv和Fab。合适的衍生物的实例是嵌合抗体、纳米抗 体、双功能抗体或人源化抗体。仍然在另一优选的实施方案中，所用的抗体是单克隆抗体。Lgr5或Lgr6蛋白抑制剂的另一实例是干扰Lgr5或Lgr6的生物活性的小分子。 这类小分子能够是化合物和小蛋白，并且通常基于Lgr5或Lgr6的结构功能分析来设计。分 析能够包括Lgr5或Lgr6的晶体结构分析。能够筛选小分子文库，或者能够设计化合物然 后对其进行筛选。还能够基于Lgr5或Lgr6的(天然)配体的结构来设计小分子抑制剂。Lgr5或Lgr6抑制剂仍然的另一实例是Lgr5或Lgr6的mRNA转录物的抑制剂。 Lgr5或Lgr6转录物的抑制剂的一个实例是反义分子。反义药物是mRNA的小片段的互补 链。这种反义分子结合Lgr5或Lgr6的mRNA并抑制(至少部分地抑制)Lgr5或Lgr6蛋白 的产生。Lgr5或Lgr6转录物的抑制剂的另一实例涉及RNA干扰(RNAi)分子，例如siRNA 分子。除了抗体或抗体衍生物或抗体片段结合Lgr5或Lgr6并功能性地阻断Lgr5或 Lgr6(如上文所述)的选择以外，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段还能够结合Lgr5或 Lgr6,而不功能性地阻断Lgr5或Lgr6的活性。优选地，这种抗体或抗体衍生物或抗体片段 偶联至能够功能性地抑制癌干细胞的另一种化合物(即，另一部分)。所述另一种化合物的 实例是毒素。因此，本发明还提供了癌干细胞抑制剂，其中所述抑制剂包含能够结合Lgr5 或Lgr6的第一部分和提供癌干细胞机能障碍的第二部分。优选地，所述第一部分是结合 Lgr5或Lgr6的抗体或抗体衍生物或抗体片段(优选地不影响Lgr5或Lgr6的功能)，并且 所述第二部分是毒素。在本实施方案中，将Lgr5或Lgr6用作将细胞毒性化合物递送至癌 干细胞的靶标。因此，本发明还提供了本发明所述的结合化合物，该结合化合物连接至毒剂或连 接至能够将前药转变成毒剂的酶。例如，将抗体或其衍生物或片段连接至毒剂来形成免疫 偶联物。所述毒剂包括放射性同位素或单独地全身给药时无效的毒性药物。通过将本发明 的结合化合物对表达Lgr5和/或Lgr6的肿瘤干细胞的靶向特异性与毒性效应物分子的
28杀伤力组合，免疫偶联物允许灵敏地辨别靶组织和正常组织，从而产生比大多数常规化疗 药物更低的毒性副作用。能够靶向表达Lgr5或Lgr6的肿瘤干细胞的前药的实例包括苯 甲酸氮芥(benzoic acidmustard)，从而将抗体连接至羧肽酶G2 ；氮芥头孢菌素对苯二胺 (nitrogen mustardcephalosporin—p—phenylenediamine),从而夺抗体连接至旦一内酉先月安 酶；以及氰基苯基甲基3-D-吡喃葡糖苷醛酸(cyanophenylmethylbeta-D-gluco-pyranos iduronic acid)，从而将抗体连接至0 -葡糖苷酶。本发明还提供本发明的结合化合物作为治疗癌症的药物的用途。在优选的实施方 案中，所述结合化合物包括对Lgr5和/或Lgr6特异性的抗体或者其Lgr5或Lgr6结合片 段或衍生物。在优选的实施方案中，所述抗体是如本文所述的人抗体、人源化抗体或去免疫 化的抗Lgr5和/或Lgr6的抗体。在优选的实施方案中，所述结合化合物对人Lgr5和/或 人Lgr6是特异性的。优选地，所述抗体是单克隆抗体。在一实施方案中，所述结合化合物 是包含至少一个图27所示的⑶R序列的抗体或抗体衍生物或抗体片段。优选地，所述抗体 或抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的轻链和/或重链的CDR1序列和CDR2序列以 及CDR3序列。在另一实施方案中，所述结合化合物是如表4或5所示的抗体。在优选的实 施方案中，将本发明的结合化合物连接至毒剂，或连接至能够将前药转变成毒剂的酶。仍然在另一实施方案中，本发明提供了包含Lgr5或Lgr6配体的癌干细胞抑制剂， 优选地所述配体与能够功能性地抑制癌干细胞的另一种化合物(即，另一部分)偶联。所 述另一种化合物的实例是毒素。Lgr5或Lgr6配体的实例是为胰岛素肽家族的成员的配 体。合适的实例是Insl5和松弛素3。另一合适的实例是半胱氨酸结蛋白，例如头发生素、 Gremlin、Dan或Cerberus。而且，能够修饰天然配体从而该天然配体永久地阻断Lgr5或 Lgr6的活性。 上文所述的所有Lgr5或Lgr6蛋白抑制剂，Lgr5或Lgr6的mRNA转录物的抑制剂 以及所述的癌干细胞抑制剂对于治疗性癌症治疗方法是非常有用的。仍然在另一实施方案中，本发明提供了如本文所述的至少一种Lgr5或Lgr6抑制 剂或者至少一种Lgr5或Lgr6结合化合物(例如，Lgr5或Lgr6蛋白抑制剂或者Lgr5或 Lgr6的mRNA转录物的抑制剂或者癌干细胞抑制剂)在制备用于治疗癌症的药物中的用途。优选地，所述抑制剂可根据本发明的方法获得，即用于测试可能的抗癌干细胞作 用的方法，其包括在体外用所述可能的抗癌干细胞化合物接触(处理)本发明的一组癌干 细胞，并测试所述处理的癌干细胞能否产生不断生长的肿瘤，其中所述可能的癌干细胞化 合物优选地被设计为Lgr5或Lgr6抑制剂或者被设计为Lgr5或Lgr6结合化合物。在优选 的实施方案中，使用Lgr5或Lgr6抑制剂或者Lgr5或Lgr6结合化合物。本发明还提供了用于降低或抑制肿瘤的肿瘤维持潜力的方法，该方法包括下述步 骤为所述肿瘤提供设计为Lgr5和/或Lgr6抑制剂的化合物，优选地，该化合物能够结合 Lgr5 禾口 / 或 Lgr6。抗肿瘤干细胞疗法对于根除维持肿瘤并参与侵入性生长和转移的肿瘤部分是特 别有用的。尽管这种方法被认为是非常有效的癌症疗法，但是通过将该抗癌干细胞疗法与 常规癌症疗法组合能够获得改进或增强的结果。在优选的实施方案中，本发明提供了如本文所述的至少一种Lgr5或Lgr6抑制剂 或者至少一种Lgr5或Lgr6结合化合物(例如，Lgr5或Lgr6蛋白抑制剂或者Lgr5或Lgr6的mRNA转录物的抑制剂或者癌干细胞抑制剂)在制备用于治疗癌症的药物中的用途，还包括一般的抗癌治疗(general anti-cancer therapy)。所述一般(或常规)抗癌治疗的实 例是放疗、化疗、基于抗体的治疗或基于小分子的治疗。组合的治疗获得了杀死少数癌干细 胞群体以及大部分肿瘤的方法。在另一优选的实施方案中，本发明提供了如本文所述的至少一种Lgr5或Lgr6抑 制剂或者至少一种Lgr5或Lgr6结合化合物(例如，Lgr5或Lgr6蛋白抑制剂或者Lgr5或 Lgr6的mRNA转录物的抑制剂或者癌干细胞抑制剂)在制备用于治疗癌症的药物中的用途， 其中癌干细胞参与肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、皮肤癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、 成神经管细胞瘤或其它脑癌、肝癌、胃癌、毛囊癌、视网膜癌、嗜铬细胞瘤、头颈癌、睾丸癌、 卵巢癌、皮肤的基底细胞癌或肺癌。在这一方面，“参与”表示支持和/或维持和/或扩增。优选地，在所述常规癌症治疗前、治疗后或治疗期间开始用至少一种Lgr5和/或 Lgr6抑制剂或者至少一种Lgr5和/或Lgr6结合化合物进行治疗。尽管用至少一种Lgr5和/或Lgr6抑制剂或者至少一种Lgr5和/或Lgr6结合化 合物的治疗被认为是有效的，但是用多种抑制剂和/或结合化合物的治疗能够提供改进的 结果。如果待治疗的癌干细胞包含两种、三种甚或更多种不同的嵌入在该癌干细胞的细胞 膜中的Lgr蛋白，则这种情况是特别真实的。在优选的实施方案中，本发明提供了如本文所述的至少一种Lgr5和/或Lgr6抑 制剂或者至少一种Lgr5和/或Lgr6结合化合物(例如，Lgr5或Lgr6蛋白抑制剂或者Lgr5 或Lgr6的mRNA转录物的抑制剂或者癌干细胞抑制剂)在制备用于治疗癌症的药物中的用 途，其中使用了至少两种Lgr5和/或Lgr6抑制剂或者至少两种Lgr5和/或Lgr6结合化 合物或者至少一种Lgr5和/或Lgr6抑制剂与至少一种Lgr5和/或Lgr6结合化合物的组
口 O因此，本发明提供了至少两种Lgr5和/或Lgr6抑制剂或者至少两种Lgr5和/或 Lgr6结合化合物或者至少一种Lgr5和/或Lgr6抑制剂与至少一种Lgr5和/或Lgr6结 合化合物的组合在制备用于治疗癌干细胞的药物中的用途。抑制剂和/或结合化合物能够 针对，但不是必须针对同一种Lrg蛋白，例如抗Lgr5的结合化合物和抑制剂。例如，至少两 种Lgr5或Lgr6抑制剂或者至少两种Lgr5或Lgr6结合化合物的混合物或者至少一种Lgr5 或Lgr6抑制剂与至少一种Lgr5或Lgr6结合化合物的组合是针对Lgr5和Lgr6的。后者 在获得脑癌干细胞、头颈癌干细胞、睾丸癌干细胞、乳腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、皮肤癌 干细胞、卵巢癌干细胞或毛囊癌干细胞的方法中是特别有用的。另一种已经描述的有用的化合物是干细胞抑制剂，其包含优选地与能够功能性地 抑制癌干细胞的另一种化合物(即，另一部分)偶联的Lgr5和/或Lgr6配体。所述另一 种化合物的实例是毒素。Lgr5或Lgr6配体的实例是为胰岛素肽家族的成员的配体。合适 的实例是Insl5和松弛素3。另一合适的实例是半胱氨酸结蛋白，例如头发生素、Gremlin、 Dan或Cerberus。这类化合物还能够用于癌干细胞治疗。因此，本发明提供了能够结合Lgr5和/或Lgr6的配体的化合物在制备用于治疗 癌干细胞的药物中的用途。优选地，所述配体与能够功能性地抑制癌干细胞的另一种化合 物(即，另一部分)偶联，所述另一种化合物例如毒素或能够将前药转化成毒剂的酶。甚至 更优选地，将这种治疗与一般癌症治疗组合，例如，放疗、化疗、基于抗体的治疗或基于小分子的治疗。 仍然在另一实施方案中，本发明提供了能够结合Lgr5和/或Lgr6的配体的化合 物在制备用于治疗癌干细胞的药物中的用途。优选地，所述化合物与Lgr5和/或Lgr6配 体的结合使得所述配体不能再结合Lgr5和/或Lgr6。一个实例是捕获Lgr5和/或Lgr6 的(天然)配体从而防止Lgr5和/或Lgr6活化的抗体或抗体衍生物或抗体片段。本发明还提供了组合物，其包含至少一种Lgr5和/或Lgr6抑制剂，或者至少一种 Lgr5和/或Lgr6结合化合物，或者至少一种Lgr5和/或Lgr6配体，或者至少一种能够结 合Lgr5和/或Lgr6的配体的化合物，优选地全部都如上文所述。优选地，所述组合物是药 物组合物。这类药物组合物还能够包含任何药学上可接受的赋形剂、稳定剂、活化剂、载体、 渗透剂(permeator)、推进剂、消毒剂、稀释剂和/或防腐剂。药物组合物可以是任何期望的 形式，例如，片剂、灌输液、胶囊剂、糖浆等。在另一优选的实施方案中，(药物)组合物包含至少两种Lgr5和/或Lgr6抑制 剂或者至少两种Lgr5和/或Lgr6结合化合物或者至少一种Lgr5和/或Lgr6抑制剂与至 少一种Lgr5和/或Lgr6结合化合物的组合。由于发明人已经公开Lgr5和/或Lgr6是癌干细胞标志物，这进一步开拓了诊断 学领域的可行性。例如，能够使用Lgr5和/或Lgr6结合化合物来确定肿瘤的癌干细胞含 量，或确定诸如血液的体液中癌干细胞的存在与否。优选地，结合化合物具有对Lgr5或 Lgr6的高亲和力(即，Kd是至少10_7)。合适的结合化合物是Lgr5和/或Lgr6配体，能够 结合Lgr5和/或Lgr6的抗体或抗体衍生物或抗体片段，例如具有对Lgr5和/或Lgr6的 亲和力的抗体或其衍生物或片段。因此，本发明还提供了用于确定肿瘤的癌干细胞含量的方法，该方法包括使所述 肿瘤与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触，除去未结合的结合化合物，并确定所述肿瘤中是 否存在任何结合的结合化合物。在优选的实施方案中，所述方法是体外方法。甚至更优选地，所述结合化合物被标 记使得能够被鉴定。例如，合适的标记是诸如抗体Fc尾部或葡萄球菌A蛋白或谷胱甘肽 S-转移酶的蛋白(片段)，诸如Myc、FLAG或HA标签或寡聚组氨酸标签的短抗原性肽标签， 诸如碱性磷酸酶的酶标签，荧光蛋白标签(例如，绿色荧光蛋白)。然而，还可能使用具有对 结合化合物的亲和力的第二化合物，并且用合适的标志物来标记所述第二化合物(即，间 接分析)。对于体内应用，本发明还提供了 Lgr5和/或Lgr6结合化合物在制备用于诊断肿 瘤中癌干细胞的存在和/或含量的诊断剂(diagnostic)中的用途。例如，从体液或从实体瘤获得的样品获得所述样品。在优选的实施方案中，本发明提供了用于确定肿瘤的癌干细胞含量的方法，该方 法包括下述步骤使所述肿瘤与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触，并确定所述肿瘤中是否 存在任何结合的结合化合物。本发明还提供了 Lgr5和/或Lgr6结合化合物在制备用于诊 断样品中癌干细胞的存在和/或含量的诊断剂中的用途，其中所述结合化合物与允许放射 性成像、正电子发射断层(PET)扫描、核磁共振成像(MRI)扫描或X射线/计算机断层(CT) 扫描的物质结合。本发明还提供了用于确定体液是否包含癌干细胞的方法，该方法包括
-任选地从所述体液获得样本-使所述体液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-除去未结合的结合化合物-检测包含Lgr5和/或Lgr6结合化合物的任何结合的复合物，并基于检测的结合 的复合物的存在来确定癌干细胞的存在。合适的结合化合物是Lgr5和/或Lgr6配体，能够结合Lgr5和/或Lgr6的抗体 或抗体衍生物或抗体片段，即具有对Lgr5和/或Lgr6的亲和力的抗体或其衍生物或片段。例如，通过用合适的溶液或缓冲液洗涤来完成除去任何未结合的结合化合物的步
马聚ο体液的实例是血液、尿、淋巴液或眼泪。
在优选的实施方案中，所述方法是体外方法。上文已经描述了合适的标记。所述的诊断方法对于确定抗癌治疗是否根除了癌干细胞(至少部分地根除)也是 非常有用的。例如，如果使用一般抗癌治疗(或用例如Lgr5和/或Lgr6抑制剂的组合治 疗)，则能够通过确定携带Lgr5和/或Lgr6的细胞的存在与否来确定所述治疗对癌干细胞 的影响。仍然在另一实施方案中，本发明提供了用于确定抗癌治疗的效果的方法，该方法 包括治疗癌并确定癌干细胞是否存在，包括使所述癌与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触。能够在体外和体内进行这种方法。优选地，在治疗前和治疗期间或治疗后确定癌干细胞的存在，从而能够确定所应 用的治疗是否改变了(优选降低)癌干细胞的量。本发明还提供了用于治疗需要治疗的个体的方法，该方法包括给予所述个体本文 所述的有效量的药物组合物，并任选地还对所述个体进行常规的癌症治疗，例如放疗或化疗。在下文的非限定性实施例中更详细地解释本发明。


图1 :Gpr49/Lgr5是人结肠癌细胞系中的Wnt靶基因，并且表达于小鼠隐窝中。a RNA印迹法分析(上图)；溴化乙锭染色的凝胶(下图)。泳道1 对照Lsl74T-L8细胞。泳 道2 多西环素诱导的Wnt途径抑制24小时后的Lsl74T细胞，如6(参考文献2)中所述。 注意，Wnt途径抑制时，4. 4kb Grp49mRNA强烈下调。泳道3 从分离的小鼠小肠隐窝提取的 RNA，该RNA不可避免地发生有限的降解，从而导致一些拖尾(smearing)。泳道4 从分离的 小鼠绒毛提取的RNA。注意，Grp49在小鼠隐窝中特异性表达。b/c在APCmin小鼠的小肠 进行的原位杂交的两个重叠图像，这表明了 Grp49在隐窝底部的遍在表达(用白色箭头表 示的实例)和左图中在腺瘤中的表达(用虚线表示)。
图2 小肠的循环的(cycling)隐窝基底柱状(CBC)细胞中的Gpr49/Lgr5表达。 a-c，用3Tcf靶基因特异性的探针进行原位杂交，证明了隐窝上皮的非重叠表达模式。a 隐 窝防卫肽(cryptdin)特异性地标记隐窝基底部的帕内特细胞；b :KIAA0007标记位于帕内 特细胞上方的TA细胞；c :Gpr49/Lgr5特异性地表达于与隐窝基底部的帕内特细胞混合的4-8细胞中，全部有义对照(sense control)是阴性的(未显示)；d :CBC细胞(圈出的) 在苏木精/伊红染色的切片中仅不佳地可见；e :CBC细胞(圈出的)是KI67+;f 某些CBC 细胞表达M期标志物磷酸化组蛋白H3(圈出的)；g :BrdU单次剂量后4小时，CBC细胞中的 BrdU掺入(圈出的)；h 连续BrdU标记24小时后，CBC细胞中的BrdU掺入(圈出的)；黑 色长条4小时或24小时后，每个隐窝切片的BrdU阳性的CBC细胞的数目。白色长条通 过计数Gpr49-LaCZ小鼠中的LacZ阳性细胞评估的每个隐窝切片的CBC细胞的总数。
图3 成体小鼠中GPR49_LacZ报道基因的局限性表达。a 携带整合至Gpr49基因 的最末外显子的IacZ的小鼠的产生，从而去除编码的Gpr49蛋白的全部跨膜区。b_h 选择 的成体小鼠组织中GPR491acZ的表达。b/c 在小肠中，表达局限于与隐窝基底部的帕内特 细胞混合的6-8个细长细胞。d/e:在结肠中，表达局限于位于隐窝基底部的数个细胞。f/ g:胃中的表达局限于腺体的基底部。h:在乳腺中，表达仅在较小的、增殖活跃的腺体中是 明显的，其中表达局限于基底上皮细胞。i 在皮肤中，表达发生在从凸起向真皮乳头延伸的 区域中的毛囊的外部根鞘中。图4 :GPR49-EGFP-Ires-CreERT2敲入小鼠中的EGFP表达忠实地再现肠道中的 GPR491acZ表达模式。a 通过基因敲入至Gpr49的第一个外显子，从单个双顺反子信使 (single bicistronic message)，生成表达 EGFP 和 CreERT2 的小鼠。b、c、e 用红色 DNA 染 料ToPro-3复染的共聚焦GFP成像证实，Gpr49表达局限于夹在小肠隐窝基底部的帕内特 细胞之间的6-8个细长细胞。b:完整的隐窝-绒毛单位。c:隐窝区域的放大；d:肠隐窝中 EGFP表达的免疫组织化学分析。e 作为图7中的补充影片提供的3D重构的2D图像。f 结 肠中EGFP表达的共聚焦图像证实，Gpr49表达局限于位于隐窝基底部的数个细胞。g 用免 疫金对GFP染色的隐窝的CryoEM切片(比例尺=IOOOnm)。标记特异性的定量在255 μ m2 的CBC细胞溶胶(1113个颗粒)、261 μ m2的帕内特细胞溶胶(305个颗粒)和257 μ m2的 隐窝外的成纤维细胞溶胶(263个颗粒)范围计数金颗粒。因此，与具有1. 17金颗粒/μ m2 的帕内特细胞和1. 02金颗粒/ μ m2的成纤维细胞对照相比，CBC细胞质具有4. 36金颗粒/ um20 C =隐窝内腔；P =帕内特细胞；CBC =隐窝基底部柱状细胞。h 未标记的CryoEM切 片(比例尺=2000nm)，强调了 CBC细胞的超微结构特征和它们相对于帕内特细胞的定位。图5 小肠和结肠中的谱系追踪。a:他莫昔芬注射12小时后，与ROSa26-LaCZ报道 分子小鼠杂交的GPR49-EGFP-IreS-CreERT2敲入小鼠。b 根据图5b的插入的图解，蓝色细 胞出现在相对隐窝底部的特定位置的频率。大多数Cre+LacZ标记的CBC细胞存在于帕内特 细胞之间的位置，而在帕内特细胞直接上方的+4位置(蓝线)，只观察到10%的Cre+LacZ 标记的CBC细胞。最近，Potten和同事发表了如下定量数据在照射后的成体小鼠中获得 的长期DNA标记保留细胞的位置(标记“+4”肠干细胞)17。这些数据(红线)与携带活化 的Cre的CBC细胞的位置的比较。c至e 诱导后1天(c)、诱导后5天(d)和诱导后60天 (e)小肠中的LacZ活性的组织学分析。f至h 利用PAS的LacZ染色的肠的双标记表明诱 导的蓝色克隆中存在杯状细胞(f;白色箭头)和帕内特细胞(g;蓝色箭头)。用突触泡蛋 白的双标记表明诱导的蓝色克隆中存在肠内分泌细胞(h ；黑色箭头)。i至k 诱导后1天 (i)、诱导后5天(j)和诱导后60天(k)结肠中的LacZ活性的组织学分析。图6 将EGFP-ires_CreERT2盒敲入Gpr49基因座的策略a:小鼠Gpr49基因的示意结构
b 筛选ES细胞的DNA印迹法策略，所述ES细胞用靶向外显子I中的ATG翻译起 始点的敲入构建体转染c 对跑在4. 3kb的重组BamHI条带评分为阳性的总共500个ES细胞克隆中的4 个。对这4个ES克隆重新筛选后，选择前两个(星号)用于囊胚注射。
图7 =CBC细胞、+4细胞和TA细胞的相对辐射敏感性。用IGy或IOGy照射成体小 鼠，然后在6小时后，在凋亡的峰值时处死小鼠。a 通过免疫组织化学来显现活性胱天蛋白 酶(CaSpaSe)-3阳性细胞(上图lGy照射后，黑色箭头标示的阳性+4细胞；下图10Gy照 射后，白色箭头标示的阳性CBC细胞)。b 通过计数下述三种类型的细胞来确定每个隐窝 阳性细胞的频率CBC细胞(位于帕内特细胞之间)、+4细胞(位于帕内特细胞直接上方) 和TA细胞(位于5-15位置)。在IGy下，+4细胞已经达到最大凋亡，而IOGy在CBC细胞 中导致了明显多于IGy照射的凋亡。图8 在他莫昔芬注射后标示的时间点，GPR49-EGFP-Ires-CreERT2敲入小鼠的小 肠中LacZ表达的全样载片(whole mount)分析，所述小鼠与RoSa26-LaCZ报道基因小鼠杂 交。a 诱导后1天，b 诱导后5天，c 诱导后60天。图9 增殖标志物Ki67和GPR49-EGFP-CreERT2小鼠的肠隐窝中的GFP阳性CBC细 胞的共定位(连续切片)。图10 人、小鼠和大鼠受体的序列。图11 :Lgr4、Lgr5 和 Lgr6 的预测结构。图12 成体小鼠中GPR49_LacZ报道基因的局限性表达。选择的成体小鼠组织中 GPR491acZ的表达。LGR5局限于脑(嗅球的嗅小球和几个其它未很好地定义的区域)(A)、 眼(视网膜的内核层)(B)、肝(围绕门三联体(portal triads)的细胞)(C)和肾上腺(D) 中的稀少的细胞群中。图13 胃中的谱系追踪。将Lgr5-EGFP_CreERT2小鼠与Rosa26R报道分子小鼠杂 交，并且通过他莫昔芬的IP注射在LGR5+ve细胞中诱导Cre酶的活性。LacZ报道基因活性 最初局限于LGR5细胞(A)，但是随时间延长迅速扩展至包括胃中的全部上皮(B)。在长时 间段内维持这种“谱系追踪”(B)。这证明，全部上皮细胞源自这种组织中的LGR5+ve群体， 从而证明它们是干细胞。图14 乳腺中的谱系追踪。将Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠与Rosa26R报道分子小鼠 杂交，并且通过他莫昔芬的IP注射在LGR5+ve细胞中诱导Cre酶的活性。LacZ报道基因活 性最初局限于LGR5细胞(A)，但是扩展至包括哺乳期雌性中新形成的乳腺的肌上皮(B)，这 表明LGR5特异性地标记该器官中的肌上皮干细胞。图15 肾上腺中的谱系追踪。将Lgr5-EGFP_CreERT2小鼠与Rosa26R报道分子小 鼠杂交，并且通过他莫昔芬的IP注射在LGR5+ve细胞中诱导Cre酶的活性。LacZ报道基因 活性最初局限于LGR5细胞(A)，但是扩展到包括肾上腺的髓质(B)，这表明LGR5特异性地 标记肾上腺髓质干细胞。图16 :Lgr6表达于小鼠毛囊的上突起区域的细胞中和表皮的基底细胞中。获得 约26天大的Lgr6-EGFP-IreS-CreERT2小鼠(生长早期)的皮肤切片，对核DNA进行染色 (Topro)，并利用共聚焦显微镜观察EGFP (A至C)。在生长早期中，Lgr6表达于上凸起中(A、 C)和基底表皮中(A、B)。
图17 :Lgr6+细胞的后代促成毛囊(HF)、滤泡间表皮(IFE)和皮脂腺(SG)的全部结构。为了追踪Lgr6+细胞的后代，在HF处于休止期(telogen)的P20，向 Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/R0SA26-LacZ 小鼠注射他莫昔芬(TM) (A)。在 P23，在 IFE 和 HF 中检测到最早的染色(B)。在P38(第一生长期，C，D)和P52(第二休止期，E，F)时LacZ染 色的后代分析揭示了对HF、IFE和SG的所有部分的促成。图18 :Lgr6+细胞的后代促成肺的肌上皮。为了追踪Lgr6+细胞的后代，在P20，向 Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/R0SA26-LacZ 小鼠注射他莫昔芬(TM)。在 P38 的 LacZ 染色后代 (A,从左至右为10x，20x和40x放大)和在P52的LacZ染色后代(B，从左至右为10x，20x 和40x放大)的分析揭示了对肺细支气管下方的肌上皮的促成。图19 β -NF的低剂量口服诱导在AHCre小鼠的干细胞中没有诱导Cre介导的缺 失。将来自AhCre+ROSa26R+小鼠的肠的全样载片进行β-半乳糖苷酶染色。a:在来自未 诱导的AhCre+ROSa26R+小鼠的肠中没有观察到Rosa-lacZ报道基因的活化。b —次管饲 lmg/kg^-萘黄酮(β -Napthof lavone)后2天，在整个肠中容易观察到IacZ的表达，这表 明有效的IacZ报道分子的Cre介导的活化。在隐窝基底部(下图)没有观察到IacZ表 达，这表明在隐窝基底缺乏Cre介导的重组。c 在诱导后100天的肠全样载片中没有观察 到IacZ阳性隐窝/绒毛单位，这表明这种剂量方案在肠干细胞中极少导致重组。图20 在延长的时间段内，通过APC丢失(loss)的非干细胞的转化未能有效地驱 动腺瘤的形成。a至c 一次管饲1. 0mg/kg β -萘黄酮3天后，在来自AhCre+ROSa26R+ApCfl/ fl的肠切片上进行的联蛋白IHC。在绒毛(a)和隐窝的上部区域(b)经常观察到具有 核联蛋白的转化细胞的簇。只在隐窝基底部(c)非常罕见地观察到了高联蛋白 (β-cateninhigh)的簇。用黑色箭头突出显示这些簇。d —次管饲1. 0mg/kg β -萘黄酮4 天后，来自AhCre+ROSa26R+Apcfl/fl的肠切片上的高β _联蛋白的细胞簇定位的量化。箱 形图表示1600个隐窝-绒毛单位中，在隐窝基底部、上隐窝和绒毛中观察到的局灶(foci) 的数目。在隐窝的上部区域比任何其它区域观察到了明显更多的簇(P = 0.04，曼-惠特 尼(Marm Whitney)检验，η = 3)。在隐窝基底部中只观察到了非常少的核β-联蛋白局 灶。e —次管饲l.Omg/kg0-萘黄酮后24天，在来自AhCre+Rosa26R+Apcfl/fl的肠切片 上进行的联蛋白IHC。此处，在ere诱导后24天，在小病灶中观察到了核β-联蛋白。 f、g —次管饲1. Omg/kg0 -萘黄酮后167天，在来自AhCre+Rosa26R+Apcfl/fl的肠切片上 进行的联蛋白IHC，显示出具有核β-联蛋白的微腺瘤(f)和小腺瘤(g)。h:—次管饲 1.0mg/kgi3-萘黄酮后，在延长的时间段内，AhCre+Rosa26R+Apcfl/fl中的腺瘤形成的定 量。对来自AhCre+ROSa26R+Apcf 1/f 1小鼠的肠的全样载片上的病灶大小评分，已经将该全 样载片对LacZ进行染色以辅助观察小病灶(每个时间点至少使用3只小鼠)。在长达24 天并包括24天，没有在小鼠中观察到腺瘤，在第24天时，在小鼠中只有极少的微腺瘤。在 第100天(更多)时，在AhCre+ROSa26R+Apcfl/fl中观察到偶尔的腺瘤，然而大部分病灶 仍是微观的，这表明尽管有长潜伏期，但是大部分病灶没有发展成腺瘤。图21 =APC丢失后转化的Lgr5+ve肠干细胞持续刺激高β -联蛋白微腺瘤的快速 形成。a至i:利用β-联蛋白和GFP分别作为转化的细胞和Lgr5+Ve干细胞的标志物，在 8天的时间段内追踪了 Lgr5+Ve肠干细胞转化的结果以及它们随后的命运。a至c =Cre诱 导3天后，Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2/APCfl/fl肠内在分散的Lgr5+ve干细胞中首先观察到了 Wnt效应物，β-联蛋白的聚集。圈出了高β-联蛋白Lgr5+Ve干细胞的代表性实例。 d至f 诱导后5天，转化的Lgr5+Ve干细胞仍存在(e、f 黑色箭头)并且与TA区室中转化 的(高β-联蛋白)细胞的簇有关。g至h:诱导后8天，转化的细胞的簇扩充至填满TA区 室(h 红色圈)。隐窝基底部的转化的Lgr5-GFP+Ve干细胞持续存在(h、i 黑色箭头)，但 是TA区室中它们转化的后代是Lgr5-GFP-ve (h、i 红圈)。图22 =APC丢失后，Lgr5+ve干细胞的选择性转化有效地驱动整个肠中的腺瘤的形 成。a至h:在36天的时间段内，利用GFP(f)和β-联蛋白(全部其它的)IHC，追踪了肠 腺瘤的出现和发展，以及这些腺瘤中Lgr5-GFP干细胞标志物的表达。a至b :Lgr5+ve干细 胞转化后14天，在整个肠中可容易地观察到多个小腺瘤；(至€ :24天后，存在多个肉眼可 见的腺瘤(大于100)。腺瘤中Lgr5-GFP表达局限于稀少的分散细胞中(f ；圈出的)；g、h 在第36天，肠的大部分充满了肉眼可见的腺瘤。图23 肠腺瘤中Lgr5+干细胞的存在。由于Wnt途径的长期活化，肠腺瘤表达高水平的联蛋白(Α)。与在整个腺瘤中高度表达的其它Wnt靶基因(未显示)相比，肠干 细胞标志物Lgr5-GFP的表达局限于具有典型干细胞形态学的分散细胞中细长，逗点状的 细胞；用黑色箭头标出(B)。我们认为，腺瘤中的这些Lgr5+Ve细胞是用于维持腺瘤生长的 干细胞(所谓的癌干细胞)。图24 :L8细胞中LGR5表达的FACS分析，该L8细胞是LS 174T细胞的克隆衍生 物，并且在多西环素(DOX)的诱导下表达显性阴性的Tcf4(DNTcf4)。DNTcf4关闭组成型活 化的Wnt途径。DOX诱导48hr后，观察到hLgr5蛋白水平的下降。将大鼠IgG用作阴性同 种型对照。9G5是针对hLgr5的大鼠单克隆来源的抗体。图25 =Lgr5+干细胞和它们的直接后代的比较。来自从Lgr5-EGFP-ires_CreERT2 小鼠新鲜分离的隐窝制备的细胞悬液的GFP阳性上皮细胞。FACS分析区分开高GFP(GFPhi) 和低GFP (GFP10)群体，我们将它们分别暂时地鉴定为CBC细胞和它们直接的过渡型扩增子 细胞(A)。Wnt应答基因的实例Sox9在CBC细胞中表现出高水平的表达，而在原位杂交中， 直接位于帕内特细胞上方的TA细胞也表达该基因，尽管以低得多的水平表达(B)。图26 利用几种Lgr5特异性单克隆抗体对人结肠癌细胞系(L8)进行内源hLgr5 染色。L8细胞是亲本LS 174T细胞系的克隆衍生物。多西环素(DOX)诱导后，L8细胞表达 显性阴性形式的Tcf-4 (DNTcf4)。在这些细胞中，DNTcf4有效地阻断组成型Wnt途径活性， 并从而关闭Tcf靶基因。DOX诱导48小时后，观察到了 hLgr5蛋白水平的大幅下降。将大 鼠IgG用作阴性同种型对照。图27 利用KABAT方法分析的轻链+重链序列。⑶R区域为粗体和斜体。 实施例实施例1试验部分LS174T克隆L8中的RNA印迹法和诱导的Wnt途径抑制如在van de ffetering, Μ. et al. The beta-catenin/TCF-4complex imposes acrypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells (β-联蛋白/TCF-4复合物将隐窝祖细胞表型赋予结肠直肠癌细 胞).Cell 111，241-50 (2002)中所述。探针跨越小鼠Gpr49的整个读框。通过在37°C下预热的30mMEDTA中孵育10分钟的4轮连续的孵育，从0. 5cm长的肠生成用于RNA分离的隐 窝和绒毛上皮制备物，然后将所述制备物在冰冷的PBS中剧烈摇动(IOx)。将主要包含绒毛 和隐窝的组分1和4分别用于RNA分离。小鼠通过将Ires-LacZ盒靶向最后一个外显子的5’端的ES细胞中的同源重组 来生成GPR49-LacZ小鼠，从而基本上除去了含有全部TM区的区域，并产生了无效等位基因 (Lexicon)。通过将EGFP-Ires_CreERT2盒靶向GPR49的ATG的ES细胞中的同源重组来生 成 GPR49-EGFP-Ires-CreERT2 小鼠。从 Jackson Labs 获得 Rosa26_lacZ Cre 报道基因小 鼠° 他莫昔芬诱导向至少8周龄的小鼠腹膜内注射一次200μ 1 10mg/ml的葵花油中 的他莫昔芬。BrdU注射以4小时的间隔，向小鼠腹腔内注射200 μ 1 5mg/ml的PBS中的BrdU 溶液。免疫电子显微法将肠切开，并在0.2M PHEM缓冲液中的4% PFA中灌注固定， 包埋在明胶中，用Leica FCS冷冻超薄切片机进行冷冻切片，并用多克隆兔抗GFP抗体进 行抗GFP的免疫标记。在-100 °C下，利用钻石Cryotrim 90刀(diamond Cryotrim 90 knife) (Diatome，Switzerland)修整样本，并利用 Cryoimmuno 刀(Diatome，Switzerland)， 在-120°C下进行70nm的超薄切片。对于低放大率的EM图像，根据生产商的说明书，用 R-GENT SE-EM(Aurion, The Netherlands)简单地银增强 15nm 蛋白 A-金颗粒(UMCU， Utrecht, The Netherlands)。通过在一级抗体前应用封闭液(Aurion，The Netherlands) 来减少对帕内特细胞颗粒的非特异性结合。用于免疫组织化学、原位杂交和LacZ表达分析的组织样品的制备如先前在 Muncan,V. et al. Rapid loss of intestinal crypts uponconditional deletion of the ffnt/Tcf-4target gene c_Myc (Wnt/Tcf-4靶基因c_Myc的条件性缺失时的肠隐窝的快速减 少).Mol Cell Biol 26，8418-26 (2006)中所述地进行全部操作。从序列验证的成像克隆 (ImageClone) 30873333生成包含mGPR49的Ikb N末端片段的原位探针。从Monosan(The Netherlands)购买 Ki67 抗体，从 Campro Scientific (TheNetherlands)购买磷酸化组蛋白 H3，从 Dako 购买抗突触泡蛋白，从 Roche 购买抗 BrdU。Edwin Cuppen，Hubrecht Institute 提供了多克隆兔抗GFP。人(肿瘤)组织细胞悬液的制备利用刀片，尽可能低将新鲜分离的人(肿瘤)组织切碎。在无血清培养基中进 行这个步骤。将切碎的肿瘤吸入25ml移液器中。将溶液装入50ml锥形管中。添加了 胶原酶IV(200单位/ml) (Sigma)后，在37 °C下孵育30min至60min。最终的浓度应当 是200单位/ml。每(约)10min，用移液器吹打几次。将该溶液通过滤器(45微米孔径， Becton Dickinson)。将滤器用4ml至5ml无血清培养基洗涤。将溶液在1500rpm下离心 IOmin (40C )。将细胞团(pellet)在低渗氯化铵(约5ml)中重悬。在室温下放置IOmin (这 将溶解红细胞)。然后添加等体积的无血清培养基，并再次离心。在无血清培养基中再悬浮 细胞团。如果成块，则通过另一滤器。用台盼蓝计数来观察死亡细胞的百分比。免疫缺陷的小鼠中通过异种移植进行的癌干细胞测定用320Rad亚致死地照射小鼠。试验操作包括将人(结肠)癌细胞悬液注射入NOD/SCID小鼠的肾小囊(renal capsule)下。利用无菌技术来处理小鼠，并利用吸入麻醉法异氟醚，来麻醉该小鼠。在操作期间，将小鼠置于加热板上。用剃刀将腹部除毛，然后依次用(1)碘溶液和(2)70%的乙醇溶液进行准备。然 后用纱布擦拭该区域。将小鼠侧放(左侧朝上)。用剪刀剪开(约)lcm的侧切口，该侧切 口正好位于左侧的前缘(costal margin)下方。将肾移至伤口。将待测定癌干细胞活性的 细胞悬液在冰上1 1地混合(培养基基质胶(Matrigel))。利用结核菌素注射器，将25 微升细胞悬液注入肾小囊下。将肾放回腹腔。如果细胞悬液中存在癌干细胞活性，则在随 后的几周/几月中将长出肿瘤，然后通过组织学分析肿瘤并且该肿瘤应当与最初的人肿瘤 类似。在成体哺乳动物中，肠上皮是最快速地自我更新的组织。目前的模型表明，4-6 隐窝干细胞位于小肠中帕内特细胞的直接上方的+4位置；结肠干细胞尚不明确。从一组 肠Wnt靶基因选择Gpr49/Lgr5用于其局限性的隐窝表达。两个敲入的等位基因揭示了 Gpr49在隐窝基底部的循环的柱状细胞中专门的表达。另外，Gpr49在一些其它组织中的 很少的细胞中表达，所述其它组织包括胃、乳房和毛囊。利用可诱导的Cre敲入等位基因 和ROSa26-LaCZ报道分子品系，在成体小鼠中进行谱系追踪试验。Gpr49+ve隐窝基底柱状细 胞(CBC)在60天的时间段内产生全部上皮谱系，这暗示柱状细胞代表了小肠和结肠的干细 胞。Gpr49的表达模式表明Gpr49在多种成体组织和癌症中标记干细胞。小肠的吸收性上皮排列在隐窝和绒毛乂参考文献2)中。在小鼠中，小肠上皮每 3至5天更新。通过绒毛顶端的凋亡来平衡隐窝中细胞产生的高速率。由于缺乏特有的标 志物及缺乏干细胞测定，迄今为止，肠干细胞尚未被功能性地定义。小鼠嵌合体和诱变剂诱 导的体细胞克隆2~3(参考文献2)的分析与损伤再生的研究允许干细胞特征的可操作的定 义。干细胞被认为稳定地循环以产生快速增殖的过渡型扩增(transit amplifying) (ΤΑ) 细胞，所述过渡型扩增细胞能够朝向全部谱系分化。干细胞在整个生命周期中自我更新，并 且在损伤后再生上皮。干细胞的估计数目是每个隐窝4至6个2(参考文献2)。长期DNA 标记保留(DNA label retention)初步将干细胞定位在直接位于帕内特细胞上方的“位置 +4”4(参考文献2)。在隐窝_绒毛连接处，三种分化的细胞类型(肠细胞(enterocytes)、 杯状细胞和肠内分泌细胞)由TA细胞形成，并且继续它们在沿着隐窝-绒毛轴延伸的连贯 带中的迁移。尽管隐窝是单克隆的，但是每个绒毛接受来自多个不同隐窝的细胞，因而是多 克隆的。第四主要分化的细胞，帕内特细胞，位于隐窝的底部。结肠上皮含有隐窝，但是具 有平坦的表面而不是具有绒毛。这种上皮包含两种主要分化的细胞类型吸收性结肠细胞 和杯状细胞1 (参考文献2)。迄今为止，尚未在结肠中鉴定出干细胞。由于Wnt信号组成了隐窝的生物学的主要驱动力5 (参考文献2)，所以我们假设在 干细胞中可能特异性地表达了一种或多种Wnt/TCf4(TCf712)靶基因。我们以前描述了结 肠直肠癌细胞中的Wnt/Tcf4靶基因程序，并发现它在生理学上表达于肠隐窝中6、7 (参考文 献2)。当我们研究约80个选择的Tcf4靶基因的表达时7，绝大部分靶基因表达于帕内特 细胞或TA细胞中。然而，Gpr49/Lgr5基因以独特的方式表达。该Gpr49基因的表现像Wnt 靶基因，因为在如以前所述的细胞系统6 (参考文献2)，即人结肠直肠癌细胞系LS174T中， 该Gpr49基因的表达在通过显性阴性TCF4的Wnt途径活性的诱导抑制下消失(图la，泳道 1比泳道2)。因此，该基因在小鼠的小肠隐窝中表达，而不在绒毛中表达(图la，泳道3比泳道4)。原位杂交揭示了位于APCmin小鼠的小肠的全部隐窝底部以及腺瘤中的有限数目 的细胞的表达(图Ib和Ic)。放大于图2c中的这种表达模式与从帕内特细胞特异性基因 (图2a)或TA特异性基因(图2b)获得的表达模式明显不同。Gpr49基因看起来标记了散 布在帕内特细胞之间的小细胞，循环的隐窝基底部柱状(CBC)细胞(图2d-h，参见下文)。
Gpr49编码特征为大的富亮氨酸胞外结构域的孤儿G蛋白偶联受体(GPCR)。它与 具有糖蛋白配体的GPCR密切相关，例如TSH受体、FSH受体和LH受体8 (参考文献2)。Gpr49 在我们的结肠直肠癌中的Tcf4靶标的原始列表中6，但是在卵巢癌和肝细胞癌中也观察到 了过量表达9“°(参考文献2)。为了详细地研究Gpr49的表达，我们获得了敲入等位基因， 其中将以内部核糖体进入位点为先导的LacZ整合在第一跨膜结构域的N末端，实质上产生 了无效等位基因(图3a)。当我们的研究尚在进行中时，Morit等人公布了 Gpr49_/_的表型11 (参考文献2)。 舌头和下颚的畸形使得新生的突变体吞入大量的空气从而导致了它们出生后迅速的死亡。 我们在我们的小鼠中观察到了相同的表型。注意，在出生后几周首先确立了隐窝和肠干细 胞12(参考文献2)。杂合的Gpr49-LaCZ小鼠允许我们详细地描述Gpr49的表达。出生前， 观察到了动态和复杂的表达模式(Barker et al，准备中)。在出生附近，Gpr49表达在几 乎全部组织中减退。成体小鼠中的表达局限于在眼、脑、毛囊、乳腺、生殖器官、胃肠道中的 稀少、分散的细胞中(图3，和未显示)。在小肠中，在位于小肠的帕内特细胞之间的细长细 胞(图3b和3c)和位于结肠隐窝底部的类似数目的细胞(图3d和3e)中观察到了 Gpr49 表达。在通过内腔的切片的小肠隐窝中的蓝色细胞的计数揭示了每个切片的隐窝中存在约 3. 5个这类细胞(图2i，白色长条)。30多年前，Leblond与Cheng注意到帕内特细胞之间 循环的细胞的存在并创造了术语“隐窝基底柱状”(CBC)细胞13(参考文献2)。基于它们的 位置和它们在长期突变体上皮克隆中的存在，Cheng和B jerknes2、14 (参考文献2)及Gordon 和同事15 (参考文献2)认为，这种细胞可能具有干细胞活性。通过形态学，可以容易地区分细长Gpr49+veCBC细胞和邻近的帕内特细胞，该细长 Gpr49+veCBC细胞具有减少的细胞质和指向隐窝内腔的的扁平、楔形核。偶尔地(每10个 隐窝大约出现一次)，这些细胞还表达M期标志物磷酸化组蛋白H3，这表明该细胞在细胞周 期中(图2f)。实际上，4小时脉冲的BrdU标记了每个隐窝这些细胞中的约1个(图2G和 21，左边的黑色长条)，而24小时连续BrdU标记获得每个隐窝多于3个的阳性细胞(图2h 和2i，右边的黑色长条)，这接近每个隐窝的CBC细胞的总数(图2i，白色长条)。这一观 测结果表明，CBC细胞的平均周期约为1天。增殖标志物Ki67与GPR49-LacZ的直接共定 位进一步证实了 LacZ阳性CBC细胞通常是循环的(cycling)(图2e和图9)。为了能够观察活CBC细胞和研究它们潜在的“干性”，我们生成了另一敲入等位基 因，其中我们将EGFP-ires-CreERT2盒整合在Gpr49的第一个ATG密码子(图4a和图6)。 携带这个等位基因的杂合小鼠是健康和可生育的。在成体组织中观察到的GFP模式忠实 地重演了先前在眼、脑、毛囊、乳腺、生殖器官、胃肠道中所观察到的Gpr49-LaCZ等位基因 的模式(未显示，及图4)。共聚焦成像允许通过GFP荧光观察小肠(图4b、4c、4e)和结 肠(图4f)中的Gpr49+re细胞。利用GFP阳性CBC细胞和邻近的帕内特细胞和成纤维细胞 的免疫金标记的免疫电子显微镜检查显示了 CBC细胞的独特的超微结构解剖学(图4g和 4h)。通常，所述CBC细胞在它们的底部相对宽，含有扁平、楔形的细胞核并且几乎不含有细胞器。顶部细胞质的细长延伸被挤压在相邻的富含内质网的帕内特细胞与富含颗粒的帕内 特细胞之间，延伸至隐窝内腔并且携带一些顶端微绒毛。我们然后将EGFP-ires_CreERT2敲入等位基因与Cre可激活的Rosa26_LacZ报道分子杂交16(参见，试验策略的图4a)。他莫昔芬的注射激活了表达Gpr49的细胞中的 CreERT2融合酶。随后，Cre介导的ROSa26-LaCZ报道分子中路障(roadblock)序列的切除 应当不可逆地标记Gpr49+ve细胞。而且，尽管这些细胞的潜在后代不再表达GFP，但是激活 的LacZ报道分子应当作为遗传标记，从而有助于谱系追踪。在未诱导的小鼠中未观察到LacZ的表达(未显示)。为了定量每个隐窝的CBC细 胞的总数，其中潜在的Cre酶能够被他莫昔芬激活，我们用他莫昔芬处理了 2至3个月大的 小鼠，并在12小时后将小鼠处死。如图5a所示，在典型的CBC位置出现了蓝色的LacZ信 号。根据图5b的方案，我们确定了蓝色细胞出现在相对于隐窝底部的特定位置的频率。大 多数Cre+ve、LacZ标记的CBC细胞出现在帕内特细胞之间的位置，而只有10%的这些细胞 被观察到在帕内特细胞的直接上方的+4位置(图5b，蓝线)。Potten和同事最近公布了 在成体小鼠中照射后获得的长期DNA标签保留细胞的位置的定量数据(标记“+4”肠干细 胞)17。这些数据(图5b，红线)与具有可活化Cre的CBC的位置的比较表明，这两种标志 物鉴定了大部分不重叠的细胞群。+4细胞的另一定义性特征是它们对低剂量(小于IGy)辐射的强烈敏感性4。为了 比较CBC细胞与+4细胞之间的相对辐射敏感性，用IGy或IOGy照射成体小鼠，然后在6小 时后，凋亡的峰值时，将该成体小鼠处死。通过免疫组织化学来观察活性胱天蛋白酶_3阳 性细胞(图7a)。通过计数以下三种类型的细胞中凋亡的细胞来确定每个隐窝的阳性细胞 的频率CBC细胞(通过它们在帕内特细胞之间的定位定义)、+4细胞(位于帕内特细胞直 接上方)和TA细胞(位于5-15位置)(图7b)。与4(参考文献2) —致，+4位置的最大凋 亡在IGy已经达到(a 上方，黑色箭头)，而IOGy在CBC细胞(a 下方)和TA细胞中导致 了明显多于IGy照射的凋亡，这证实了 CBC细胞和+4细胞的不同性质。然后使成体小鼠经历他莫昔芬脉冲并在诱导后1、5、12(未显示)和60天处死这 些成体小鼠。诱导后一天，观察到小肠和结肠的隐窝中偶尔的CBC细胞表达了 LacZ(分别 是图5c和5i)。如图8全样载片的小肠所显示的，细胞的平行带(parallel ribbon)从 隐窝底部发出(emanate)，并在较晚的时间点沿邻近绒毛的侧面向上生长(rim up)。条带 (strip)形成的动力学不是统一的。诱导后5天，某些条带已经到达绒毛的尖端，而偶尔的 隐窝中的蓝色染色仍然局限于隐窝中。诱导后5天(图5d)，这种隐窝局限性表达非常罕 见。CBC细胞是能够长期微持自我更新的上皮，因为在60天的肠中(图5e和图8)，蓝色隐 窝和带的频率与诱导后5至12天所观察到的频率基本上相同。60天诱导的肠的双标记证明，在源自GPR49+veCBC细胞的LacZ染色的克隆中，存 在PAS阳性杯状细胞(图5f)、PAS阳性帕内特细胞(图5g)和突触泡蛋白阳性肠内分泌细 胞(图5h)。利用突变标记，Cheng和Bjerknes报道，存在不同类型的长生命周期的上皮 克隆，即柱状(肠细胞)克隆、粘液(杯状细胞)克隆和混合的克隆2。在我们的研究中所 观察到的克隆特有地具有混合的种类。在蓝色克隆中，杯状细胞的频率(计数的总共2043 个细胞中的114个)、肠细胞(1846/2043)的频率和帕内特细胞的频率(83/2043)与未标 记的邻近上皮中的杯状细胞的频率(计数的总共3691个细胞中的127个)、肠细胞的频率(3345/3691)和帕内特细胞的频率(127/3691)是相当的。如前所述2(参考文献2)，第三 分泌细胞类型，肠内分泌细胞过于稀少而不能允许准确的计数。总而言之，我们得出的结论 是Gpr49+reCBC细胞代表小肠的真实的干细胞。
结肠的分析得到了基本上相同的观察结果。Gpr49+ve细胞产生自隐窝底部发出的 蓝色克隆(图5i)。这些克隆含有结肠细胞和杯状细胞，并且在60天的追踪中基本上保持 不变(图5j，5k)。与小肠情况的一个明显差异包括克隆形成的动力学。在第5天，大部分 隐窝中的蓝色染色仍然局限在底部并且仅稀少地观察到全部蓝色的隐窝，这暗示结肠干细 胞比它们的小肠对应部分更经常地处于静止状态。在更晚的天数，全部蓝色的隐窝的相对 数目增加。我们认为，Gpr49+ve结肠细胞满足了在具备多能性和能够在长时间段内维持上皮 自我更新方面对干细胞的要求。通过利用单个标志物基因，Gpr49的表达的谱系追踪，我们的观察结果提供了肠干 细胞的决定性特征。如通过Ki67和磷酸化组蛋白H3的表达、BrdU的掺入以及通过带形成 的动力学所证明的，小肠Gpr49+ve细胞通常不是静止的，而是快速循环的。小肠Gpr49+re细 胞看起来比它们的结肠对应部分更活跃地分裂，这可能反映了两种器官间上皮更新速率的 差异。干细胞循环看起来有些违反直觉。然而，这并非没有先例。果蝇(Drosophila)睾丸 和苍蝇(fly)卵巢中的生殖干细胞，即动物中有争议地了解得最多的成体干细胞，在成体 苍蝇的整个生命周期中都在循环18 (参考文献2)。类似地，最近优雅的研究证明，哺乳动物 皮肤的成体干细胞是连续循环的19 (参考文献2)。Potten和同事以前认为循环的+4细胞代表小肠干细胞4 (参考文献2)，这是一个 在本文中尚未证实的看法。该看法基于如下观察高干细胞活性期间掺入的DNA标记特异 性地保留在+4位置的细胞中。长期标记保留通常用作鉴定干细胞的间接策略12 (参考文献 2)。然而，应当注意，终末分化的细胞也会保留DNA标记，因此，该标记保留应当谨慎地加以 解释。以前的研究提出了肠干细胞的其它标志物。我们研究的MUsashi2CK21(参考文献2)和 ⑶13322 (参考文献2)染色了每个隐窝高达30至50个细胞(未显示)，这看起来包括CBC 细胞以及早期过度型扩充细胞。Li和同事描述了 +4细胞的几种分子标志物，包括磷酸化 PTEN、磷酸化AKT和14-3-3 ζ 23 (参考文献2)。我们目前的研究提示，应当重新考虑这些推 定的肝细胞标志物的有效性。看起来相当独特地，能够基于单个基因的表达来鉴定成体干细胞。这种现象可能 不限于肠，因为我们在各种其它组织中观察到了高局限性的Gpr49表达。在生长期毛囊中， Gpr49基因表达于凸起区域和外部根鞘(图3i)。尽管休眠的LTR干细胞只位于凸起中，但 是激活的干细胞向下通过外部根鞘朝基底乳头(basal papilla)迁移24_26(参考文献2)。 实际上，最近据报道，Gpr49是第二高的被上调的基因，如通过分离的毛囊干细胞的差异表 达阵列所评价的27 (参考文献2)。而且，毛囊中的初步谱系追踪试验支持Gpr49+ve细胞代表 干细胞的看法(Barker，Clevers and Toftgard，未发表)。尽管胃腺的增殖模式表明上皮 干细胞位于峡部，腺体基质与上皮表面的中间28 (参考文献2)，但是我们发现Gpr49表达于 腺体的底部(图3f、3g)。进行的谱系追踪试验表明，全部腺体衍生自这些细胞(Barker and Clevers，未发表)。在乳腺中，干细胞位于基底上皮层29 (参考文献2)，其中我们观察到了 Gpr49的表达(图3h)。因此，Gpr49可以代表成体干细胞更一般的标志物。如果是这样， 则在这个研究过程中开发的小鼠模型将允许分离以及特异性地遗传修饰多种器官中的活成体干细胞。我们首先将Gpr49鉴定为在结肠癌细胞中表达的基因6 (参考文献2)。Gpr49 表达于其它癌症中(参考文献2)，并且，如目前的研究所述的，Gpr49还表达于恶变前的 小鼠腺瘤中。基于本文所报道的观察结果，我们现在知道Gpr49可以标记结肠直肠腺癌的 癌干细胞(“肿瘤起始细胞”)。实施例2Lgr5的组织表达和这些组织中Lgr5+干细胞的证据材料与方法对于试验细节，我们参照实施例1中所用的材料与方法。 结果和讨论在脑、视网膜、肝和肾上腺中也检测到了 Lgr5的表达我们在小鼠中的多种其它组织中研究了 Lgr5的表达，该小鼠携带整合至Gpr49基 因的最后一个外显子的LacZ，从而去除了编码的Gpr49蛋白的全部跨膜区域。我们确定，与 结肠和小肠类似，在脑、视网膜、肝和肾上腺中检测到了 Lgr5+细胞(图12)。在成体小鼠 中，LGR5局限于脑(嗅球的嗅小球(glomeruli)和几个其它未很好地定义的区域)、眼(视 网膜的内核层)、肝(围绕门三联体的细胞)和肾上腺的稀少的细胞群中。胃、乳腺和肾上腺中的谱系追踪证明，Lgr5在这些组织中标记了干细胞群。我们使用LGR5KI/ROSa26-laCZ小鼠16 (参见实施例1的试验策略)来研究多种其 它组织中Lgr5+干细胞的存在。他莫昔芬的注射在表达Gpr49的细胞中活化CreERT2融合 酶。随后，Cre介导的ROSa26-LaCZ报道分子中的路障(roadblock)序列的切除应当不可 逆地标记Gpr49+re细胞。而且，尽管这些细胞的潜在后代不再表达GFP，但是活化的LacZ将 会作为永久的遗传标记，该永久的遗传标记将被传递给LGR5+re细胞的任何后代，从而允许 我们追踪它们体内的出现和命运。在年幼的LGR5KI/ROSa26-laCZ小鼠中开始谱系追踪，并且在6个月后分析胃上皮 的LacZ活性。LGR5-lacZ阳性细胞开始局限于腺体的底部(图13a)。6个月后，在整个胃 中可见多个完整的IacZ阳性腺体(图13b)，这证明在长时间段内，LGR5+ve细胞能够生成 腺上皮的全部细胞类型。进行了类似的谱系追踪试验，并且在3个月的时间段内分析了乳腺上皮的LacZ活 性。LGR5-lacZ阳性细胞开始局限于原始(virgin)腺体的少数基底上皮细胞(图14a)。妊 娠后，在新形成的乳腺的基底上皮细胞中可见LacZ阳性细胞。这证明，乳腺中的LGR5+细 胞是肌上皮干细胞。在3个月的时间段内，肾上腺中的谱系追踪分析了 LacZ的活性。诱导后5天， LGR5-lacZ阳性细胞开始局限于肾上腺的周边(图15a)。3个月后，大部分肾上腺髓质是 LacZ阳性的(图15b)。这在14个月的时间段内保持阳性(未显示)。这证明，LGR5+细胞 是肾上腺髓质的干细胞。实施例3Lgr6组织表达和相关的干细胞中Lgr6的表达材料与方法转基因小鼠和处理通过将EGFP-Ires_CreERT2盒靶向Lgr6的ATG的胚胎干细胞中的同源重组生 成GPR49-EGFP-Ires-CreERT2小鼠。从Jackson实验室获得Rosa26_LacZ报道分子小鼠。 小鼠自由饮食。通过腹腔注射200 μ 1的他莫昔芬(10mg/ml，溶解于葵花油中)来活化Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/Rosa26-LacZ 小鼠中的 Cre 重组酶。EGFP表达的共聚焦分析对于共聚焦成像，在室温下，将皮肤样本在福尔马林中固定15分钟并包埋在4% 的低熔点琼脂糖中。利用振动切片机(vibratome)来制备100 μ m和200 μ m厚的纵向切 片。然后将切片在补充了 BSA+1% DMS0+0. 1% TritonX的PBS中透化处理，用TO-PRO 1 1000 稀释液(Molecular Probes)染色 30 分钟，并利用 Vectashield (Vector Labs)进 行包埋。用Sp2共聚焦显微镜(Leica)将切片成像，并用Volocity和Photoshop CS2软件 进行加工。β-半乳糖苷酶活性的检测于4°C下，在滚动平台上，将新鲜获得的组织在PBSO溶液中的甲醛/0. 2%戊二 醛/0. 02% NP40中固定2小时。将样本用漂洗缓冲液(2mM MgCl2/0. 02% NP40/PBS0)洗涤3 次，20min，并在由溶于漂洗缓冲液中的lmg/ml X_gal、5mM硫氰化铁(ferrothiocyanide)、 5mM硫氰酸铁(ferrithiocyanide)』.1 %脱氧胆酸钠组成的溶液中染色36_48h。将基质除 去并在室温下，在滚动平台上将样本在PBSO中洗涤2次，20min。然后，在滚动平台上将组 织于4°C下在溶于PBSO的4% PFA中避光过夜固定。除去PFA，并在室温下将组织在PBSO 中洗涤2次，20min。将样本包埋在石蜡中，切片(4 μ m)并用中性红复染。结果和讨论为了表征皮肤中Lgr6的表达，我们使用了敲入小鼠，其中Lgr6启动子调控EGFP 和CreERT2融合蛋白的表达，称为Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2。在毛囊(HF)处于生长(生 长期)期的P25，GFP阳性细胞定位于HF的上凸起/峡部区域的细胞(图16A、16C)和滤泡 间表皮的基底细胞(IFE，图16A、16B)。这种表达模式表明，Lgr6的表达标记毛囊和表皮的 SC/早期祖细胞群体。为了解决生长期HF和IFE的Lgr6+细胞是否代表功能性干细胞的问题，向20天龄 的 Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/Rosa26-LacZ 小鼠注射了他莫昔芬。在 P20，Lgr6 表达于 HF 的上凸起/峡部区域以及IFE的基底细胞(数据未显示)。他莫昔芬注射后3天，能够在HF 和IFE中观察到分散的标记的细胞模式(图17B)。在注射后18天，能够在生长期HF(图 17C、17D)以及IFE和皮脂腺(SG)(图17C、17D)中观察到Lgr6+细胞的后代。在下一个休 止期中，在HF的凸起和峡部(图17E、17F)及IFE和SG (图17E、17F)中发现了标记的细胞。 这一观察结果强烈地表明，Lgr6+细胞位于HF的凸起/峡部区域，并且基底IFE表现出干细 胞特性。具体地，Lgr6+细胞能够促成皮肤的全部附属物，即生长的HF，IFE和SG。成体干细胞能够基于单基因(在本实例中为Lgr6)的表达来鉴定，这看起来是相 当独特的。这种现象可能不限于皮肤，因为我们在多种其它组织中观察到高局限性的Lgr6 表达。为了解决Lgr6+细胞在任何其它组织中是否代表功能性干细胞的问题，给20天龄的 Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/Rosa26-LacZ小鼠注射他莫昔芬。在他莫昔芬注射后18天和32 天进行LacZ染色来评价多种组织中的谱系追踪。有趣的是，在两个时间点，LacZ阳性细胞 都存在于肺的细支气管下的肌上皮中(图18)。因此，Lgr6+细胞地促成肺的肌上皮，这有 力地表明位于肺的Lgr6+细胞也表现出干细胞特性。实施例4Lgr5+癌干细胞在腺瘤中的作用 肠隐窝的解剖学唯一地适合研究它们的小生境中的成体干细胞。鼠小肠的上皮每5天更新u(参考文献5)。强烈的增殖发生在隐窝区室中。我们最近将位于隐窝底部的细长、未分化的表达Lgr5基因的细胞鉴定为小肠和结肠的干细胞。每个小肠隐窝含有约6个 独立、存活时间长的干细胞，这些干细胞与小肠中的帕内特细胞以及与结肠中的杯状细胞 细胞混合。与直觉相反地，这些细胞不是休眠的，而是每天完成一个细胞周期3 (参考文献 5)。Leblond和同事最初将这些细胞在形态学上命名为隐窝基底柱状(CBC)细胞4、5(参考 文献5)。它们的子代细胞组成容易区分的过渡型扩增(TA)隐窝区室。TA细胞每12小时 至16小时分裂，从而每个隐窝每天产生约300个细胞6 (参考文献5)。新形成的TA细胞位 于隐窝中约48小时至72小时，经历了多达6轮的细胞分裂，同时向上迁移6 (参考文献5)。 当定向TA细胞到达隐窝绒毛的连接处时，它们快速并不可逆地分化。在上皮传送带的另一 端，绒毛的尖端，通过凋亡平衡了增殖。只有帕内特细胞逃逸这种流程(flow)；它们在隐窝 基底部的停留时间为3周至6周7_9(参考文献5)。小鼠和人的肠恶性肿瘤中的引发突变靶 向Wnt途径的组分，最常见的是阴性Wnt调节子APCick11 (参考文献5)。这导致驱动良性腺 瘤或息肉形成的Wnt靶基因程序的组成性激活12_15 (参考文献5)。然而，哪种细胞类型维持 引发癌症的突变仍然是不清楚的。给予诱导剂β-萘黄酮(β-NF)后，细胞色素Ρ450启动子驱动的AH-Cre小鼠允 许肠上皮中的floxed等位基因的有条件的缺失。重要地，AH-Cre等位基因在包括干细胞 在内的上皮的全部细胞类型中是高度活跃的16 (参考文献5)。我们以前使用APC的floxed 等位基因17(参考文献5)联合AH-Cre小鼠品系来证明在β-NF的IP注射后，整个成体肠 上皮的APC急性丢失导致上皮的立即的定量转化16 (参考文献5)，该转化是几乎完全取决 于下游Wnt靶基因c-Myc的过程18(参考文献5)。高剂量口服β-NF诱导APC更随机的缺 失，这导致在3周内，在整个肠中快速形成腺瘤19(参考文献5)。这两种高剂量诱导方案在 包括隐窝基底部的干细胞在内的上皮的全部区室中都引起缺失，已经将AHCre/APCfWfl°x小鼠证明为肠癌的可诱导模型后，我们试图通过鉴定腺 瘤的细胞来源(cell-of-origin)来研究腺瘤形成的机制。我们认为低剂量β-NF的口 服给药会将β-NF的作用范围限制于绒毛上的细胞和隐窝上部区域上的细胞。对所需剂 量的小心滴定揭示，lmg/kg^-NF 口服给药后，隐窝基底部的干细胞中Cre活化的效率非 常低，如通过在接受这个剂量的AHCre/R26R小鼠中开始的长期谱系追踪的很小的频率所 测量的。这一剂量对于诱导TA区室和绒毛上皮中的Cre活性仍然是非常有效的，如利用 Rosa26-LacZ小鼠2(1(参考文献5)作为Cre报道分子所检测的(图19a、19b)。在典型的试 验中，诱导后2天，超过70 %的绒毛含有蓝色细胞，但是在第7天时，不能再检测到蓝色染 色。和这种情况一致的是，在口服诱导后的第100天，没有检测到隐窝/绒毛带(图19c)。利用在AHCre/APCfl°xm°7R26R小鼠上的这种剂量方案，在整个上隐窝和绒毛上皮 中，多种联蛋白S局灶/病灶(lesion)很快变得可见。诱导后第3天拍摄的代表性图 片示于图20中。通过高联蛋白水平显示的突变APC局灶主要存在于隐窝-绒毛连接 处，但是也在绒毛上被观察到(图19d)。非常罕见地，还在隐窝基底部附近观察到了这些病 灶。4天至5天后，存在于绒毛上皮上的大部分APC缺陷细胞丢失，这可能是通过脱落 导致的。在24天的时间段内，剩下的存在于隐窝中的APC缺陷的IacZ阳性病灶/局灶没 有扩增。这种病灶的典型实例示于图20e中。在这一阶段，没有观察到肉眼可见的腺瘤。明显地，这些小病灶在整个180天的时间段内持续存在(图20g)，仅有极少数发展成小腺瘤， 其扩增不超过2至3个绒毛(图20f、20h)。这与大腺瘤的高频率形成鲜明对比，所述大腺 瘤发生在高剂量3-顺诱导后的4此1^/^ (51°!^1°!￡小鼠中，。 这表明，后一小鼠中的绝大多 数腺瘤是干细胞中APC的丢失导致的。为了正式地证明肠干细胞的转化是形成腺瘤的主要途径，我们使用我们的 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2敲入小鼠作为干细胞特异性Cre品系来诱导地缺失f loxed APC0 为此目的，产生了 Lgr5-EGFP-ireS-CreERT2XAPCfiwflra小鼠。在这些小鼠中，用单次他莫 昔芬的IP注射来活化干细胞特异性的Cre酶(图21a)。随后在2个月的时间段内，追踪肠 中的表型变化。3天后，在隐窝基底部的分离的CBC细胞中首先观察到了 Wnt效应物蛋白， β-联蛋白的积累(图21a)。这些转化的细胞是GFP阳性的，这证实了肠干细胞中APC的 靶向缺失(图21b)。5天后，观察到全部肠的多个隐窝含有转化的(即，β-联蛋白勺干 细胞，该转化的干细胞与过渡型扩增(TA)区室中的联蛋白S细胞的高度增殖的簇/袋 (pocket)有关(图21c、21d)。这表明，Wnt转化的干细胞保持存活并快速地产生高于隐窝 的转化的后代的扩增群体。在干细胞中诱导APC缺失后8天，转化的细胞的“袋”继续在隐 窝中和隐窝上皮的袋外(outpocket)/外翻部分中扩增，并且相关绒毛基质中的小腺瘤变 得明显(图21e)。在这些小鼠中，具有积累的联蛋白的细胞从不出现在绒毛上皮上， 这证明扩增的转化的群体局限于肠隐窝。这些观察结果明显地使人想起腺瘤形成的模型， 其中表达高水平的Wnt靶基因EphB2和EphB3的Wnt转化的细胞在隐窝中扩增，直到它们 与Ephrin阳性的绒毛上皮相接触21、22(参考文献5)。因此，产生的斥力使得微腺瘤只能通 过侵入相邻绒毛的基质来继续扩增，在那里微腺瘤与Ephrin阳性的绒毛上皮隔离。如开始干细胞转化后36天，整个肠中多个大腺瘤的存在所证实的，在第8天诱导 的Lgr5KI/APCfl°xm°x小鼠中存在的“袋外”和微腺瘤继续它们侵入性的扩增(图21f)。为了进一步研究存在于APC缺陷干细胞与它们转化的后代之间的序位体系 (hierarchy)，我们在我们的模型的腺瘤形成的各个阶段中检查了干细胞标志物蛋白 Lgr5-EGFP的表达。在未转化的干细胞中，Lgr5_EGFP的表达局限于隐窝基底柱状(CBC)细 胞(图22a)。开始干细胞转化3天后，保持了这种干细胞标志物的表达(图22b)，并且8天 后，在新扩增的转化的后代的“袋”中，这种干细胞标志物的表达也是明显的(图22c)，这表 明这些细胞被赋予了 “干性”的至少某些方面。然而，在存在于36天诱导的小鼠的肠中的 较大的腺瘤中，Lgr5-EGFP的表达有明显的下调，尽管在全部肿瘤中有均勻的高β-联蛋白 水平(图22d)。Lgr5-EGFP的表达局限于肿瘤块中的数个分散的细胞(图23)。这些GFp 阳性细胞保持CBC肠干细胞特征性的细长、楔形的形态。因此，倾向于推测较大腺瘤中Lgr5 的表达使得少数群体的干细胞成为促进它们的连续生长的原因。总之，这些数据证明，通过 丢失Apc的干细胞转化是引起肠腺瘤形成的非常有效的途径。这个过程的动力学表明，一 旦在肠上皮中丢失了两个Apc等位基因，则不需要其它突变，这与Apc的肿瘤抑制活性的组 织向性是一致的。实施例5抗LGR5和LGR6的抗体的产生和用途材料与方法利用Genovac (Freiburg, Germany)，通过用表达人Lgr5或Lgr6的表达质粒对大 鼠进行肌肉内注射来产生单克隆大鼠抗体。使大鼠B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。在用人或小鼠Lgr5或Lgr6表达质粒转染的HEK293细胞上筛选产生的杂交瘤。使用或不使用多西环素将L8 (DNTcf4-LS174T)细胞培养48hr。L8细胞是LS174T 细胞的克隆衍生物。在多西环素(DOX)的诱导下，L8细胞表达显性阴性形式的T细胞因子 4 (DNTcf4 ；参见 Roose et al.，1999，Science 285:1923-1926)。DNTcf4 关闭组成型活化 的Wnt途径。将大鼠IgG用作阴性同种型对照。48hr后，用冰冷的PBS洗涤细胞，并利用 5mM的EDTA将该细胞制成悬液。全部下述步骤都在4°C下进行。在含有2% BSA的PBS中 封闭细胞30分钟。随后，将初级抗体(一抗)和次级抗体(二抗)孵育lhr，并用冰冷的 PBS/2% BSA洗涤。对于一抗染色，我们使用未稀释的杂交瘤上清液，利用Qdot 655山羊 F(ab，)2 抗大鼠 IgG 偶联物(conjugate) (H+L) (MolecularProbes/Invitrogen)来进行二 抗染色。在分析前，添加碘化丙锭来排除分析中的死细胞。结果如通过FACS分析所检测的，某些分离的抗体的特异性示于表4和表5中。9G5是 抗hLgr5的大鼠单克隆抗体。在L8细胞中进行内源Lgr5的表达分析。L8细胞是LS174T 细胞的克隆衍生物。在多西环素(DOX)的诱导下，L8细胞表达显性阴性的Tcf4(DNTcf4)。 DNTcf4关闭组成型活化的Wnt途径。图24反映了这种情况，该图24显示了用9G5抗体或 IgG对照抗体对L8细胞的FACS染色。DOX诱导48hr后，确实观察到了内源hLgr5蛋白水 平的降低，从用多西环素处理的L8细胞的峰的荧光平均值的减少也清楚地看到这一点。还用LGR5特异性抗体2F10、10C1和6C10进行了这个试验。如图26所示，用这些 LGR5特异性抗体中任一种获得了类似的结果。表4. Lgr5抗体的特异性。9G5既识别小鼠Lgr5又识别人Lgr5。结肠癌细胞系 DLDl和SW480，LIM1863没有表现出对Lgr5的特异性染色。对于抗小鼠Lgr4、Lgr6和人 Lgr4、Lgr6的交叉反应性，这些抗体被检测为阴性的。
表5. Lgr6抗体的特异性。除了人Lgr6以外，抗体ld8和3d8识别小鼠Lgr6和 hLgr5。结肠癌细胞系LS174、DLD1和SW480没有表现出对Lgr6的特异性染色。对于抗小 鼠Lgr4、Lgr5和人Lgr4的交叉反应性，这些抗体被检测为阴性的。 实施例6来自结肠和小肠的干细胞与它们的直接后代相比的表达分析
材料与方法GFP阳性上皮细胞的分离 将新鲜分离的小肠或结肠沿它们的纵向切开，并且通过刮擦除去绒毛(对于小 肠)。然后将组织在PBS/5mM EDTA中孵育5分钟。通过温和摇动除去剩余的绒毛，随后在 4°C下，将肠组织在PBS/EDTA中孵育30分钟。剧烈的摇动得到游离的隐窝，在37°C下，将隐 窝在添加了胰蛋白酶(10mg/ml)和DNAse (0. Su/μ 1)的PBS中孵育30分钟。孵育后，将细 胞离心(spin down)，在SMEM(Invitrogen)中再悬浮，并通过40 μ M网孔进行过滤。利用 MoFlo细胞分选仪(DAKO)来分离表达GFP的细胞。微阵列分析从来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠的肠的GFPhi和GFP1。细胞组分分离RNA。 利用低 RNA 输入线性扩增(RNA Input Linear Amp)试剂盒(Agilent Technologies,Pato Alto, CA, USA)标记 250ng 的总 RNA。根据说明书(Agilent Technologies, Santa Clara, CA,USA)进行标记、杂交和洗涤操作。将来自两种不同分类(每种分类组合了三种不同的小 鼠)的GFPhi和GFP1。细胞的差异标记的cRNA合并，并在4X44K Agilent全小鼠基因组双色 微阵列(Whole Mouse Genome dual colourMicroarrays) (G4122F)上，在两个染料交换试 验中进行杂交，这获得了 4种不同的阵列。利用ArrayAssist (Stratagene Inc,La Jolla, CA, USA)和 Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA)来进行全部数 据分析。通过扣除局部背景来校正原始信号强度。对于只存在于一个样品(GFPhi
中的特征，通过正值将负值变换到接近O (局部背景的标准偏差)以允许计算强度之间的定 量。如果两个(GFPhi或GFPltO强度都被改变，或者如果两个强度都小于两倍背景信号，则 将数据过滤并通过Loess算法将数据标准化。通过SAM的Excel版本(微阵列显著性分析 (Significant Analysis of Microarrays))，利用该软件的Excel插件，进行统计学分析 (Tusher PNAS 2001，参考文献6)，并且以“单类(one clas) ”作为响应值。如果基因的q值 小于0. 1，并且存在于4个阵列中的至少3个以及全部4个阵列的平均值超过0. 6的log2 定量，则认为基因在GFPhi细胞中明显地富集。结果为了定义Lgr5+肠干细胞的基因表达谱，我们建立了由从 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠新鲜分离的隐窝制备的细胞悬液分选GFP阳性上皮细胞的 方法(参见，方法)。FACS分析区分了高GFP(GFPhi)群体和低GFP (GFPltj)群体，我们暂时 将它们分别定义为CBC细胞和它们直接的过度型扩增的子细胞(图25)。一个小鼠肠通常 产生几十万个GFPhi和GFP1。细胞。图25A提供了几乎纯的Lgr5表达细胞的群体的实例。 为了鉴定新的干细胞基因，对两个群体的mRNA样本进行比较基因表达分析(comparative gene expression profiling)。令人满意的是，在GFPhi细胞中最高富集的基因是Lgr5基 因自身。以前，例如在人结肠癌中(van der Flier et al，2007，Gastroenterology 132， 628-632)，已经将列表(表6)上的多个基因鉴定为肠Wnt靶基因，这进一步验证了基因列 表。尽管这些Wnt靶基因的原位杂交通常证实了 CBC细胞中高水平的表达，但是帕内特细 胞的直接上方的TA细胞也表达这些基因，尽管以低得多的水平表达。作为示例，图25B显 示了 Sox9的表达，该Sox9是对帕内特细胞特化关键(Bastide et al.，2007 ；Mori-Akiyama et al. ,2007)的 Wnt 应答基因(Blache et al. ,2004)
讨论在肠中，通过Lgr5表达来定义长存活时间的循环的干细胞池，该Lgr5是Wnt应答 孤儿 G 偶联受体(Barker et al. ,2007, Nature 449，1003-1007)。Leblond 和同事以前观 察到这些Lgr5+细胞，并将它们命名为隐窝基底柱状(CBC)细胞，他们认为这些CBC细胞代 表肠上皮的干细胞(Cheng and Leblond，1974，Am J Anat 141，461-79)。在此处，基于 GFP 表达，我们通过利用Lgr5-EGFP-ireS-CreERT2敲入小鼠进行分选，来定义这些CBC细胞的 最小基因表达谱。我们定义了一组在GFPhi组分之间差异地表达的基因。基于分离 的隐窝的共聚焦成像，我们暂时将这些分别鉴定为CBC细胞和它们的子细胞。在这一组中， 发现Lgr5是差异最大的基因，这暗示该基因的表达强烈地局限于CBC细胞。先前表现这种 特征的许多其它基因鉴定为依赖于Wnt的基因，例如Ascl2、CD44、Ephb3、Sox9和Sp5 (van der Flier et al, 2007,Gastroenterology 132,628-632)。考虑到许多组织中 Wnt 信号传 导与干细胞生物学之间的紧密联系(Reya and Clevers, 2005,Nature 434，843-850)，这种 情况并不令人吃惊。表6干细胞和它们的直接后代的表达分析基于Lgr5表达的小肠干细胞(表6a)和结肠干细胞(表6a)特征。利用FACS分 选来分离来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠的纯隐窝制备物的GFP阳性上皮细胞。FACS 分析区分GFPhi和GFP1。细胞两种群体，这分别对应于CBC细胞和它们直接的过度型扩增的 子细胞。为了鉴定新干细胞基因，利用Agilent微阵列分析对两个群体的mRNA样品进行比 较基因表达分析。表6a小肠干细胞与直接后代的比较 1Q 值< 0. 15表6b结肠干细胞与直接后代的比较 1Q 值< 0. 05实施例7LGR5特异性/LGR6特异性抗体包括⑶R区域在内的轻链和重链的序列确
定材料与方法
杂交瘤序列如实施例5的材料与方法所述地制备杂交瘤。从Lgr5特异性和/或Lgr6特异性克隆杂交瘤细胞系NR 2F10 (参见表4)和6d8及2f4 (参见表5)来确定杂交瘤序列。利用Trizol试剂来分离总RNA，并利用superscript 逆转录酶(Promega)来生成cDNA。在“降落(touch-down) ”PCR中，利用设计为扩增IgG 抗体Fv-DNA序列的PCR引物来扩增cDNA。将PCR片段克隆进PJET1 · 2 (Fermentas)或 PGEM-T(Promega)克隆载体中，随后在ABI测序仪上，利用载体特异性引物进行测序。I gG 抗体 Fc-DNA 序列 PCR 引物κ L链反向引物；混合的25个单独合成的寡核苷酸(oligo)，代表50种变体MVK-I GACATTGTTCTCACCCAGTCTCCMVK-2 GACATTGTGCTSACCCAGTCTCCMVK-3 GACATTGTGATGACTCAGTCTCCMVK-4 GACATTGTGCTMACTCAGTCTCCMVK-5 GACATTGTGYTRACACAGTCTCCMVK-6 GACATTGTRATGACACAGTCTCCMVK-7 GACATTMAGATRACCCAGTCTCCMVK-8 GACATTGCAGATGAMCCAGTCTCCMVK-9 GACATTCAGATGACDCAGTCTCCMVK-IO GACATTCAGATGACACAGACTACMVK-Il GACATTCAGATGATTCAGTCTCCMVK-12 GACATTGTTCTCAWCCAGTCTCCMVK-13 GACATTGTTCTCTCCCAGTCTCCMVK-14 GACATTGWGCTSACCCAATCTCCMVK-15 GACATTSTGATGACCCARTCTCMVK-16 GACATTKTGATGACCCARACTCCMVK-17 GACATTGTGATGACTCAGGCTACMVK-18 GACATTGTGATGACBCAGGCTGCMVK-19 GACATTGTGATAACYCAGGATGMVK-20 GACATTGTGATGACCCAGTTTGCMVK-21 GACATTGTGATGACACAACCTGCMVK-22 GACATTGTGATGACCCAGATTCCMVK-23 GACATTTTGCTGACTCAGTCTCCMVK-24 GACATTGTAATGACCCAATCTCCMVK-25 GACATTGTGATGACCCACACTCCκ L-链正向引物mck-1 ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACH-链可变区反向引物，混合的25个单独合成的寡核苷酸，代表88种变体MVH-IGCCGGCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTCAGGAC
MVH-2GCCGGCCATGGCCGAGGTSCAGCTKCAGCAGTCAGGAC
MVH-3GCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTCAGGMVH-4GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCSGGACMVH-5GCCGGCCATGGCCGARGTCCAGCTGCAACAGTCYGGACMVH-6GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTKCAGCAATCTGGMVH-7GCCGGCCATGGCCCAGSTBCAGCTGCAGCAATCTGGMVH-8GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTGCAGCAGTCTGGRCMVH-9GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTYCAGCAGTCTGGMVH-10GCCGGCCATGGCCGAGGTCCARCTGCAACAATCTGGACCMVH-IlGCCGGCCATGGCCCAGGTCCACGTGAAGCAGTCTGGGMVH-12GCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATCTGMVH-13GCCGGCCATGGCCGAVGTGAAGYTGGTGGAGTCTGMVH-14GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTCTGGGGMVH-15GCCGGCCATGGCCGAKGTGCAMCTGGTGGAGTCTGGGMVH-16GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTCTGGMVH-17GCCGGCCATGGCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTCTGGTGMVH-18GCCGGCCATGGCCGARGTRAAGCTTCTAGAGTCTGGAMVH-19GCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTCTGGMVH-20GCCGGCCATGGCCGAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGMVH-21
GCCGGCCATGGCCCAGGTTACTCTRAAAGWGTSTGGCCMVH-22GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCCTGGMVH-23GCCGGCCATGGCCCAGGTYCARCTGCAGCAGTCTGMVH-24 GCCGGCCATGGCCGATGTGAACTTGGAAGTGTCTGGMVH-25GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTCTGGH-链正向引物MJH-REV1&2GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGMJH-REV2INTGGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACAGTGGMJH-REV3GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACCAGAGMJH-REV4GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACCGAGG可变位置索引:R(A/G)；M(A/C) ； Y(T/C) ；W (Α/Τ) ； S(G/C) ； K(G/T) ； H(A/T/C)； B (G/C/T) ； V(G/A/C) ；D (G/A/T) ； N(G/A/T/C)在这个试验中使用了小鼠特异性寡核苷酸。对于更加可再现的结果，也能够使用大鼠特异性寡核苷酸。结果LGR5特异性抗体NR 2F10的轻链序列(参见表4)和LGR6特异性抗体6d8及2f4的 重链序列(参见表5)示于图27中。以粗体和斜体表示⑶R区。根据Kabat (Kabat et al.， "Sequences of Proteins of Immunological Interest^SS), 'U S. Dept. ofHealth and Human Services,国立卫生院(National Institute of Health), 1987)来确定CDR序列。包含至少这些CDR序列的至少一种的抗体或其功能性等同物组成 高亲和力结合化合物，该高亲和力结合化合物具有对它们的靶蛋白Lgr5和/或Lgr6的高 特异性。参考文献11) Reya, Τ· , Morrison, S. J. , Clarke, M. F. & Weissman, I. L. 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权利要求
用于获得干细胞的方法，其包括-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr6和/或Lgr5结合化合物接触-鉴定与所述结合化合物结合的细胞-任选地将所述干细胞与所述结合化合物分离。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述Lgr5和/或Lgr6结合化合物是能够结合Lgr5 或Lgr6的抗体或抗体衍生物或抗体片段。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述Lgr5和/或Lgr6结合化合物是Lgr5或Lgr6 配体，例如配体融合蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述Lgr5和/或Lgr6结合化合物是对Lgr5或Lgr6 具有亲和力的小分子。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述干细胞是肠干细胞、视网膜 干细胞、脑干细胞、乳房干细胞、毛囊干细胞、胃干细胞、肝干细胞、肺干细胞、胰腺干细胞、 睾丸干细胞、心脏干细胞或卵巢干细胞。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中使至少两种不同的结合化合物 与所述细胞悬液接触。
7.如权利要求1、2或5中任一权利要求所述的方法，其中使能够结合Lgr5或Lgr6的 至少两种不同的抗体或抗体衍生物或抗体片段与所述细胞悬液接触。
8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中将荧光活化细胞分选法用于鉴 定和分选结合Lgr5或Lgr6结合化合物的细胞。
9.用于维持或培养组织干细胞或器官干细胞的方法，其包括向组织干细胞或器官干细 胞提供Lgr5和/或Lgr6配体或者Lgr5或Lgr6的小分子激动剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述配体是胰岛素肽家族的成员。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述配体是胱氨酸结家族的成员。
12.通过如权利要求1至11中任一权利要求的方法可获得的分离的干细胞。
13.如权利要求12所述的干细胞在制备用于治疗受损或患病组织的药物中的用途。
14.用于治疗组织或器官损伤的组合物，其包含权利要求12所述的干细胞，优选组织 干细胞或器官干细胞。
15.Lgr5和/或Lgr6作为用于分离组织干细胞或器官干细胞的标志物的用途。
16.Lgr5和/或Lgr6结合化合物用于分离组织干细胞或器官干细胞的用途。
17.用于获得癌干细胞的方法，其包括-任选地从实体瘤或液体瘤样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr6和/或Lgr5结合化合物接触-鉴定与所述结合化合物结合的细胞-任选地将所述癌干细胞与所述结合化合物分离。
18.分离的癌干细胞，包含嵌入在它们的细胞膜中的Lgr6和/或Lgr5。
19.通过如权利要求17所述的方法可获得的分离的癌干细胞。
20.用于测试可能的抗癌干细胞化合物的作用的方法，其包括使如权利要求18或19 所述的一组癌干细胞在体外与所述可能的抗癌干细胞化合物接触，并测试所述处理的癌干细胞是否能够产生不断生长的肿瘤，并且其中优选地将所述可能的癌干细胞药物设计为 Lgr5或Lgr6抑制剂或者设计为Lgr5或Lgr6结合化合物。
21.Lgr6或Lgr5抑制剂，或者Lgr6或Lgr5结合化合物。
22.如权利要求21所述的Lgr5或Lgr6抑制剂，其中所述抑制剂是Lgr5蛋白或Lgr6 蛋白的抑制剂。
23.如权利要求21所述的Lgr5或Lgr6抑制剂，其中所述抑制剂是Lgr5或Lgr6的 mRNA转录物的抑制剂。
24.如权利要求21所述的Lgr5或Lgr6结合化合物，其中所述结合化合物是能够结合 Lgr5或Lgr6的抗体或抗体衍生物或抗体片段。
25.如权利要求21所述的Lgr5或Lgr6结合化合物，其中所述结合化合物包括Lgr5或 Lgr6的配体。
26.如权利要求21至25中任一权利要求所述的至少一种Lgr6或Lgr5抑制剂或者至 少一种Lgr6或Lgr5结合化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
27.如权利要求26所述的用途，还包括一般的抗癌治疗。
28.如权利要求26或27所述的用途，其中所述癌干细胞参与包括结肠癌、直肠癌和结 肠直肠癌的肠癌，皮肤癌(基底细胞癌)，食道癌，乳腺癌，前列腺癌，成神经管细胞瘤和其 它脑癌，肝癌，胃癌，视网膜癌，头颈癌，睾丸癌，毛囊癌，卵巢癌，肾上腺髓质癌(嗜铬细胞 瘤)或肺癌。
29.如权利要求27或28所述的用途，其中在所述常规癌症治疗后或所述常规癌症治疗 期间开始用至少一种Lgr5和/或Lgr6抑制剂或者至少一种Lgr5和/或Lgr6结合化合物 进行治疗。
30.如权利要求26至29中任一权利要求所述的用途，其中使用至少两种Lgr5和/或 Lgr6抑制剂或者至少两种Lgr5和/或Lgr6结合化合物或者至少一种Lgr5和/或Lgr6抑 制剂与至少一种Lgr5和/或Lgr6结合化合物的组合。
31.能够结合Lgr6和/或Lgr5的配体的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
32.组合物，包含至少一种Lgr6和/或Lgr5抑制剂或者至少一种Lgr6和/或Lgr5结 合化合物。
33.组合物，包含至少两种Lgr6和/或Lgr5抑制剂或者至少两种Lgr6和/或Lgr5结 合化合物或者至少一种Lgr6和/或Lgr5抑制剂与至少一种Lgr6和/或Lgr5结合化合物 的组合。
34.用于确定肿瘤的癌干细胞含量的方法，其包括使所述肿瘤与Lgr6和/或Lgr5结 合化合物接触，除去未结合的结合化合物，并且确定在所述肿瘤中是否存在任何结合的结 合化合物。
35.Lgr6和/或Lgr5结合化合物在制备用于诊断样本中癌干细胞的存在和/或含量的 诊断剂中的用途。
36.如权利要求34所述的方法或如权利要求35所述的用途，其中所述结合化合物与 允许放射性成像、正电子发射断层扫描、核磁共振成像或X射线/计算机断层扫描的物质结合。
37.用于确定体液是否含有癌干细胞的方法，其包括-任选地获得来自所述体液的样本 -使所述体液与Lgr6和/或Lgr5结合化合物接触 -除去未结合的结合化合物-检测包含Lgr6和/或Lgr5结合化合物的任何结合的复合物 -从结合的复合物的存在来确定癌干细胞的存在。
38.用于确定抗癌治疗的功效的方法，包括在抗癌治疗前和抗癌治疗后，通过使癌与 Lgr6和/或Lgr5结合化合物接触来确定癌干细胞的存在。
39.用于修饰干细胞的基因组序列的方法，其包括根据如权利要求1至11中任一权利要求所述的方法来分离干细胞的集合； 使所述集合与核酸接触以修饰基因组序列； 分离其中基因组序列已经被修饰的干细胞。
40.分离的基因组修饰的干细胞，其通过权利要求39所述的方法可获得，并且其中至 少90%的所述细胞是Lgr6和/或Lgr5阳性细胞。
41.如权利要求40所述的分离的基因组修饰的干细胞在制备用于治疗受损或患病组 织的药物中的用途。
42.用于治疗组织或器官损伤的组合物，包含如权利要求40所述的分离的基因组修饰 的干细胞。
43.Lgr6和/或Lgr5结合化合物，其包含抗体或抗体衍生物或抗体片段，所述抗体或 抗体衍生物或抗体片段包含如图27所示的CDR1、CDR2和/或CDR3序列，以及优选的互 补免疫球蛋白轻链或重链分子，从而根据Kabat (Kabat et al. ,"Sequences of Proteins oflmmunological Interest (免疫学感兴趣的蛋白的序列)，”U. S. D印t. ofHealth and Human Services, National Institute of Health, 1987) Jfe石；！胃CDR ·歹lj。
44.如权利要求43所述的结合化合物，从而所述结合化合物是单克隆抗体或者Lgr6或 Lgr5结合片段或其衍生物，优选大鼠单克隆抗体。
45.如权利要求43所述的结合化合物，从而所述结合化合物是嵌合的单克隆抗体、去 免疫化的单克隆抗体或人源化的单克隆抗体，或者Lgr6或Lgr5结合片段或其衍生物。
46.如权利要求43至45中任一权利要求所述的结合化合物，从而将所述抗体或抗体衍 生物或抗体片段连接至毒剂，或者连接至能够将前药转化成毒剂的酶。
47.如权利要求43至45中任一权利要求所述的结合化合物用于鉴定或分离干细胞的 用途。
48.如权利要求43至46中任一权利要求所述的结合化合物作为治疗癌症的药物的用途。
49.重组动物，包含受Lgr5或Lgr6启动子调控的第一报道基因，从而使得所述报道基因产物表达于表达 Lgr5或Lgr6的细胞中；与所述第一报道基因可操作地连接的、编码可调节的蛋白的序列，从而使得所述可调 节的蛋白与所述第一报道基因产物在表达Lgr5或Lgr6的细胞中共表达； 在所述可调节的蛋白激活时表达的第二报道基因。
50.重组干细胞，包含受Lgr5或Lgr6启动子调控的第一报道基因，从而使得所述报道基因产物表达于表达 Lgr5或Lgr6的细胞中；与所述第一报道基因可操作地连接的、编码可调节的蛋白的序列，从而使得所述可调 节的蛋白与所述第一报道基因产物在表达Lgr5或Lgr6的细胞中共表达；在所述可调节的蛋白激活时表达的第二报道基因。
51.如权利要求50所述的重组干细胞，所述干细胞是肿瘤干细胞。
52.如权利要求49所述的重组动物，或如权利要求50或51所述的重组干细胞，其中所 述可调节的蛋白是CRE-ERT2。
53.如权利要求49或52所述的重组动物，或者如权利要求50至52中任一权利要求所 述的重组干细胞，其中所述第二报道基因包括LacZ。
54.重组肿瘤干细胞，包含受Lgr5或Lgr6启动子调控的报道基因，从而使得所述报道 基因产物表达于表达Lgr5或Lgr6的细胞中。
55.如权利要求49、52或53中任一权利要求所述的重组动物、或者如权利要求50至 54中任一权利要求所述的重组干细胞用于追踪干细胞和/或干细胞的后代的用途。
56.用于鉴定干细胞的后代的方法，其包括提供如权利要求49、52或53中任一权利要求所述的重组动物，或者如权利要求50至 53中任一权利要求所述的重组干细胞；激活所述可调节的蛋白；以及鉴定不表达Lgr5和/或Lgr6和/或第一报道分子、而表达第二报道蛋白的细胞。
57.如权利要求20所述的方法，还包括使所述可能的抗癌干细胞化合物与器官干细胞 的组织接触，并选择特异性地影响肿瘤干细胞的化合物。
58.用于抑制肿瘤的肿瘤维持潜力的方法，包括向所述肿瘤提供能够结合Lgr5和/或 Lgr6的化合物。
全文摘要
本发明涉及生物化学、药学和肿瘤学领域。本发明特别地涉及新的干细胞标志物用于分离干细胞的用途。本发明还涉及获得的干细胞及它们在诸如研究或治疗中的用途，诸如用于制备治疗受损或患病组织的药物。在一实施方案中，本发明提供了用于获得(或分离)干细胞的方法，该方法包括下述步骤任选地从组织或器官样品制备细胞悬液，使所述细胞悬液与Lgr6或Lgr5结合化合物接触，鉴定与所述结合化合物结合的细胞，以及任选地将干细胞与所述结合化合物分离。本发明还涉及适合癌症治疗的方法，甚至更具体地适合通过根除癌干细胞来治疗癌症的方法。
文档编号C12N5/071GK101868534SQ200880110833
公开日2010年10月20日 申请日期2008年8月8日 优先权日2007年8月10日
发明者安德里亚·海格巴斯, 尼古拉斯·巴尔克尔, 约翰尼斯·卡洛鲁斯·克莱威尔斯, 马库斯·拉姆博尔特乌斯·万德韦特凌 申请人:哈布勒支研究所;荷兰皇家科学院