专利名称：：由糖蜜生产发酵产物的方法
技术领域：
：本发明涉及自糖蜜生产发酵产物(如乙醇)的方法。
背景技术：
：自糖蜜大规模商业性生产燃料乙醇是本领域已知的。糖蜜是甘蔗或甜菜精炼的副产物。糖蜜是含有约50%蔗糖的深褐色甜浆。在蒸发自甘蔗或甜菜提取的汁液时，除水促进糖以结晶形态分离。当此糖结晶过程达到其极限并取出糖晶体时，剩余的深褐色稠浆称作糖蜜。W096/13600披露了一种为了改进发酵过程(如乙醇的发酵性生产)中的原料利用，自液化和/或糖化淀粉、甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜中存在的不可发酵的糖类生产可发酵单糖的方法。US4，769，324涉及在能够在含有糖蜜的培养基中生长和产生淀粉酶的酵母的存在下通过糖蜜发酵来生产乙醇。BR-PI-990252-8-A披露了一种生产乙醇的工艺，其中通过蛋白酶或如葡聚糖酶、纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶、和酸性或碱性昆布多糖酶(laminarinase)等酶的酶法作用来使发酵酵母抗絮凝。需要进一步改进发酵产物(如乙醇)制造工艺。发明概述本发明涉及使用发酵生物自糖蜜生产发酵产物的方法，其中将糖蜜i)用a_淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理，并ii)使用一种或多种发酵生物以107_101(1个细胞/mL发酵培养基的细胞计数发酵。依照本发明，原料(feedstock)是糖蜜，即例如甘蔗或甜菜精炼的副产物。附图简述图1显示了糖蜜发酵期间的发酵期间的。Bx发展。图2为同时糖化和发酵期间添加的含有酶混合物显示了糖蜜发酵期间的PH发展。图3为同时糖化和发酵期间添加的含有合物显示了。Bx线性趋势线。图4为同时糖化和发酵期间添加的含有显示了pH发展。图5为同时糖化和发酵期间添加的含有显示了糖蜜发酵期间的。Bx发展。图6为同时糖化和发酵期间添加的含有显示了。Bx线性趋势线。图7显示了酶法预处理糖蜜30小时接着发酵6小时后的乙醇产量。图8显示了酶法预处理糖蜜30小时接着发酵10小时后的乙醇产量。图9显示了酶法预处理接着发酵6小时后的总还原糖(TRS)衰减作为生产率增a-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶的两种a-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶的酶混a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的两种酶混合物a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的两种酶混合物a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的两种酶混合物frff.o图10显示了酶法预处理接着发酵10小时后的总还原糖(TRS)衰减作为生产率增frff.o图11显示了用酶混合物进行的同时糖化和发酵期间的粘度。发明详述本发明提供了使用发酵生物自糖蜜生产发酵产物(尤其是乙醇)的方法。发明人发现，当糖蜜经受a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理时，生产率得到提高。这是有利的，因为发酵时间能得以缩短。不受任何理论限制，认为a-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理导致发酵培养基中的粘度和/或密度降低。这样，发酵生物的细胞膜上发酵培养基中可发酵糖的流入得到促进。这可导致糖变成发酵产物的转化率增加，导致发酵时间缩短因而生成率更高。一种备选的或额外的理论是细胞浓度和/或细胞存活力升高。发明人还发现在进行发酵之前预处理糖蜜时，可获得产量改进。本发明涉及使用发酵生物自糖蜜生产发酵产物的方法，其中将糖蜜i)用a_淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理，并ii)使用一种或多种发酵生物以107_101(1个细胞/mL发酵培养基的细胞计数发酵。在一个优选的实施方案中，所述细胞计数为lCf-lCT个细胞/mL发酵培养基，尤其是约109个细胞/mL发酵培养基。浓缩的糖蜜具有约80%的。Bx。在发酵培养基中，在水中稀释糖蜜，使得本发明方法期间的糖蜜具有约1_35%、优选16-25%、优选约18-22%范围内的。Bx。在高重力方法中，°Bx在25-35、优选27-32°Br范围内。Brix(°Bx)是液体(例如水)中溶解的固体(例如蔗糖)对水的质量比的量度。它可以用测量液体比重的装置(例如糖量计)来测量。例如，25°Bx的溶液为25%(w/w)，25克蔗糖每100克液体，即100克溶液中有25克蔗糖和75克水。步骤i)中的酶处理和步骤ii)中的发酵可以依次或同时进行。在一个优选的实施方案中，在各步骤依次进行的情况中，酶处理步骤i)是作为预处理步骤进行的，优选在对所述酶合适的条件下进行。在一个实施方案中，步骤i)是在20-70°C、优选40-60°C、优选45-55°C范围内的温度进行的。处理期间的pH优选在4-6范围内。步骤i)中的预处理可以进行1-10天，接着发酵1-80小时、优选1-70小时或1-15小时、如1-10小时。在一个实施方案中，糖蜜(°Br为80%左右)在中间罐(surgetank)中于40-60°C在4-6范围内的pH预处理1-10天。此后将预处理后的糖蜜以16-24%范围内的。Br、pH3-6、在30-36°C的温度发酵1-18小时或1-15小时。当本发明的方法作为同时步骤i)和步骤ii)方法进行时，所使用的温度范围对于发酵生物是合适的，优选最佳的。所述温度取决于所讨论的发酵生物。在一个优选的实施方案中，所述温度在25-60°C范围内。本领域技术人员能容易地确定合适的或最佳的温度。在一个实施方案中，处理时间在约1-96小时、优选5-72小时的范围内。在一个实施方案中，糖蜜(°Br为16-24%)于30_36°C范围内的温度、pH3-6发酵6-96小时。如果本发明的方法是使用酵母(如酵母属(Saccharomyces)的菌株，优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株)作为发酵生物的乙醇生产方法，那么该方法可优选在25-40°C、优选28-36°C、尤其是30-34°C范围内的、如32°C左右的温度进行。在又一个实施方案中，本发明的方法期间还存在蛋白酶。在一个实施方案中，在步骤i)中的酶处理期间或在同时酶处理和发酵期间添加所述蛋白酶。添加所述蛋白酶可以是为了在发酵期间使发酵生物(尤其是酵母)抗絮凝。鐘术语“发酵生物”指任何适合于在期望的发酵方法中使用的生物体。合适的发酵生物依照本发明能够发酵，即将优选DP"糖(如尤其是葡萄糖、果糖和麦芽糖)直接或间接转化成期望的发酵产物(如乙醇)。通常将发酵生物添加至醪液(mash)。发酵生物的例子包括真菌生物体，如酵母或丝状真菌。优选的酵母包括酵母属菌种，特别是酿酒酵母的菌株。商业上可得到的酵母包括例如REDSTAR/LesaffreEthanolRed(可由RedStar/Lesaffre,USA得至lj)、FALI(可由Fleischmann，sYeast,USA得到)、SUPERSTART(可由Alltech得到)、GERTSTRAND(可由GertStrandAB,Sweden得到)和FERMIOL(可由DSMSpecialties得到)。优选用于乙醇生产的酵母包括例如毕赤酵母属(Pichia)和酵母属。依照本发明优选的酵母是酵母属菌种，特别是酿酒酵母或面包酵母(bakersyeast)。Mi^本发明的方法可任选包括回收发酵产物(如乙醇)；从此，可以将发酵产物(例如乙醇)与发酵材料分开并纯化。发酵后，可以蒸馏醪液以提取例如乙醇。通过本发明的方法能获得纯度高至例如约96vol.%的乙醇。如此，在一个实施方案中，步骤ii)中的发酵和蒸馏步骤可以同时和/或分开/依次进行；任选然后是一个或多个加工步骤以进一步精炼发酵产物(例如乙醇)。酶a-淀粉酶依照本发明，在本发明的方法中可使用任何a-淀粉酶。优选的a-淀粉酶是微生物的，如细菌或真菌来源的。在一个实施方案中，优选的a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶，例如真菌酸性a-淀粉酶或细菌酸性a-淀粉酶。术语“酸性a-淀粉酶”指如下的a-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在本发明的方法中使用时在3-7、优选3.5-6、或更优选4_5范围内的PH具有最佳活性。细菌a-淀粉酶在一个实施方案中，所述a-淀粉酶是芽孢杆菌属(Bacillus)来源的。芽孢杆菌属a-淀粉酶可优选源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株，但是也可以源自其它芽孢杆菌属菌株。所涵盖的a-淀粉酶的具体例子包括W099/19467中SEQIDNO:4所示地衣芽孢杆菌a-淀粉酶、TO99/19467中SEQIDNO:5所示解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶和W099/19467中SEQIDNO:3所示嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶(通过提述将所有序列并入本文)。在本发明的一个实施方案中，所述a-淀粉酶可以是与W099/19467中SEQIDNO:1、2或3所示任何序列具有至少60%、优选至少70%、更优选至少80%、甚至更优选至少90%、如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性程度的酶。芽孢杆菌属a-淀粉酶还可以是变体和/或杂合物，尤其是W096/23873；W096/23874；W097/41213；W099/19467；W000/60059；和W002/10355任一中所记载的(通过提述将所有文件并入本文)。具体涵盖的淀粉酶变体是美国专利No.6，093，562;6，297，038；或6，187，576中所披露的(通过提述并入本文)，而且包括在位置R179至G182中删除一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶(BSGa-淀粉酶)变体，优选W01996/023873中披露的双重删除-参见例如第20页第1_10行(通过提述并入本文)，优选对应于与W099/19467中披露的SEQIDNO:3所示野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比的A(181-182)或使用W099/19467中的SEQIDNO:3的编号删除氨基酸R179和G180(通过提述将该参考文献并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属a-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶，与W099/19467中披露的SEQIDNO3所示野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比，其具有与A(181-182)对应的双重删除且进一步包含N193F取代(也称作I181*+G182*+N193F)。细菌杂合a-淀粉酶具体涵盖的杂合a-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的445个C端氨基酸残基(W099/19467的SEQIDNO4所示)和源自解淀粉芽孢杆菌的a-淀粉酶的37个N端氨基酸残基(W099/19467的SEQIDNO5所示)，其中具有下列取代中的一个或多个(尤其所有):G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用TO99/19467的SEQIDNO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选具有一个或多个下列突变(或其它芽孢杆菌属a-淀粉酶主链中的相应突变):H154Y，A181T，N190F,A209V和Q264S和/或位置176和179之间缺失两个残基、优选缺失E178和G179(使用W099/19467的SEQIDNO:5编号方式)的变体。可以以本领域公知的浓度添加细菌a-淀粉酶。当以KNU单位(在下文“材料和方法”部分中描述)测量时，a-淀粉酶活性优选在0.5-50KNU/L发酵培养基、如1-25KNU/L发酵培养基、或更优选2-10KNU/L发酵培养基的范围内。真菌a-淀粉酶真菌a-淀粉酶包括源自曲霉属(Aspergillus)的菌株，如源自米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)禾口川地曲霉(Aspergi1luskawachii)的菌株的a-淀粉酶。优选的酸性真菌a-淀粉酶包括Fimgamyl样a-淀粉酶，其是源自曲霉属、优选米曲霉的菌株。依照本发明，术语“Fungamyl样a-淀粉酶”指与W096/23874中SEQIDNO10所示氨基酸序列的成熟部分展现出高度同一性，即至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、甚至至少99%或甚至100%同一性的a-淀粉酶。其它优选的酸性a-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选的实施方案中，所述酸性真菌a-淀粉酶是来自黑曲霉的，在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主登录号P56271下披露为“AMYAASPNG”且记载于W089/01969(实施例3)。一种源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌a"淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S，Denmark得到)。其它涵盖的野生型a-淀粉酶包括那些源自根毛霉属(Rhizomucor)和亚灰树花菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178，通过提述并入)或大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)的菌株。在一个优选的实施方案中，所述a-淀粉酶源自川地曲霉且披露于Kaneko等J.Ferment.Bioeng.81292-298(1996)"Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablealpha-amylasefromAspergilluskawachii"；并进一步作为EMBL:#AB008370披露。所述真菌a-淀粉酶还可以是包含淀粉结合域(SBD)和a-淀粉酶催化域的野生型酶(即非杂合)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型a-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。真菌杂合a-淀粉酶在一个优选的实施方案中，所述真菌酸性a_淀粉酶是杂合a-淀粉酶。真菌杂合a-淀粉酶的优选例子包括W02005/003311或美国专利发明者埃德·M·博丁,小亚多托·德阿拉梅达,维维安·佩雷拉德索扎,费边·B·奥默罗德申请人:诺维信公司;诺维信北美公司