来自蓖麻植物的种子优选性基因启动子的制作方法

专利名称：来自蓖麻植物的种子优选性基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够驱动其它核苷酸序列表达的核苷酸序列。
背景技术：
关于产生重组植物的一项重要考虑是使用在驱动转基因表达方面展现出合适活 性的基因启动子。启动子不仅能控制基因表达的水平，而且还能控制表达的时机和组织特 异性。有兴趣开发可以用于生产具有特定工业效用的脂肪酸的工业含油种子作物。蓖麻 植物(蓖麻(Ricinus communis))由于其在蓖麻油方面的长期种植历史而成为在这点上特 别感兴趣的。因此，在产生蓖麻和其它植物的转基因品种中使用的来自蓖麻的启动子会是 本领域中的一项进步。发明概述本发明的例示性实施方案包括包含如下的分离的核苷酸序列的核苷酸序列、载 体、细胞、植物、和/或种子，所述分离的核苷酸序列包含与SEQ IDNO :9或SEQ ID N0:10的 序列具有至少约90%同源性的核苷酸序列。本发明的别的例示性实施方案包括包含与如下的分离的核苷酸序列可操作连接 的感兴趣核苷酸序列的核苷酸序列、载体、细胞、植物、和/或种子，所述分离的核苷酸序列 包含与SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10的序列具有至少约90%同源性的核苷酸序列。本发明的别的例示性实施方案包括一种促进由感兴趣的核苷酸序列编码的分子 表达的方法，该方法包括将权利要求1的分离的核苷酸序列可操作连接至所述感兴趣的 核苷酸序列。本发明的别的例示性实施方案包括一种在细胞中生成由感兴趣核苷酸序列编码 的分子的方法，该方法包括将权利要求1的分离的核苷酸序列可操作连接至所述感兴趣 的核苷酸序列；向所述细胞提供所述可操作连接的核苷酸序列；并表达所述感兴趣的核苷 酸序列。本发明的别的例示性实施方案包括一种在细胞中调控靶物表达的方法，该方法包 括提供感兴趣的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够在细胞中调控所述靶物表达 的反义寡核苷酸或siRNA ；将权利要求1的分离的核苷酸序列可操作连接至所述感兴趣的 核苷酸序列；向所述细胞提供所述可操作连接的核苷酸序列；并表达所述感兴趣的核苷酸 序列。
附图简述

图1图示性描绘了用于在全植物中测试蓖麻油质蛋白和54-SSP启动子的植物二 元表达载体。图2A、图2B、和图2C是CopGFP在来自多种组织的提取物中的表达的图示，所述多 种组织自用PD0W2771 (54-SSP启动子)转化的T2拟南芥植物分离。图2A描述了自6种不 同Tl系产生的T2植物的CopGFP表达结果均值(+/_标准偏差)。对于每种T2系，左侧柱 形对应于叶表达，中间柱形对应于发育中的长角果表达，而右侧柱形对应于成熟的种子表 达。图2B相对于叶中的GFP表达描绘了多种组织中的CopGFP表达。对于每种T2系，左侧 柱形对应于叶叶表达，中间柱形对应于发育中的长角果叶表达，而右侧柱形对应于成熟 的种子叶表达。图2C描绘了各个T2系中的CopGF表达。RFU =相对荧光单位；η =自每 种Tl系检查的Τ2植株的数目。图3Α、图3Β、和图3C是CopGFP在来自多种组织的提取物中的表达的图示，所述多 种组织自用pD0W2772(油质蛋白启动子)转化的Τ2拟南芥植物分离。图3A描述了自7种 不同Tl系产生的T2植物的CopGFP表达结果均值(+/_标准偏差)。对于每种T2系，左侧 柱形对应于叶表达，中间柱形对应于发育中的长角果表达，而右侧柱形对应于成熟的种子 表达。图3B相对于叶中的GFP表达描绘了多种组织中的CopGFP表达。对于每种T2系，左 侧柱形对应于叶叶表达，中间柱形对应于发育中的长角果叶表达，而右侧柱形对应于成 熟的种子叶表达。图3C描绘了各个T2系中的CopGF表达。RFU =相对荧光单位；η =自 每种Tl系检查的Τ2植株的数目。图4是拟南芥中的脂肪酸生成的示意图。发明详述本发明涉及能够驱动其它核苷酸序列表达的核苷酸序列。本发明的一个方面提供 了一种分离的核苷酸序列，其包含与选自SEQ ID NO 9和SEQ IDNO 10的核苷酸序列具有 至少约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约 95%同一性的核苷酸序列。在本发明的进一步的方面，此类序列能够充当启动子。本发明的别的方面提供了包含如下的分离的核苷酸序列的载体，所述分离的核苷 酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少 约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性。本发明的别的方面提供了包含如下的分离的核苷酸序列的细胞，所述分离的核苷 酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少 约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性。本发明的别的方面提供了含有包含如下的分离的核苷酸序列的载体的细胞，所述 分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少约60% 同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一 性。正如本领域普通技术人员会显而易见的是，细胞可以是能够包含核苷酸序列和/或载 体的任何种类的细胞。依照本发明有用的细胞的例子包括但不限于真核细胞、原核细胞、动 物细胞、植物细胞、细菌细胞、种系细胞、种子细胞、拟南芥(Arabidopsis sp.)细胞、向日葵 细胞、棉细胞、油菜籽细胞、玉蜀黍细胞、棕榈细胞、烟草细胞、花生细胞、大豆细胞、和蓖麻 (Ricinus sp.)细胞。
本发明的别的方面提供了包含如下的分离的核苷酸序列的植物，所述分离的核苷 酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少约 70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性。依照本发明有 用的植物的例子包括但不限于向日葵、棉、油菜籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生、大豆、拟南芥、 和蓖麻。本发明的别的方面提供了包含如下的分离的核苷酸序列的种子，所述分离的核苷 酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少 约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性。依照本发明 有用的种子的例子包括但不限于来自向日葵、棉、油菜籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生、大豆、 拟南芥、和蓖麻的种子。本发明的别的方面提供了与如下的分离的核苷酸序列可操作连接的感兴趣的核 苷酸序列，所述分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10的核苷酸序列具有 至少约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约 95%同一性。本发明的别的方面提供了包含与如下的分离的核苷酸序列可操作连接的感兴趣 的核苷酸序列的载体，所述分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核苷 酸序列具有至少约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一 性、或至少约95%同一性。本发明的别的方面提供了包含与如下的分离的核苷酸序列可操作连接的感兴趣 的核苷酸序列的细胞，所述分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核苷 酸序列具有至少约60 %同一性、至少约70 %同一性、至少约80 %同一性、至少约90 %同一 性、或至少约95%同一性。本发明的别的方面提供了含有包含与如下的分离的核苷酸序列可操作连接的感 兴趣核苷酸序列的载体的细胞，所述分离的核苷酸序列与选自SEQID NO :9和SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约 90%同一性、或至少约95%同一性。正如本领域普通技术人员会显而易见的是，细胞可以是 能够包含核苷酸序列和/或载体的任何种类的细胞。依照本发明有用的细胞的例子包括但 不限于真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、种系细胞、种子细胞、向日葵细 胞、棉细胞、油菜籽细胞、玉蜀黍细胞、棕榈细胞、烟草细胞、花生细胞、大豆细胞、拟南芥细 胞、和蓖麻细胞。本发明的别的方面提供了包含与如下的分离的核苷酸序列可操作连接的感兴趣 的核苷酸序列的植物，所述分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核 苷酸序列具有至少约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同 一性、或至少约95%同一性。依照本发明有用的植物的例子包括但不限于向日葵、棉、油菜 籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生、大豆、拟南芥、和蓖麻。本发明的别的方面提供了包含与如下的分离的核苷酸序列可操作连接的感兴趣 核苷酸序列的种子，所述分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10的核苷 酸序列具有至少约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一 性、或至少约95%同一性。依照本发明有用的种子的例子包括但不限于来自向日葵、棉、油菜籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生、大豆、拟南芥、和蓖麻的种子。正如本领域普通技术人员会显而易见的是，感兴趣的核苷酸序列可以是希望表达 的任何核苷酸序列。感兴趣的核苷酸序列的例子包括但不限于编码蛋白质、核酶、反义RNA、 siRNA, RNAi分子、标志物、报告物、酶、信号传导分子、牵涉脂肪酸合成、降解、贮存、和/或 调节的蛋白质、靶向编码牵涉脂肪酸合成、降解、贮存、和/或调节的蛋白质的RNA的反义 RNA、和靶向编码牵涉脂肪酸合成、降解、贮存、和/或调节的蛋白质的RNA的siRNA和/或 RNAi分子的核苷酸序列。本发明的别的方面提供了表达感兴趣的核苷酸序列的方法。此类方法的一个例子 包括将感兴趣的核苷酸序列可操作连接至如下的分离的核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80% 同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性；并容许感兴趣的核苷酸序列进行表达。 正如本领域普通技术人员会显而易见的是，容许感兴趣的核苷酸序列进行表达一般涉及给 可操作连接的核苷酸序列提供或将可操作连接的核苷酸序列提供至容许感兴趣的核苷酸 序列表达的环境。容许感兴趣的核苷酸序列表达的环境的例子一般是本领域已知的，包括 但不限于至少一种dNTP和聚合酶的任何环境，诸如但不限于体外转录试剂盒、PCR反应、细 胞、真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、种系细胞、种子细胞、向日葵细胞、 棉细胞、油菜籽细胞、玉蜀黍细胞、棕榈细胞、烟草细胞、花生细胞、大豆细胞、拟南芥细胞、 和蓖麻细胞。正如本领域普通技术人员应当领会的，可以使用本领域已知的任何规程将 可操作连接的核苷酸序列提供至容许表达的环境。此类方法的例子包括但不限于使 用例如Lipofectin或Lipofectamine进行的转染、土壤杆菌介导的导入(参见例如 Chistou (1996)，Trends Plant Sci. ，1 423~432 ；及 Hooykaas 禾口 Schilperoot (1992)， Plant Mol. Bio.，19 15-38)、浸花(floral dip)(参见例如 Clough 和 Bent (1998)，Plant J.，16 (6) 735-743)、电穿孔(参见例如 Shigekawa 和 Dower (1988)，Biotechniques, 6 742 ；Miller 等(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 856-860 ；及 Powell 等(1988)， Appl. Environ. Microbiol.，54 655-660)；直接的 DNA 摄取机制(参见例如 Mandel 和 Higa(1972),J. Mol. Biol. ,53 159-162 ；Dityatkin 等(1972)，Biochimica et Biophysica Acta, 281 319-323 ；Wigler 等(1979)，Cell, 16 77 ；及 Uchimiya 等(1982)，于:Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara(编)，Jap. Assoc, for Plant TissueCulture，Tokyo，第 507 页-第 508 页)；融合机制(参见例如 Uchidaz 等(1980)， 于Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga 等(编) Wistar Symposium Series, 1 169-185)；感染剂(参见 Fraley 等(1986)，CRC Crit. Rev. Plant Sci.，4:1-46)；和 Anderson (1984)，Science, 226 401-409)；显微注射机制(参见 例如Crossway等(1986)，Mol. Gen. Genet.，202 179-185)；和高速度射弹机制(参见例如 Miller, Schuchardt, Skokut 禾口 Gould(Dow ChemicalCompany)的 EPO 0405 696)。本发明的具体的实施方案提供了以种子优选性方式表达感兴趣的核苷酸序列的 方法。此类方法的一个例子包括将感兴趣的核苷酸序列可操作连接至如下的分离的核苷 酸序列，其与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至 少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性；向种子细
7胞直接或间接提供所述可操作连接的核苷酸序列；并容许感兴趣的核苷酸序列表达。本发明的其它实施方案提供了降低靶蛋白质水平的方法。此类方法的一个例子包 括提供编码能够结合编码靶蛋白质的RNA的反义RNA和/或siRNA的核苷酸序列；将编 码反义RNA和/或siRNA的核苷酸序列可操作连接至如下的分离的核苷酸序列，其与选自 SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少约70%同一性、 至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性；并容许编码反义RNA和/或 siRNA的核苷酸序列表达。本发明的其它方面提供了以种子优选性方式降低靶蛋白质的水平的方法。此类方 法的一个例子包括提供编码能够结合编码靶蛋白质的RNA的反义RNA和/或siRNA的核 苷酸序列；将编码反义RNA和/或siRNA的核苷酸序列可操作连接至如下的分离的核苷酸 序列，其与选自SEQ ID NO :9和SEQ IDNO :10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少 约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性；向种子细胞 直接或间接提供所述可操作连接的核苷酸序列；并容许编码反义RNA和/或siRNA的核苷 酸序列表达。本发明的别的方面提供了改变种子的脂肪酸含量的方法。此类方法的一个例子包 括将编码牵涉脂肪酸合成、降解、贮存、和/或调节的蛋白质的核苷酸序列可操作连接至 如下的分离的核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的核苷酸序列具有至少 约60%同一性、至少约70%同一性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95% 同一性；向种子细胞直接或间接提供所述可操作连接的核苷酸序列；并容许感兴趣的核苷 酸序列表达。牵涉脂肪酸合成、降解、贮存、和/或调节的蛋白质的例子包括但不限于ACC 酶、FAS、KAS I、KAS II、KAS III、Fad2、和 Fad3。改变种子的脂肪酸含量的方法的别的例子包括提供编码能够结合编码牵涉脂肪 酸合成、降解、贮存、和/或调节的蛋白质的RNA的反义RNA和/或siRNA的核苷酸序列；将 编码反义RNA和/或siRNA的核苷酸序列可操作连接至如下的分离的核苷酸序列，其与选 自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少约60%同一性、至少约70%同一 性、至少约80%同一性、至少约90%同一性、或至少约95%同一性；向种子细胞直接或间接 提供所述可操作连接的核苷酸序列；并容许编码反义RNA和/或siRNA的核苷酸序列表达。如本文中所使用的，“启动子”指牵涉RNA聚合酶和其它蛋白质识别和结合以启动 转录的DNA区域，一般在转录起始位点上游。启动子可以包括增强子和阻抑物。如本文中所使用的，“可操作连接的”指核苷酸序列被连接以使得以其预期方式发 挥功能。“可操作连接的”序列可以或者不可以是直接邻接的。例如，与感兴趣的核苷酸序 列可操作连接的启动子可以以如下方式连接和定位，所述方式使得其能够驱动感兴趣的核 苷酸序列表达。
实施例本发明在以下实施例中进一步的描述，所述实施例作为例示提供，而并不意图以 任何方式限制本发明。实施例1启动子分离
经由随机cDNA测序方案来鉴定编码豆球蛋白样(“54-SSP”)和油质蛋白蛋白质 的基因，其中使用基于序列的与已知基因的同源性来实现基因注解。经由基于PCR的“基 因组步行”使用基因组Walker 试剂盒(ClontechLaboratories，Inc.)依照制造商的指令 来分离这些选定基因的启动子。在此技术中，首先将具有已知序列的短寡核苷酸接头分子 连接至已经用数种不同平端切割限制性酶消化过的蓖麻基因组DNA的末端上。使用退火至 接头分子的正向PCR引物和特异性退火至54-SSP或油质蛋白基因编码区内的DNA的反向 PCR引物来实施初次PCR反应。然后实施使用巢式引物进行的第二轮PCR，其也基于已知的 接头和基因特异性序列。使用此策略，分离选定编码序列上游的DNA序列，将其插入克隆载 体pCR2. ldnvitrogen Corp.)中，并对其测序。下文显示了此方法中所使用的引物。54-SSP 引物初次PCR反应引物接头引物1(正向引物)5，GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3，(SEQID NO 1)54-SSP 引物 B(反向引物)5，GAG AGC AGC GAA GAA GGC TGA ACCATA G 3，(SEQ ID NO 2)巢式PCR反应引物巢式接头(adaptor)引物2 (正向引物)5，ACT ATA GGG CAC GCG TGGT 3，(SEQ ID NO 3)54-SSP 引物 A(反向引物)5，GAG AGC CAT GGA AGA GAA CAA GTAGGAA 3，(SEQ ID NO 4)油质蛋白引物初次PCR反应引物接头引物1(正向引物)5，GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3，(SEQID NO 5)油质蛋白引物B(反向引物)5，ATA GGC TTG CAG AAT CAG AGC TTCTGG TTA 3，(SEQ ID NO 6)巢式PCR反应引物巢式接头引物2(正向引物)5，ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3，(SEQID NO 7)油质蛋白引物A(反向引物)5，GGT GAC TAA CAA CCG GTG ATTGTT GAT GCT 3，(SEQ ID NO 8)一旦测定以此方式获得的启动子片段的序列，便有可能生成别的PCR产物，其中 将特定的克隆位点建造入引物序列中以便于表达载体构建。54-SSP启动子的共有核苷酸序列(就在54-SSP起始密码子前的1124个碱基对) 可参见 SEQ ID NO :9ο油质蛋白启动子的共有核苷酸序列(就在油质蛋白起始密码子前的528个碱基 对)可参见SEQ ID NO=IO0应当注意，用于油质蛋白启动子测试的克隆具有PCR产生的序 列错误，其中第234位的T被A替换。实施例2启动子的测试经由使用报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在全植物(拟南芥 (Arabidopsisthaliana))中测试油质蛋白和54-SSP基因启动子的活性。构建供拟南芥转化用的二元载体，其具有的表达盒具有CopGFP基因(Evrogen)上游的油质蛋白或 54-SSP启动子，接着有花椰菜花叶病毒35S终止子区。图1中显示了下列载体的图谱 PD0W2771-54-SSP启动子可操作连接至CopGFP报告基因；和pD0W2772_油质蛋白启动子可 操作连接至CopGFP报告基因。通过浸花法转化拟南芥植物(Clough和 Bent (1998) Plant Journal 16 :735_743)。 二元载体含有膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)基因，其容许在除草剂草丁磷上选择转化体。为 了测定启动子是否主要在种子中有活性，自第一代(Tl)转化体收集某些组织，包括叶、发 育中的长角果、和成熟的种子。对这些组织测试CopGFP荧光，如下文所描述的。种植来自 Tl植株的种子以产生T2植株，也自其采集叶、发育中的长角果、和成熟的种子样品，并进行 分析。通过如下CopGFP测定法规程来分析组织样品CodGFP测定法在组织勻浆器中将组织样品在IX CCLR缓冲液(细胞培养物溶胞 缓冲液5X试剂(Promega Corp.，产品目录编号E153A)，其含有125mM具有H3PO4的Tris (pH 7. 8) UOmM CDTAUOmM DTT、50%甘油和5% Triton X-100)中碾碎1分钟。将样品放置 在干冰上，直至进一步使用。于4°C以14Κ χ g将提取物离心15分钟。将上清液流体转移 入另一管中，并用于进一步分析。将200 μ 1每种上清液放置在Costar 96孔平底微量滴 定板(Corning，Inc.，产品目录编号3915)中，并使用SpectraMax Gemini XS微板读板仪 (MolecularDevices, Inc.)来测量荧光。使用含有表达CopGFP的大肠杆菌菌株的培养物 作为标准。用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Biotechnology, Inc.；产品目录编号23225) 来测定组织提取物的蛋白质浓度。荧光表示为每mg蛋白质的荧光。一式两份实施所有实 验。图2和图3中呈现了这些研究的结果。对于54-SSP启动子和油质蛋白启动子两 者，在种子中比在营养叶材料中有多得多的活性。发育中的长角果含有营养组织和发育中 的种子两者，并且这些组织中的启动子活性介于叶组织和成熟种子的启动子活性之间。使用荧光素酶基因作为报告基因在拟南芥植物中实施对油质蛋白启动子的别的 测试。这些实验的结果也指明油质蛋白启动子在种子中的活性较高。实施例3用于调控脂肪酸合成基因的载体如实施例2中所概述的那样创建用于调控脂肪酸合成蛋白的载体。创建54-SSP 启动子控制下的编码脂肪酸合成蛋白的下列载体pSSP:Fad2-54-SSP启动子可操作连接至Fad2基因；pSSP:Fad3-54-SSP启动子可操作连接至Fad3基因；和pSSP:KASII-54-SSP启动子可操作连接至KASII基因。创建油质蛋白启动子控制下的编码脂肪酸合成蛋白的下列载体p01eo:Fad2-油质蛋白启动子可操作连接至Fad2基因；p01eo:Fad3-油质蛋白启动子可操作连接至Fad3基因；和pOleo:KASII-油质蛋白启动子可操作连接至KASII基因。创建54-SSP启动子控制下的编码针对脂肪酸合成蛋白的反义分子的下列载体pSSP:Fad2:AS-54-SSP启动子可操作连接至针对Fad2 RNA的反义物；pSSP:Fad3:AS-54-SSP启动子可操作连接至针对Fad3 RNA的反义物；
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pSSPKASII :AS-54_SSP启动子可操作连接至针对KASII RNA的反义物。创建油质蛋白启动子控制下的编码针对脂肪酸合成蛋白的反义分子的下列载 体p01eo:Fad2:AS-油质蛋白启动子可操作连接至针对Fad2 RNA的反义物；p01eo:Fad3:AS-油质蛋白启动子可操作连接至针对Fad3 RNA的反义物；和p01eo:KASII:AS-油质蛋白启动子可操作连接至针对KASII RNA的反义物。创建编码针对脂肪酸合成蛋白的SiRNA分子的载体。可以设计SiRNA分子以表 达如下的RNA分子，所述RNA分子与自身杂交以形成包含单链环区和碱基配对茎的发夹结 构。碱基配对的茎区包含对应于整个或部分编码就是要抑制其表达的基因的内源信使RNA 的有义序列，和与有义序列完全或部分互补的反义序列。如此，分子的碱基配对茎区一般决 定RNA干扰的特异性。这些发夹RNA分子在抑制内源基因表达方面是高度有效的，而且它 们诱导的RNA干扰被后续世代继承。参见例如，Chuang和Meyerowitz (2000)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97 :5985_5990 ；Stoutjesdijk 等(2002)Plant Physiol. 129 :1723-1731 ； 及 Waterhouse 和 Helliwell (2003)Nat. Rev. Genet. 5 :29-38。用于使用 hpRNA 干扰来抑 制或沉默基因表达的方法记载于例如Chuang和Meyerowitz (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 5985-5990 ；Stoutjesdijk 等(2002)Plant Physiol. 129 :1723_1731 ；Waterhouse 和 Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 5 :29_38 ；Pandolfini 等 BMC Biotechnology 3 :7，及 美国专利公开文本No. 20030175965。关于发夹RNA构建体在体内沉默基因表达的功效的瞬 时测定法已经记载于 Panstruga 等(2003)Mol. Biol. Rep. 30 135-150。创建在54-SSP启动子控制下的编码针对脂肪酸合成蛋白的SiRNA分子的下列载 体pSSP:Fad2:si-54_SSP 启动子可操作连接至针对 Fad2 RNA 的 siRNA ；pSSP:Fad3: si-54-SSP启动子可操作连接至针对Fad3 RNA的siRNA ；和pSSPKASII si-54-SSP 启动子可操作连接至针对 KASII RNA 的 siRNA。创建在油质蛋白启动子控制下的编码针对脂肪酸合成蛋白的反义分子的下列载 体p01eo:Fad2:si-油质蛋白启动子可操作连接至针对Fad2 RNA的siRNA ；p01eo:Fad3:si-油质蛋白启动子可操作连接至针对Fad3 RNA的siRNA ；禾口p01eo:KASII: si-油质蛋白启动子可操作连接至针对KASII RNA的siRNA。实施例4拟南芥和蓖麻种植和转化在正常的条件下种植拟南芥和蓖麻。通过电穿孔将载体导入根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 pMP90中，并用于通过浸花法转化拟南芥 和蓖麻植物(N. Bechtold, J. Ellis,和 G. Pelletier (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316， 1194-1198)。还使用高速度颗粒来导入载体，并在初始开花后约5天实施感染原转化 (infectious agent transformation)。实施例5测定拟南芥和蓖麻种子中的脂肪酸含量脂肪酸分析使种子甲基化(1ml IN HC1、甲醇，Supelco，80°C达1小时)，用己烷提取，并进行三甲基硅烷化(trimethylsilylate) (100 μ 1 BSTFA-TMCS (二 (三甲硅烷基) 三氟乙酰胺三甲基硅烷)，3叩61(0，901达45分钟)。通过蒸发来除去BSTFA-TMCS，并将 样品在乙烷中重悬。在装备有5973质量选择检测器(GC/MS)和Supelco SP-2340氰基毛 细管柱(60m χ 250ym χ 0. 25 μ m)的Hewlett-Packard 6890气体层析仪上分析样品。将 注射器保持在225°C，炉温度有所变化(以15°C /分钟的100-240°C，接着是240°C达5分 钟)，并且氦流速为1. Iml/分钟。基于洗脱时间对真实标准品来实施峰身份的分配，并基于 其质谱来确认。使用Hewlett-Packard Chemstation软件来实施定量。实施例6调控拟南芥和蓖麻中的脂肪酸合成比较三种调控经由Fad2进行脂肪酸合成的方法(基因表达、反义表达、siRNA表 达)。选择三种基因来比较基因阻抑的三种方法(12-去饱和酶FAD2和15-去饱和酶FAD3， 因为它们容易进行评分；而且FAD2由于其之前在评估基因表达降低方面已经使用过)，以 及β _酮脂酰-ACP合酶(KAS) II。图4中描绘了这些酶与脂肪酸合成之间的关系。选择种子进行分析，因为它们容许通过气相层析对其组成进行可再现的定量分 析，而且因为它们容许对峰进行质谱分析以定性确认峰作为特定脂肪酸的分配。使用学生 (Student)T检验将显著性归入均值间的差额(基于每个均值10个或更多个样品)。实施例7对KASII表达的调控KASII在质体中将16C延长至18C脂肪酸。对于KASII，比较16:0加16:1脂肪酸 (KAS11的底物)的水平与其产物18:0和18:1加上代谢物18:2和18:3的水平。将野生型拟南芥和蓖麻与用pSSP:KASII、p01eo:KASII、pSSP:KASII :AS、 p01eo:KASII:AS、pSSP:KASII: si、或 p01eo:KASII: si 转化的品系进行比较。那些包 含pSSP:KASII和p01eO:KASII载体的植物显示160脂肪酸的显著降低及C18和高级 脂肪酸的相应升高。那些包含 pSSP:KASII:AS、p01eo:KASII:AS、pSSP:KASII si、和 p01eo:KASII:si载体的植物显示16:0脂肪酸的显著升高及C18和高级脂肪酸的相应降低。实施例8对FAD2表达的调控对于FAD2，比较18 1脂肪酸(FAD2的底物)的水平与其产物18 2和代谢物18 3 的水平。为了分析，总计18 2与18 3以获得已经被FAD2去饱和的总脂肪酸比例。将野生型拟南芥和蓖麻与用pSSP:FAD2、p01eo:FAD2、pSSP:FAD2:AS、 p01eo:FAD2:AS、pSSP:FAD2: si、或p01eo:FAD2: si转化的品系进行比较。那些包含 pSSP:FAD2和p01eo:FAD2载体的植物显示18:2和18:3脂肪酸的显著升高。那些包含 pSSP:FAD2:AS、p01eo:FAD2:AS、pSSP:FAD2:si、和 p01eo:FAD2: si 载体的植物显示 18:2 和 18:3脂肪酸的显著降低及低级脂肪酸的相应升高。实施例9对FAD3表达的调控对于FAD3，比较18:1加上18:2脂肪酸(18:2是FAD3的底物)的水平与其产物 18:3的水平。将野生型拟南芥和蓖麻与用pSSP:FAD3、p01eo:FAD3、pSSP:FAD3:AS、
12p01eo:FAD3:AS、pSSP:FAD3: si、或 p01eo:FAD3: si 转化的品系进行比较。那些包 含pSSP:FAD3和p01eo:FAD3载体的植物显示183脂肪酸的显著升高。那些包含 pSSP:FAD3:AS、p01eo:FAD3:AS、pSSP:FAD3:si、和 p01eo:FAD3: si 载体的植物显示 18:3 脂 肪酸的显著降低及低级脂肪酸的相应升高。 虽然本发明已经在某些例示性实施方案中进行过描述，本发明可以在本公开内容 的精神和范围内进一步进行修饰。因此，本申请意图覆盖使用其一般原理的本发明的任何 变型、用途、或改编。此外，本申请意图覆盖诸如在本发明所属技术领域的已知或习惯实践 内，而且落入所附权利要求书的限制内的本公开内容的偏离。
权利要求
一种分离的核苷酸序列，其包含与SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的序列具有至少约90％同源性的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的核苷酸序列，其进一步包含与如下核苷酸序列可操作连接的感 兴趣核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO 9或SEQ IDN0 10的序列具有至少约90% 的同源性。
3.权利要求2的分离的核苷酸序列，其中所述感兴趣核苷酸序列编码选自下组的分 子蛋白质、反义寡核苷酸、和siRNA。
4.一种载体，其包含权利要求1的分离的核苷酸序列。
5.依照权利要求4的载体，其进一步包含与如下核苷酸序列可操作连接的感兴趣核苷 酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10的序列具有至少约90%的同源性。
6.权利要求4的载体，其中所述核苷酸序列编码选自下组的分子蛋白质、反义寡核苷 酸、禾P siRNA。
7.依照权利要求5的载体，其进一步包含选择标志。
8.依照权利要求7的载体，其中所述选择标志是膦丝菌素乙酰转移酶基因。
9.一种细胞，其包含权利要求1的分离的核苷酸序列。
10.权利要求9的细胞，其中在所述细胞的基因组中稳定整合权利要求1的分离的核苷 酸序列。
11.依照权利要求9的细胞，其中所述细胞选自下组真核、原核、动物、植物、种系、种 子、拟南芥、向日葵、棉细胞、油菜籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生、大豆、和蓖麻的细胞。
12.权利要求9的细胞，其中所述细胞包含权利要求4的载体。
13.一种植物，其包含权利要求1的分离的核苷酸序列。
14.依照权利要求13的植物，其中所述植物选自下组拟南芥、向日葵、棉细胞、油菜 籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生、大豆、和蓖麻。
15.依照权利要求13的植物，其中所述植物包含权利要求4的载体。
16.依照权利要求13的植物，其中所述植物包含权利要求9的细胞。
17.—种种子，其包含权利要求1的分离的核苷酸序列。
18.依照权利要求17的种子，其中所述种子选自下组拟南芥、向日葵、棉细胞、油菜 籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生、大豆、和蓖麻种子。
19.依照权利要求17的种子，其中所述植物包含权利要求4的载体。
20.依照权利要求17的种子，其中所述植物包含权利要求9的细胞。
21.一种促进由感兴趣的核苷酸序列编码的分子表达的方法，该方法包括将权利要 求1的分离的核苷酸序列可操作连接至所述感兴趣的核苷酸序列。
22.依照权利要求21的方法，其中以种子优选性方式促进所述由感兴趣的核苷酸序列 编码的分子表达。
23.权利要求21的方法，其中所述由感兴趣的核苷酸序列编码的分子选自下组蛋白 质、反义寡核苷酸、和siRNA。
24.一种在细胞中生成由感兴趣核苷酸序列编码的分子的方法，该方法包括将权利要求1的分离的核苷酸序列可操作连接至所述感兴趣的核苷酸序列；并向所述细胞提供所述可操作连接的核苷酸序列；表达所述感兴趣的核苷酸序列。
25.权利要求24的方法，其中所述由感兴趣的核苷酸序列编码的分子选自下组蛋白 质、反义寡核苷酸、和siRNA。
26.—种在细胞中调控靶物表达的方法，该方法包括提供感兴趣的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够在细胞中调控所述靶物表达 的反义寡核苷酸或siRNA ；将权利要求1的分离的核苷酸序列可操作连接至所述感兴趣的核苷酸序列；向所述细胞提供所述可操作连接的核苷酸序列；并表达所述感兴趣的核苷酸序列。
27.依照权利要求26的方法，其中所述细胞选自下组原核、真核、细菌、土壤杆菌、酵 母、植物、哺乳动物、和人细胞。
28.依照权利要求26的方法，其中所述植物细胞选自下组蓖麻属、拟南芥属、向日葵、 棉、油菜籽、玉蜀黍、棕榈、烟草、花生或大豆细胞。
29.依照权利要求26的方法，其中所述靶物是基因、寡核苷酸序列、和/或蛋白质。
30.依照权利要求26的方法，其中所述靶物选自牵涉脂肪酸合成、降解、贮存、和/或调 节的蛋白质。
31.依照权利要求26的方法，其中所述靶物选自下组ACC酶、FAS、KASI,KAS II,KAS III、Fad2、和 Fad3。
32.权利要求13的植物的遗传后代。全文摘要
包含与SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的序列具有至少约90％同源性的核苷酸序列的核苷酸序列。公开了与如下核苷酸序列可操作连接的感兴趣核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的序列具有至少约90％的同源性。还公开了载体、调节靶物表达的方法、提供包含所述核苷酸序列的细胞、植物、和种子的方法。
文档编号C12N15/82GK101896609SQ200880119861
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月3日 优先权日2007年12月4日
发明者保罗·G·罗斯勒, 拉达·拉索乔瓦, 文森特·D·李 申请人:陶氏环球技术公司