一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞及其制备方法

专利名称：一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种有蹄类哺乳动物成体细胞重编程为类似 人胚胎干细胞的可诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell，简称iPS细胞)及 其制备方法。
背景技术：
二十多年前，人类建立了小鼠胚胎干细胞系(Evans & Kanfman. (1981)，Nature 292，154-156)，上世纪90年代，灵长类动物的胚胎干细胞系也得以确立(Thomson，et al. (1995)，Proc. Natl. Acad. Sci. 92，7844-7848)，大鼠胚胎干细胞系在经历了近 20 年 研究，从其多能性基因Oct-4难以持续表达(Buehr, et al. (2003), Biol. Repro. 68, 222-229)，到注射囊胚的ES-Iike细胞只能分化成胚外组织(Demers, et al. (2007)， Cloning and stem cells 9，512-522)，到最近的真正具有体内体外分化能力和生殖系嵌 入能力的大鼠胚胎干细胞的建系，即嵌合体大鼠的诞生(Buehr, et al. (2008)，Cell 135， 1287-1298 ;Li，et al. (2008), Cell 135，1299-1310)，足见各物种胚胎干细胞系的建立，其 重大科学意义和人们建系势在必行的决心。人工饲养的有蹄类哺乳动物，如猪、牛、羊等，其胚胎干细胞建系后，可由该细胞 系建立人类多种遗传性疾病的动物模型；由于这类有蹄类动物其脏器在形态和功能上更接 近于人类，且这些动物寿命较长，和目前使用广泛的小鼠相比，更利于人类进行透彻深入有 针对性的科学实验，对这些动物的胚胎干细胞进行基因操作，即运用基因工程的手段有望 实现人类的器官移植治疗，并且将成为人类干细胞(包括可诱导的多潜能干细胞，iPS细 胞)定向分化得到人体器官的另一个良好选择；此外，对这类动物的胚胎干细胞系实施基 因操作，还可对其产出品，如肉类，奶制品等进行基因改良，获得更好的产品以满足人类生 活所需，同时还可提高这类动物自身的抗病能力，在生物制药等方面也大有益处。在多种待选的物种中，猪，因其长期在制药领域中作为重要的实验动物模型，并且 其器官在形态学和功能学上更接近于人类，同时也是最早用于人类器官移植的动物而脱颖 而出。羊，可作为以下几种疾病的良好动物模型，包括多功能障碍综合征(MODS)、颈椎病、全 身炎症反应综合征(SIRS)、胎儿宫内介入手术等，此外借助羊的胚胎干细胞进行基因操作， 可对其产出品，如羊肉，羊奶，羊毛等进行基因改良，提高人类生活质量。目前为止，人类尚未建立有蹄类哺乳动物的胚胎干细胞系，并且对这类动物的ES cell在其形态，表面marker，多潜能性等方面也鲜见文献报道，科学界对于该领域的诸多 争议又进一步阻碍了这类动物胚胎干细胞系的建立。

发明内容
本发明的首要目的在于，提供一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞。本发明的第二个目的在于，提供一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞的制备方 法。
本发明的第三个目的在于，提供一种用于导入有蹄类哺乳动物细胞的载体组合物根据本发明所述的有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞iPS的制备方法，包括步 骤A)构建携带转录因子的表达载体，所述转录因子选自0ct4、Sox2、c-Myc, Klf4, Lin28 和 Nanog ；B)将步骤A)中的转录因子以组合形式导入有蹄类哺乳动物细胞，挑选形态类似 胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到有蹄类哺乳 动物iPS细胞。根据本发明所述的方法，所述表达载体为含有所述转录因子的质粒。根据本发明所述的方法，所述转录因子导入形式为病毒、蛋白质、RNA或DNA。根据本发明所述的方法，所述表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒 载体。根据本发明所述的方法，所述有蹄类哺乳动物细胞选自有蹄类哺乳动物原代骨髓 间充质细胞或原代耳尖成纤维细胞。根据本发明所述的方法，所述转录因子的组合形式包括a)含有 0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4 ；或b)含有 0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28、Nanog。根据本发明所述的方法，所述步骤B)传代培养是将有蹄类哺乳动物iPS克隆按 1 5-20的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。根据本发明所述的方法，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细 胞。根据本发明所述的方法，还包括步骤C)有蹄类哺乳动物iPS细胞的干细胞多能性鉴定。根据本发明所述的方法，所述步骤C)包括检测以下指标1)碱性磷酸酶表达呈阳性；2)干细胞特异标记 Tra-l-60、Tra-l-81、Nanog、E_cadherin 和 Rex_l 表面抗原呈 阳性；3)自然分化形成胚状体后外胚层GFAP、Neurod或NFH基因表达呈阳性冲胚层 BMP4、Enolase、Renin 或 Myogenin 基因表达呈阳性；内胚层 a -anti-trypsin、AFP 或 DCN 基因表达呈阳性。根据本发明所述的方法，所述指标还包括4)0ct4基因的启动子区域被去甲基化；5)端粒酶活性比有蹄类哺乳动物成体细胞高。根据本发明所述的方法，所述有蹄类哺乳动物包括猪、羊或牛。根据本发明所述的用于导入有蹄类哺乳动物细胞的载体组合物，所述载体组合物 含有 0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog 转录因子。本发明有助于确立猪、羊、牛和其它有蹄类哺乳动物的ES细胞建系的最适培养条 件和方法；可由猪或羊iPS细胞系建立人类多种遗传性疾病的实验模型；定向分化猪的iPS 细胞获得形态和功能上接近于人类的猪的器官也将成为人类器官移植治疗的良好选择；此外，对猪或羊的iPS细胞实施基因操作，还可对其产出品，如猪肉、羊肉、羊奶、羊毛等进行 基因改良，获得更好的产品满足人类生活所需，同时还可提高有蹄类哺乳动物的抗病能力， 在生物制药等方面也将大有帮助。


图1是慢病毒载体LV-ef 1 a -IRES-EGFP结构图。图2是猪iPS细胞形态荧光镜检结果，其中A 转染PEF细胞后形成ES_like克隆 形态B :ES-like克隆的绿色荧光镜检结果C 转染BMC后形成非ES_like克隆形态D 非 ES-like克隆的绿色荧光镜检结果。图3是猪iPS细胞碱性磷酸酶检测阳性克隆统计结果。图4是羊iPS细胞形态荧光镜检结果，其中A 转染PEF细胞后形成ES_like克隆 形态B :ES-like克隆的绿色荧光镜检结果C 转染BMC细胞后形成非ES-like克隆形态D 非ES-like克隆的绿色荧光镜检结果。图5是羊iPS细胞碱性磷酸酶检测阳性克隆统计结果。图6是6-11号猪iPS细胞碱性磷酸酶活性检测，即AP染色的阳性结果。图7是Realtime PCR检测猪iPS细胞未分化Marker表达情况的电泳图，从左到右 泳道依次是猪耳尖成纤维细胞，猪骨髓间充质细胞，4-2号猪iPS细胞，6-11号iPS细胞， 阴性对照。图8是免疫荧光染色检测猪iPS细胞干细胞相关marker表达情况，其中A 猪iPS 细胞SSEA-1染色结果(蓝色为dapi染色，说明SSEA-1为阴性)，B 猪iPS细胞SSEA-3染 色结果，C 猪iPS细胞SSEA-4染色结果，D 猪iPS细胞Tra-1-60染色结果，E 猪iPS细胞 Tra-1-81染色结果，F 猪iPS细胞Nanog染色结果，G 猪iPS细胞Rex_l染色结果，H 猪 iPS细胞E-cadherin染色结果。图9是Realtime PCR检测猪iPS细胞内源基因表达水平，从上到下依次是0ct4， Nanog, Sox2。图10是猪iPS细胞重亚硫酸盐基因组测序分析结果，从左到右依次是猪骨髓间 充质细胞，猪耳尖成纤维细胞，4-2号猪iPS细胞，6-11号猪iPS细胞。图11是猪iPS细胞端粒酶活性检测，从左到右泳道依次是猪骨髓间充质细胞，猪 耳尖成纤维细胞，4-2号猪iPS细胞，6-11号猪iPS细胞，裂解液(阴性对照)；其中-表示 未进行热失活，+表示热失活。图12是Realtime PCR检测猪iPS细胞在体外向三个胚层的分化能力，从左到右 泳道依次是4-2号猪iPS细胞，6-11号猪iPS细胞，4-2号猪iPS细胞分化后的细胞，6-11 号猪iPS细胞分化后的细胞，阴性对照。图13是猪iPS细胞畸胎瘤形成情况，其中A 全图B 神经上皮(外胚层)C 软骨 (中胚层)D:肠样上皮(内胚层)。图14是Sf6_3号羊iPS细胞碱性磷酸酶活性检测，即AP染色的阳性结果。图15是Realtime PCR检测羊iPS细胞未分化Marker表达情况的电泳图，从左到 右泳道依次是羊耳尖成纤维细胞，Sf6-3号羊iPS细胞，Sf6-4号羊iPS细胞，Sf6-193号 羊iPS细胞，Sf4-3号羊iPS细胞，阴性对照。其中“Sf4”和“Sf6”分别指使用四种转录因
5子和六种转录因子。图16是免疫荧光染色检测羊iPS细胞干细胞相关marker表达情况，其中A 羊iPS 细胞SSEA-1染色结果，B 羊iPS细胞SSEA-3染色结果，C 羊iPS细胞SSEA-4染色结果， D 羊iPS细胞Tra-1-60染色结果，E 羊iPS细胞Tra_l_81染色结果，F 羊iPS细胞Nanog 染色结果，G 羊iPS细胞Rex-1染色结果，H 羊iPS细胞E-cadherin染色结果。图17是Realtime PCR检测羊iPS细胞在体外向三个胚层的分化能力，从左到右泳 道依次是4_3号羊iPS细胞，6-193号羊iPS细胞，4-3号羊iPS细胞分化后的细胞，6-193 号羊iPS细胞分化后的细胞，阴性对照。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验 指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，用到的培养基有人胚胎干细胞的培养基hES，其具体组成为79 %的D-MEM/F12培养液(购自 Invitrogen, 10330) ；20 % 的 Knockout SR(购自 Invitrogen，10828) ； ImM L-谷氨酸(购 自 Invitrogen, 25030) ；的非必须氨基酸(购自 Invitrogen, 11140050) ；0. ImM 巯 基乙醇(购自 Sigma, M7522) ； 10ug bFGF(购自 Invitrogen，13256-029)。猪、羊iPS细胞的培养基ES0，其具体组成为79%的D-MEM/F12培养液(购自 Invitrogen, 10330) ；20 % 的 Knockout SR(购自 Invitrogen，10828) ； ImM L-谷氨酸(购 自 Invitrogen, 25030) ；的非必须氨基酸(购自 Invitrogen, 11140050) ；0. ImM 巯 基乙醇(购自Sigma，M7522)。其它细胞，包括猪原代骨髓间充质细胞、猪原代耳尖成纤维细胞、羊原代骨髓间充 质细胞、羊原代耳尖成纤维细胞、293T细胞，小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的培养基，具体组 成为89%的D-MEM培养液(购自Invitrogen，11965) ；10%的胎牛血清(购自HyClone， SH30396. 03) ； ImM L-谷氨酸(购自Invitrogen，25030) ； 1 %的非必须氨基酸(购自 Invitrogen,11140050)。以下实施例中所使用的慢病毒载体LV-ef 1 a -IRES-EGFP购自Invitrogen公司， 其结构如图1所示，具有氨苄抗性。以下实施例中，通用的细胞培养产品均购自Invitrogen公司。以下实施例中，使用的抗体 SSEA-1、SSEA-3、SSEA_4 购自 Developmental Studies Hybridoma Bank、 Tra-l-60> Tra-1-81 _ 自 Chemicon international> CDH1 _ 自 ABCAM> Nanog 购自 R&D Systems、Rex_l 购自 Santa Cruz Biotechnology。实施例1、慢病毒载体的构建1. 1、从NCBI网站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)查询干细胞中特异表达或高 表达的特定基因(0ct4，Sox2, c-Myc，Klf4，Lin28，Nanog)的编码区，根据编码区序列设计 引物，并引入酶切位点，引物序列如表1所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。表 1
6
注引物序列中大写的字母为引入的酶切位点。1.2、PCR 扩增以人类总cDNA为模板，利用表1中各基因引物进行PCR扩增，具体如下反应体系(25ill) :10Xpfx Mix 2. 5u 1, AccuPrime pfx 酶 0. 2 ii 1，上下游引物 (50 u M)各 0. 25ii 1，模板 0. 25 u 1，ddH20 21. 55 u 1。反应条件95°C 2min ；95 °C 20sec，66 °C 20sec，68 °C 30sec,循环 35 次； 68°C lOmin。1. 3、慢病毒载体的构建将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用天根公司的通用型DNA纯化回收试剂 盒(离心柱型)回收各基因片段，分别利用各自酶切位点双酶切，用相应的酶双酶切慢病毒 载体LV-efl a -IRES-EGFP，得到慢病毒载体的骨架片段，将慢病毒载体的骨架片段和各基 因片段用T4 DNA连接酶(Fermentas公司)于16°C连接过夜。将连接产物转化GBE180感受态细菌(制备方法见http //www. chem. uga. edu/scottgrp/GrpProtocols/Competent_cell_preparation. htm)，在琼月旨平板上(含 氨苄抗生素)，于37°C培养12小时，从平板上挑取阳性单菌落，使用博大泰克B型质粒 小量快速提取试剂盒提取质粒，经测序鉴定为正确方可使用，将所得载体分别命名为 LV-efl a -0ct4-IRES_EGFP、LV-efl a -Sox2-IRES_EGFP、LV-efl a -c-Myc-IRES_EGFP、 LV-efl a -Klf4-IRES-EGFP、LV-efl a -Lin28-IRES_EGFP、LV-efl a -Nanog-IRES-EGFP。实施例2、细胞培养2. 1、猪、羊原代骨髓间充质细胞(BMC)的培养
取新生猪或羊的小腿和大腿股骨和胫骨，浸泡于75%酒精中lOmin，使用含双抗 (青霉素、链霉素)的PBS冲洗三次，剪开骨两端，用含10%胎牛血清(FBS)的D-MEM培养 基的无菌注射器冲骨髓至50mL无菌离心管中，1200rpm离心5min，使用上述培养基重悬细 胞一次，再次1200rpm离心5min，培养基再次重悬后将细胞移入培养瓶中。三天后换液，可 见微小克隆，约一周后按1比3传代，传代时使用PBS清洗细胞2次，37°C下0. 25%胰酶消 化5min，之后一直按1比3至4传代。2. 2、猪、羊原代耳尖成纤维细胞(PEF)的培养取新生猪或羊耳朵，75%酒精清洗后剃毛，浸泡于含双抗(青霉素、链霉素)的PBS 中15min，再依次使用PBS，无血清培养基(D-MEM)清洗耳朵数次，然后将耳朵浸泡于少量含 10% FBS的D-MEM中，同时使用无菌剪刀将其剪成小块，移至培养瓶中，小块之间保持较小 的距离，培养瓶倒置。6-8小时后，补加含10% FBS的D-MEM，正置，此后每天补加少量该培 养基，一般5、6天后可明显观察到成纤维细胞，约10至15天传代，传代时使用PBS清洗细 胞2次，37°C下0. 25%胰酶消化5min，以10% FBS的D-MEM终止反应吹打。首次传代按1 比3传(视细胞量而定)，此后每3至4天传代，按1比4或6传。2. 3、其它细胞的培养293T细胞(购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库)的培养传代时 37°C下0. 25%胰酶消化5min，使用10% FBS的D-MEM终止反应，吹打后按1比8 10传 代。小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞根据文献(ThomsonJA.，Itskovitz-Eldor J.， Shapiro SS.，et al. Science. Nov 6 1998 ;282 (5391) :1145_1147 及 Xu，C.，et al. Nat Biotechnol. 2001,19(10) :971_4)的方法制备，作为滋养层细胞铺于平板备用。人胚胎干细胞HuES-17(sibs干细胞库网站中的HuES-17，购自哈佛大学)的培养 传代时37°C下胶原酶消化30min，使用hES培养液终止反应，吹打成小块后转移至离心管 中，1200rpm离心5min，去除上清后，使用该培养基重悬细胞，按1比8_10传代至辐照过的 小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的平板或培养瓶中，一般一周传代。实施例3、病毒包装3. 1、包装质粒的扩增将实施例1中得到的六种鉴定正确的载体转化感受态细菌进行扩增，经Axygen AxyPrep plasmid Maxiprep Kit试剂盒(Axygen公司)中抽后，在超净工作台中进行纯 化，即用中抽后质粒的1倍体积的3M NaAC和2倍体积的无水乙醇混勻后，lOOOOrpm离心 15min,去上清，使用75%乙醇漂洗，吸去上清，于超净工作台中吹干后，使用无菌去离子蒸 馏水溶解质粒，最后使用分光光度计确定质粒的浓度。3. 2、转染按照Invitrogen 公司转染试剂盒(ViraPower Lentiviral Expression Systems)的说明书，使用转染试剂Lipofectamine 2000将步骤3. 1中的六个慢病毒质粒 分别与包装质粒ViraPower Packaging Mix (Invitrogen公司)共同转染293T细胞。具体步骤为转染实验前一天铺293T细胞，使第二天细胞可生长至90%满，对于 一个 T75 瓶，取 9 ii g ViraPower Packaging Mix 禾口 3 ii g 病毒质粒于 1. 5mL opti-MEM 中， 轻轻混勻，另取已摇勻的Lipofectamine 2000转染试剂36 u 1于另一份1. 5mL opti-MEM中，轻轻混勻后，室温放置5min，将上述两份分别含DNA和转染试剂的opti_MEM轻轻混勻， 室温放置20min后将上述混合液至于293T细胞90%满的T75培养瓶中。按相同的方法转 染其它五种慢病毒质粒。3. 3、病毒滴度测定将步骤3. 2中转染获得的六种病毒分别在24h内更换培养基，此后收集转染48h、 72h和96h的病毒上清，直接取5 ill和1 ill上述六种病毒，分别于24孔板中悬浮感染15 万293T细胞，同时加入polybrene，由感染48h后六种病毒感染的293T细胞的GFP情况来 确定病毒滴度，具体由视野中GFP阳性细胞所占比例估算15万细胞中GFP阳性总细胞数， 继而获知单位体积病毒上清中的病毒颗粒数，即为相应病毒的滴度。实施例4、病毒感染将实施例3包装的慢病毒，以M0I 10感染1 X 105个猪原代耳尖成纤维细胞(PEF) 和猪原代骨髓间充质细胞(BMC)，或者以M0I 10感染1X105个羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF)和羊原代骨髓间充质细胞(BMC)，所用病毒的滴度约为5 8X 106IU/mL。实验分为4组a)空白对照组仅携带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒；b)实验组1 包含4种因子的第一种慢病毒组合，0ct4, Sox2, Lin28和Nanog ；c)实验组2 包含4种因子的第二种慢病毒组合，0ct4, Sox2, c_Myc和Klf4 ；d)实验组3 包含6种因子的第三种慢病毒组合，0ct4, Sox2, c_Myc，Klf4，Lin28 禾口 Nanog ；每组实验均有4个平行样，其中1个用于碱性磷酸酶(AP)染色，统计阳性克隆数， 另3个用于克隆挑选，每组实验均重复了三次。感染24小时后，使用PBS清洗细胞2次，再使用0. 25%胰酶37°C下消化5min，计 数后传代转移至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞的6孔板中，传代后24h内改用ES0培养基， 隔天换液，待出现克隆后每天换液。实施例5、转染后阳性细胞的筛选5. 1、转染后阳性细胞的筛选(猪)5. 1. 1感染猪细胞的荧光镜检及碱性磷酸酶(AP)染色用荧光显微镜观察实施例4感染后的猪原代耳尖成纤维细胞(PEF)和猪原代骨髓 间充质细胞(BMC)，发现感染后48小时有绿色荧光表达。传代后空白对照组中没有克隆形 成，实验组1也没有克隆形成，实验组2和3感染后3-4天细胞形态发生改变，呈圆形和明 显的细胞聚集，克隆出现在感染后5-6天，实验组2和3显微镜观察的结果如图2所示，其 形态主要有两种，一类是人类胚胎干细胞类(hES-like)克隆，其细胞致密，克隆表面光滑 且扁平，克隆边缘平滑，边界清晰光亮(图A为转染PEF细胞后形成ES-like克隆的形态、 B为ES-like克隆的绿色荧光镜检结果)；另一类克隆中部明显突起，细胞相对松散，边缘不 够平滑，边界相对模糊，为非hES-like克隆(图C为转染BMC后形成非ES-like克隆形态、 D为非ES-like克隆的绿色荧光镜检结果)。感染第13天对3组实验下四个平行样中的一个进行碱性磷酸酶(AP)染色，统计 阳性克隆数，结果如图3所示。由图3可知，空白对照组和实验组1没有克隆形成，实验组2 和3中hES-like克隆显示较强的AP阳性，非ES-like克隆AP阴性，1 X 105个猪BMC在实验组2和3中分别形成220个和230个AP阳性的iPS细胞集落；而猪PEF在实验组2和3 中分别形成892个和583个AP阳性的iPS细胞集落。由以上结果可知，转入特定的因子可以使已经分化的猪成体细胞重编程形成类似 人胚胎干细胞(hES-like)的克隆(iPS细胞集落)，感染PEF比感染BMC产生的克隆多2_3倍。5. 1.2、阳性细胞的筛选在感染后13天随机挑选克隆，置于猪ES0培养液中吹打成小块后，转移至辐照过 的滋养层细胞MEF的平板上，此后每天更换该培养基，此时细胞增殖很快，每三至四天可传 一代，传代时使用胶原酶37°C下消化20min，吹打为小块后，用含ES0培养液终止反应，收集 细胞团，1200rpm离心5min后，弃去上清，使用ES0培养液重悬细胞后，按1 5_10传代至 辐照过的滋养层细胞MEF上，此后不断进行克隆挑选和AP检测，猪的非ES-like克隆经多 次挑克隆和传代后AP依旧显示阴性，弃之。5. 2、转染后阳性细胞的筛选(羊)5. 2. 1感染羊细胞的荧光镜检及碱性磷酸酶(AP)染色用荧光显微镜观察实施例4感染后的羊原代耳尖成纤维细胞(PEF)和羊原代骨 髓间充质细胞(BMC)，发现感染后48小时有绿色荧光表达。传代后空白对照组中没有克隆 形成，实验组1也没有克隆形成，实验组2和3感染后3-4天细胞形态发生改变，呈圆形和 明显的细胞聚集，克隆出现在感染后5-6天，实验组2和3显微镜观察的结果如图4所示， 其形态主要有两种，一类是胚胎干细胞类(ES-like)克隆，其细胞致密，克隆表面光滑且扁 平，克隆边缘平滑，边界清晰光亮(图A为转染PEF细胞后形成ES-like克隆的形态、B为 ES-like克隆的绿色荧光镜检结果)；另一类克隆中部明显突起，细胞相对松散，边缘不够 平滑，边界相对模糊，为非ES-like克隆(图C为转染BMC细胞后形成非ES-like克隆形态、 D为非ES-like克隆的绿色荧光镜检结果)。感染第13天对3组实验下四个平行样中的一个进行碱性磷酸酶(AP)染色，统计 阳性克隆数，结果如图5所示，由图5可知，空白对照组和实验组1没有克隆形成，实验组2 和3中ES-like克隆显示较强的AP阳性，非ES-like克隆AP阴性，1 X 105个羊BMC在实验 组2和3中分别形成45个90个AP阳性的iPS细胞集落；而羊PEF在实验组2和3中分别 形成60个和185个AP阳性的iPS细胞集落。由以上结果可知，转入特定的因子可以使已经分化的羊成体细胞重编程形成类似 胚胎干细胞(ES-like)的克隆(iPS细胞集落)，感染PEF比感染BMC产生的克隆多1_2倍。5. 2. 2、阳性细胞的筛选在感染后13天随机挑选克隆，置于羊ES0培养液中吹打成小块后，转移至辐照过 的滋养层细胞MEF (feeder)上。此后每天更换该培养基，此时细胞增殖很快，每三至四天 可传一代，传代时，使用PBS清洗细胞2次，再使用胰酶(TrypLE Express) 37°C消化5_10 分钟后吹打成单细胞，1200rpm离心5min后，弃去上清，使用ES0培养液重悬细胞后，再按 1 10-20传至feeder上，此后不断进行克隆挑选和AP检测，羊的非ES-like克隆经多次 挑克隆和传代后AP依旧显示阴性，弃之。实施例6、猪干细胞特性检测取传至15代的转染猪PEF细胞的4-2号猪iPS细胞，以及传至15代的转染猪BMC细胞的6-11号猪iPS细胞(其中“4”和“6”分别指使用四种转录因子和六种转录因子) 进行以下检测，以证明其具备干细胞特性指标。6.1、碱性磷酸酶表达i^fflChemicon Alkaline Phosphatase Detection Kit (Millipore ^w]) ^fPk 色，具体步骤如下使用PBS清洗细胞两次，4% PFA(多聚甲醛)室温固定l-2min，TBST清洗一遍，AP 染料(按试剂盒中注明的配制)避光染色15min，TBST再清洗一遍后使细胞浸泡于PBS中。 取清洗后的细胞置于载玻片晾干，荧光镜检，结果如图6所示。由图6可以看出，6-11号猪iPS细胞被染成紫红色，而紫红色表示细胞具有碱性磷 酸酶活性，说明猪iPS克隆具有胚胎干细胞特性，即表达碱性磷酸酶。6. 2、猪iPS细胞的未分化状态检测用realtime PCR方法检测猪iPS细胞与诱导前猪BMC及PEF细胞进行对比，分析 其未分化基因表达水平。6. 2.1、引物设计由于未分化的细胞会特异性表达以下基因，包括0ct4、Sox2、Nanog、DNMT3b (DNA 甲基转移酶3b)、Lin28、E-cadherin(E-钙粘附素基因，也称⑶HI)，所以可通过检测这些基 因的表达情况得知所获得的猪iPS细胞的未分化状态。未分化marker引物序列设计如表 2所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(其中f 表示正向引物，r表示反 向引物)。表2 6. 2. 2、PCR 扩增使用Toyobo Syber green PCR Mix,反应体系(15 μ 1)模板 0·3μ1，引物 (5 μ Μ) 1 μ 1，Syber green Mix 7· 5 μ 1，ddH20 6. 2 μ 1，其中模板为抽提猪 iPS 细胞的 RNA 反转得到的cDNA，阴性对照的模板取自未转染的猪BMC及PEF细胞RNA反转得到的cDNA， 空白对照的模板为ddH20。。反应条件94°C，5min;94°C 15sec，66°C 10sec，72°C 15sec，循环 40 次；72 °C， IOmin0将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示，由图7的结果可知，猪iPS细胞(piPS4-2，piPS6_ll)与诱导前的猪BMC及PEF相 比,其干细胞相关的 marker，即 0ct4，Nanog, Sox2, DNMT3b, Lin28, E-cadherin 均有较高水 平的表达。6. 2. 3、通过免疫荧光染色检测胚胎干细胞未分化相关marker是否表达(包括 SSEA-I、SSEA-3、SSEA-4、Tra_l_60、Tra-1-8U Nanog,Rex-UE-cadherin)使用PBS清洗细胞两次，4% PFA室温固定30min，PBS洗三次，再用含0. 2 % BSA+0. 1 % Triton-IOO 的 PBS 洗两次，接着使用含 1 % BSA+4 % normal serum+0. 1 % Triton-IOO 的 PBS 封闭细胞 lh，再将一抗(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、 CDHUNanog,Rex-I)稀释在含 0. 2% BSA+0. 1% Triton-IOO 的 PBS 中，然后加到样品上，室 温2h或4°C过夜，然后用PBT (0. Triton-IOO的PBS)洗涤细胞3_5次，将二抗(分别 对应上述的一抗为:Mouse IgM、Rat IgM、Mouse IgG、Mouse IgM、Mouse IgM、Rabbit IgG、 Goat IgG,Goat IgG)稀释在含 0. 2% BSA+0. 1 % Triton-100 的 PBS 中，然后加到样品上，室 温lh，再用PBT洗三次，将Hochest母液以1 1000用PBS稀释，室温避光放置5min，然后 PBS洗涤两次，每次5min，再用4% PFA室温固定30min，最后用PBS洗涤两次，每次5min。免疫荧光染色结果如图8所示。由图8可以看出，荧光镜检检测到猪iPS细胞表达干细胞相关marker SSEA-3、 SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、Nanog、Rex_l、E-cadherin 的染色结果为红色，另外 SSEA-1 的dapi染色为蓝色阴性结果，SSEA-1是小鼠胚胎干细胞marker，而SSEA-3、SSEA-4、 Tra-1-60,Tra-1-81是人胚胎干细胞marker，说明猪iPS克隆能维持未分化的状态，且具有 和人胚胎干细胞更相似的特性。6. 3、猪iPS细胞内源基因表达水平检测6. 3.1、引物设计由于使用人源的基因诱导猪BMC及PEF重编程为猪iPS细胞，因此使用人源的引 物检测人胚胎干细胞hES的内源基因的表达情况，使用猪基因检测猪iPS细胞内源基因的 表达情况，引物序列如表3所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(其中f 表示正向引物，r表示反向引物)。表3 6. 3. 2、PCR 扩增使用Toyobo Syber green PCR Mix 反应体系(15 yl)模板 0. 3 yl，引物 (5uM)lu 1, Syber green Mix 7. 5u 1, ddH20 6. 2 yl，其中模板为抽提 iPS 细胞和 hES 的 RNA反转得到的cDNA。反应条件94°C，5min;94°C 15sec，66°C 10sec，72°C 15sec，循环 40 次；72 °C， lOmin。根据定量PCR原理，利用绝对定量，未知样品的量(拷贝数)可以通过从已知量 的标准品的范围中推算得出。为了建立标准曲线，需要已知浓度的模板(模板即质粒载体 Lv-efla -0ct4-IRES-EGFP, Lv-efla -Sox2-IRES_EGFP，Lv-efla -Nanog-IRES-EGFP)。模板稀释后，用这些稀释样品作为标准样品，将未知的待测样本和标准样本置于同一次实验 中进行反应，用稀释的样品标准样品构建标准曲线，通过计算来确定未知样品中目的基因的量。标准品基因PCR的ct值与起始量(拷贝数)的对数呈线性关系，据此可作一条ct 值对log(拷贝数)的曲线，得到线性相关得方程式，样本基因的拷贝数可以通过对应的Ct 值利用方程式计算得出，将结果绘制成图9。由图9结果可知，猪iPS细胞piPS4-2及piPS6-ll，其内源0ct4、Nanog、Sox2基 因均得到激活表达，其表达水平和人胚胎干细胞hES相当或明显超过。6. 4、干细胞特异启动子去甲基化程度检测为检测得到的猪iPS细胞的0ct4基因的启动子区域是否被去甲基化，先使用 Bisulphite处理DNA，具体步骤如下取每份样品DNA210ng，双蒸水稀释到21 yl，每管加入新鲜配置的2M的NaOH 4iil，5(TC反应15min，向该样品中加入50°C的50 yl 2%的低熔点琼脂糖(该琼脂糖预 先置于100°C 5min)，混勻后取10 yl于预冷的300 yl液体石蜡中，冰上至少放置30min， 使形成的beads坚硬。然后向beads中加入500iU新配的2. 5M焦亚硫酸钠(Sodium metabisulphite)摇勻，使beads位于分层上，离心甩一下，然后50°C避光反应4h_12h (不 超过 16-18h)。接着使用 lml TE (pH8. 0)洗 3 次，每次 lOmin, 0. 5ml 0. 2M NaOH 洗 2 次，每 次15min，再用lml TE，每次lOmin，然后每管加100 u 1 TE，4°C保存。在猪目的基因(0ct4) Promoter区富含CpG区域的上下游设计引物，将各富含 CpG区的PCR产物连接至T载体上，转化后抽提质粒酶切鉴定送测序，其中的CG区即为 甲基化位点，而TG区为未甲基化位点，绘制图谱(Analysis of DNA methylation using bisulphate sequencing, contributed by Dr. Alexei Gratchev),结果见图 10。由图10的结果可见，诱导前的猪BMC及PEF细胞，其0ct4基因的启动子区域被高 度甲基化，而诱导重编程得到的猪iPS细胞piPS4-2和piPS6-ll的0ct4基因的启动子区 域被高度去甲基化，诱导后的细胞猪BMC及PEF细胞得到有效的重编程。6. 5、端粒酶活性检测按照试剂盒TRAPEZEk Telomerase Detection Kit (Chemicon 公司)中的操作步 骤，经过提取端粒酶、端粒酶延伸反应和PCR扩增反应，上样于PAGE胶上染色照相。具体步骤为收集100万猪iPS细胞以及阳性对照细胞(肿瘤细胞或干细胞)，PBS 洗一次，使用含 150U/mL RNase inhibitor 的 1 X CHAPS Lysis Buffer，冰上裂解 30min， 12000rpm, 4°C离心20min，收集上清，使用Lysis Buffer适当稀释后取少量85°C热处理，分 别取热处理和非热处理的上述裂解液，按照试剂盒中所说进行端粒酶延伸反应和PCR扩增 反应。然后上样于12. 5%的非变性PAGE胶上，缓冲液为0. 5XTBE,使用EB按1 y g/mL染 色30min，之后用去离子水洗脱10-20min，凝胶电泳成像的结果如图11所示。由图11知猪iPS细胞piPS4-2和piPS6-l 1与猪BMC及PEF细胞相比具有较高端 粒酶活性，且热失活情况下细胞端粒酶失活，说明该活性为RNA特异性依赖的端粒酶活性。6. 6、拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能(猪iPS细胞体外分化能力)6.6. 1引物设计为了验证猪iPS细胞的多能性，使之自然分化形成胚状体(EB)，使用相对定量PCR
14的方法，即在确保看家基因Gapdh表达水平基本一致的情况下，比较各个样品，其三个胚层 不同标记基因的表达水平间的差异。引物序列如表4所示，引物由上海生工生物工程技术 服务有限公司合成(其中f 表示正向引物，r表示反向引物)表 4 6. 6. 2、PCR 扩增使用Toyobo Syber green PCR Mix 反应体系(15 yl)模板 0. 3 yl，引物 (5uM)lu 1, Syber green Mix 7u 1, ddH20 6. 2 u LUNG 0. 5 u 1 其中模板为抽提 iPS 细胞 和hES的RNA反转得到的cDNA。反应条件:95°C,2min；94°C 15sec，66°C 10sec，72°C 15sec，82°C 8sec，循环40 次； 72°C，lOmin。
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图12所示。由图12的结果可知， 猪iPS细胞piPS4-2和piPS6-ll能够表达外胚层GFAP (大脑神经胶质纤维酸性蛋白质)、 Neurod(神经源性分化蛋白)，中胚层BMP4(骨形成蛋白4)、Enolase (烯醇化酶)和内胚层 AFP(甲胎球蛋白)、a-anti-trypSin(a-抗胰蛋白酶)的分化基因，证明猪iPS细胞能够 分化形成胚状体中所有三个胚层。以上结果证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有体外分化成不同的组织 细胞的潜能。6. 7、畸胎瘤形成的检测为了验证得到的克隆在体内具有多组织的分化能力，用畸胎瘤石蜡切片，苏木 精-伊红(HE)染色显示三个胚层组织细胞。6.7. 1、畸胎瘤形成将piPS6-ll号猪iPS细胞用0. 25%胰酶消化为单细胞，将其铺于用于细胞培养 的培养皿中，置于37°C培养箱静置45min，取上层未贴壁的细胞(feeder贴壁快，故可将 feeder与iPS细胞分离)。计数，500万iPS细胞悬浮于300 yl 10% D-MEM中，对先天性 免疫缺陷小鼠N0D-SCID小鼠进行后腿肌肉注射。第30天观察到有瘤形成，于第30-35天 将其取出。6. 7. 2、石蜡切片及HE染色畸胎瘤石蜡切片制作步骤将畸胎瘤用4% PFA固定后，PBS洗三次，依次使用 30%,50%,70%,80%,90%,95%,100%乙醇脱水lh，继续使用100%乙醇脱水lh后，使用 100 %乙醇脱水过夜，接着用氯仿处理lh，处理三次，之后浸没于石蜡中2h，随后包埋，5 u m 切片。HE染色步骤将石蜡切片用二甲苯(Xylene)洗四次，每次5min(在脱色摇床上进 行)，无水乙醇洗两次，每次lOmin，95%,90%,80%,70%乙醇依次洗5min，再用蒸馏水洗 三次，每次5min，苏木精染色lOmin后流水冲洗15-30min至适合的颜色，接着再用蒸馏水 洗5min，伊红A液染lmin，伊红B液染5min，再用蒸馏水洗，接着用70 %乙醇涮洗，90%乙 醇涮洗至适合颜色，再用无水乙醇洗两次，每次lOmin，最后用Xylene洗四次，每次5min后 封片。将玻片显微镜镜检，结果如图13所示。由图13可以看到，猪iPS细胞能够在体内 分化形成三个胚层细胞，包括外胚层的玫瑰状结样的神经上皮细胞，中胚层的软骨组织以 及内胚层的肠样上皮细胞。由以上结果进一步证明形成的猪iPS克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有在体内 分化成不同的组织细胞的潜能。猪干细胞特性检测的各项结果可表明，本发明猪成体细胞重编程为类似胚胎干细 胞的可诱导多能干细胞，使用猪原代骨髓间充质细胞(BMC)和原代耳尖成纤维细胞(PEF)， 已获得数株猪iPS细胞，并由碱性磷酸酶表达、干细胞特异标记，干细胞特异启动子去甲基 化程度、端粒酶活性、拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能以及畸胎瘤形成，确认了其干 细胞特性。实施例7、羊干细胞特性检测取传至15代的转染羊原代耳尖成纤维细胞的Sf4_3号、Sf6-3号、Sf6_4号、Sf6-193号羊iPS细胞(其中“Sf4”和“Sf6”分别指使用四种转录因子和六种转录因子) 进行以下检测，以证明其具备干细胞特性指标。7.1、碱性磷酸酶表达按照实施例6. 1所述的方法对Sf6_3号羊iPS细胞进行染色，结果如图14所示。由图14可以看出，Sf6_3号羊iPS细胞被染成紫红色，而紫红色表示细胞具有碱 性磷酸酶活性，说明羊iPS克隆具有胚胎干细胞特性，即表达碱性磷酸酶。7. 2、羊iPS细胞的未分化状态检测用realtime PCR方法检测羊iPS细胞与诱导前羊PEF细胞进行对比，分析其未分 化基因表达水平。7. 2.1、引物设计由于未分化的细胞会特异性表达以下基因，包括0ct4、Sox2、Nanog、DNMT3b (DNA 甲基转移酶3b)、E-cadherin、Lin28，所以可通过检测这些基因的表达情况得知所获得的羊 iPS细胞的未分化状态。未分化marker引物序列设计如表5所示，引物由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。表 5 使用Toyobo Syber green PCR Mix,反应体系(15 yl)模板 0.3iU，引物 (5uM)lu l,Syber green Mix 7. 5 u l,ddH20 6. 2 yl，其中模板为抽提的羊 iPS 细胞的 RNA 反转得到的cDNA，阴性对照为未转染的羊耳尖成纤维细胞的RNA反转得到的cDNA，空白对 照的模板为ddH20。反应条件94°C，5min;94°C 15sec，66°C 10sec，72°C 15sec，循环 40 次；72 °C， lOmin。将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图15所示。由图15的结果可知，羊iPS细胞(Sf6-3，Sf6-4，Sf6_193，Sf4_3)与诱导前的羊 PEF(Sf)相比，其干细胞相关的 marker，即 0ct4，Sox2, Nanog, DNMT3b, Lin28, E-cadherin 均有较高水平的表达。7. 3、通过免疫荧光染色检测胚胎干细胞未分化相关marker是否表达(包括 SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra_l_60、Tra-1-81、Nanog、Rex_l、E-cadherin)使用PBS清洗细胞两次，4 % PFA室温固定30min，PBS洗三次，再用含0. 2 % BSA+0. 1 % Triton-100 的 PBS 洗两次，接着使用含 1 % BSA+4 % normal serum+0. 1 % Triton-100 的 PBS 封闭细胞 lh，再将一抗(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、 Nanog、Rex-l、CDHl)稀释在含 0. 2% BSA+0. 1% Triton-100 的 PBS 中，然后加到样品上，室 温2h或4°C过夜，然后用PBT(0. Triton-100的PBS)洗涤细胞3_5次，将二抗(分别对 应上述的一抗为:Mouse IgM、Rat IgM、Mouse IgG、Mouse IgM、Mouse IgM、Goat IgG、Goat IgG、Rabbit IgG)稀释在含0. 2% BSA+0. 1% Triton-100的PBS中，然后加到样品上，室温 lh，再用PBT洗三次，将Hochest母液以1 1000用PBS稀释，室温避光放置5min，然后PBS 洗涤两次，每次5min，再用4% PFA室温固定30min，最后用PBS洗涤两次，每次5min。免疫 荧光染色结果如图16所示。由图16可以看出，荧光镜检检测到羊iPS细胞表达干细胞相关marker SSEA-1、 Tra-l-60、Tra-l-81、Nanog、Rex-l、E-cadherin(其中 SSEA-3、SSEA-4 为阴性，蓝色为 dapi 染色)，说明羊iPS克隆能维持未分化的状态。7. 4、拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能(羊iPS细胞体外分化能力)7.4. 1引物设计为了验证羊iPS细胞的多能性，使之自然分化形成胚状体(EB)，使用相对定量PCR 的方法，即在确保看家基因Gapdh表达水平基本一致的情况下，比较各个样品，其三个胚层 不同标记基因的表达水平间的差异。引物序列如表6所示，引物由上海生工生物工程技术 服务有限公司合成(其中f 表示正向引物，r表示反向引物)
18
表6 7. 4. 2、PCR 扩增使用Toyobo Syber green PCR Mix 反应体系(15 ii 1)模板 0. 3 ii 1，引物 (5uM)lu 1, Syber green Mix 7u 1, ddH20 6. 2 u LUNG 0. 5 u 1 其中模板为抽提 iPS 细胞和hES的RNA反转得到的cDNA。反应条件:95°C,2min；94°C 15sec，66°C 10sec，72°C 15sec，82°C 8sec，循环40 次； 72°C，lOmin。将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图17所示。由图17的结果可知，羊 iPS细胞Sf4-3和Sf6-193能够表达外胚层NFH(神经微丝重链)、Neurod (神经源性分化 蛋白)，中胚层Renin(肾球旁分泌肾素)、Myogenin(肌细胞生成素)和内胚层AFP(甲胎 球蛋白)、DCN(核心蛋白聚糖)的分化基因，证明羊iPS细胞能够分化形成胚状体中所有三 个胚层。以上结果证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有体外分化成不同的组织 细胞的潜能。羊干细胞特性检测的各项结果可表明，本发明羊成体细胞重编程为类似胚胎干细 胞的可诱导多能干细胞，使用羊原代骨髓间充质细胞(BMC)和原代耳尖成纤维细胞(PEF)， 已获得数株羊iPS细胞，并由碱性磷酸酶表达、干细胞特异标记，干细胞未分化水平，确认 了其干细胞特性。本发明所述“转录因子”的导入形式包括病毒、蛋白质、DNA或RNA。DNA包括cDNA、 基因组DNA和人工合成DNA。本发明中，虽然仅以慢病毒载体为例制备了可诱导的多潜能干 细胞，但是本领域的技术人员可以通过常规的分子生物学手段，参照本发明所述的方法，使 用逆转录病毒载体、腺病毒载体或其它病毒载体制备可诱导的多潜能干细胞。虽然本发明仅以猪和羊为例制备了可诱导多能干细胞iPS，对于其它有蹄类哺乳 动物，如马、牛等，本领域的技术人员参照本发明所述的制备方法，同样可以制备出该有蹄 类哺乳动物的可诱导多能干细胞iPS。综上所述，本发明有助于确立猪、羊、牛和其它有蹄类哺乳动物的ES细胞建系的 最适培养条件和方法；可由猪或羊iPS细胞系建立人类多种遗传性疾病的实验模型；定向 分化猪的iPS细胞获得形态和功能上接近于人类的猪的器官也将成为人类器官移植治疗 的良好选择；此外，对猪或羊的iPS细胞实施基因操作，还可对其产出品，如猪肉、羊肉、羊 奶、羊毛等进行基因改良，获得更好的产品满足人类生活所需，同时还可提高有蹄类哺乳动 物的抗病能力，在生物制药等方面也将大有帮助。SEQUENCE LISTING<110>中国科学院上海生命科学研究院<120> 一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞及其制备方法<130>P5091002<160>80<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>37<212>DNA<213>合成序列<400>1ggggggatcc gccaccatgg gctccgtgtc caaccag37
20
<210>2<211>31<212>DNA<213>合成序列<400>2gcgcgctagc tcaattctgt gcctccggga g31<210>3<211>38<212>DNA<213>合成序列<400>3ggggggatcc gccaccatgc ccctcaacgt tagcttca38<210>4<211>32<212>DNA<213>合成序列<400>4gcgcgctagc ttacgcacaa gagttccgta gc32<210>5<211>37<212>DNA<213>合成序列<400>5ggggggatcc gccaccatga ggcagccacc tggcgag37<210>6<211>31<212>DNA<213>合成序列<400>6gcgcgctagc ttaaaaatgc ctcttcatgt g31<210>7<211>38<212>DNA<213>合成序列<400>7ggggagatct gccaccatga gtgtggatcc agcttgtc38<210>8<211>32<212>DNA
<213>合成序列<400>21cagagtaagc tgcacatgga gg22<210>22<211>20<212>DNA<213>合成序列<400>22gtaggctggc tttccctgtg20<210>23<211 >21<212>DNA<213>合成序列<400>23gaagatgaca cccgggacaa c21<210>24<211>21<212>DNA<213>合成序列<400>24gggtcactat cagctgcctt c21<210>25<211>20<212>DNA<213>合成序列<400>25acctgccgcc tggagaaacc20<210>26<211>22<212>DNA<213>合成序列<400>26gaccatgagg tccaccaccc tg22<210>27<211>22<212>DNA<213>合成序列<400>27caaactgagg tgcctgccct tc22
<210>28<211>25<212>DNA<213>合成序列<400>28attgaacttc accttccctc caacc25<210>29<211>21<212>DNA<213>合成序列<400>29agccccagct ccagtttcag c21<210>30<211>28<212>DNA<213>合成序列<400>30aatgatcgtc acatatcttc aggctgta28<210>31<211>23<212>DNA<213>合成序列<400>31gttccatggg ctcagtggtc aag23<210>32<211>25<212>DNA<213>合成序列<400>32aagcgtaccg ggtttttctc catac25<210>33<211>22<212>DNA<213>合成序列<400>33agaaggatgt ggtccgagtg tg 22<210>34<211>22<212>DNA
acgggaagct cactggcatg g21
<210>80<211>19<212>DNA<213>合成序列<400>80gccagcccca gcatcgaag19
权利要求
一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞iPS的制备方法，其特征在于，包括步骤A)构建携带转录因子的表达载体，所述转录因子选自Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28和Nanog；B)将步骤A)中的转录因子以组合形式导入有蹄类哺乳动物细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到有蹄类哺乳动物iPS细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体为含有所述转录因子的质粒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转录因子导入形式为病毒、蛋白质、RNA 或 DNA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载 体或腺病毒载体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有蹄类哺乳动物细胞选自有蹄类哺乳 动物原代骨髓间充质细胞或原代耳尖成纤维细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转录因子的组合形式包括a)含有0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4 ；或b)含有0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog0
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)传代培养是将有蹄类哺乳动物 iPS克隆按1 ；5-20的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色 呈阳性的细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤C)有蹄类哺乳动物iPS细胞的 干细胞多能性鉴定。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤C)包括检测以下指标1)碱性磷酸酶表达呈阳性；2)干细胞特异标记Tra-1-60、Tra-1-8UNanog、E-cadherin和Rex-I表面抗原呈阳性；3)自然分化形成胚状体后外胚层GFAP、Neurod或Ν 基因表达呈阳性；中胚层ΒΜΡ4、 Enolase,Renin或Myogenin基因表达呈阳性；内胚层α -anti_trypsin、AFP或DCN基因表 达呈阳性。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述指标还包括4)0ct4基因的启动子区域被去甲基化；5)端粒酶活性比有蹄类哺乳动物成体细胞高。
12.如权利要求1 11任一项所述的方法，其特征在于，所述有蹄类哺乳动物包括猪、 羊或牛。
13.一种按权利要求1 11所述任一项制备的有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞。
14.一种用于导入有蹄类哺乳动物细胞的载体组合物，其特征在于，所述载体组合物含 有 0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog 转录因子。
全文摘要
本发明涉及一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞及其制备方法，所述方法包括步骤A)构建携带转录因子的表达载体，所述转录因子选自Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28和Nanog；B)将步骤A)中的转录因子以组合形式导入有蹄类哺乳动物细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到有蹄类哺乳动物iPS细胞。本发明有助于确立猪、羊、牛和其它有蹄类哺乳动物的ES细胞建系的最适培养条件和方法；可由有蹄类哺乳动物iPS细胞系建立人类多种遗传性疾病的实验模型。
文档编号C12N15/85GK101864451SQ20091004938
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月15日 优先权日2009年4月15日
发明者任江涛, 吴昭, 崔春, 廖婧, 肖磊, 陈霁君, 饶灵均, 鲍磊 申请人:中国科学院上海生命科学研究院