专利名称：快速检测弓形虫的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于人兽共患传染病病原体的检测技术领域，尤其涉及一种快速检测弓形虫 的荧光定量PCR试剂盒，适用于弓形虫定性定量检测。
背景技术：
弓形虫是一种广泛寄生于人和动物有核细胞中的寄生性原虫，猫科动物为其终末 宿主，人和许多脊椎动物为其中间宿主。该虫呈世界性分布，人和许多动物均能感染， 引起人兽共患的弓形虫病。由于其对人类健康及农牧业生产存在很大的潜在危害，快 速、准确地诊断弓形虫病显得十分重要。
临床检测上，传统的病原学检査方法具有检出率不高、培养时间长等不足，传统 的血清学方法由于简便、快速、敏感性尚佳，仍然是各实验室的常用方法，但血清学 只是感染的间接标志，当机体免疫力低下时，则很难获得可供诊断的血清学结果。由 于人群感染弓形虫的普遍性，血清学检测对现症感染的诊断价值受到一定限制。常规 的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使其在临床诊断上受到一些限制，因此急 需一种精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
发明内容
本发明提供一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，其目的在于克服现有技术 存在检出率不高、培养时间长等缺点和不足，用于弓形虫的快速检测。
本发明提供的快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，包括DNA提取液、荧光定量PCR 反应液、标准阳性模板弓形虫pMD-Bl、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品等 组成；其中，
标准阳性模板pMD-Bl含有弓形虫高度保守Bl基因的223个碱基的核苷酸片段构成的 pMD-18重组载体，该载体可在大肠杆菌DH5a中增殖；
荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、 MgCl2、 dNTPs及无菌双蒸水组成；
弓形虫标准阳性模板所包含的Bl基因的核苷酸序列为caagagaagtatttgagg
ggctga卿a-3' o
本发明所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤
1、 DNA提取液配制裂解缓冲液，包括如下组分0. lMTris-HC1 (pH8.0), 0. l 0. 15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8. O)和1% 4% SDS。配制蛋白酶K的J)C存液，浓 度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4u g/"，即为DNA提取液。
2、 定量PCR反应液包括SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、 MgCl2、 dNTPs及无菌双蒸水组成。
3、 标准阳性模板弓形虫pMD-Bl:标准阳性模板pMD-Bl是含有弓形虫高度保守基 因Bl基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒，该重组质粒转化大肠杆 菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测A26。定量并稀释至1(T拷贝/yl，使 用前进行10倍梯度的系列稀释。
4、 弓形虫B1基因特异性引物正向引物Toxo-BF:5'-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3';反 向引物Toxo-BR: 5'-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3'。
5、 阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。 本试剂盒的工作原理
SYBR-GreenI是一种常用的实时定量PCR技术，它巧妙地利用了 PCR技术高效扩 增、光谱技术的敏感性及定量分析的优点，通过实时检测扩增过程中荧光物质强度的 变化来进行PCR产物的分析。SYBR-Green I具有以下特点1)它能结合到双链DNA的小 沟部位;2)它只有和双链DNA结合后才发出荧光;3 )PCR反应中的高温变性时，DNA双 链分开，无荧光:4 ) PCR反应中的低温复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR-Green I 发荧光，此阶段采集信号，荧光量的增加与PCR产物的累积量呈比例关系。对弓形虫 的定量可通过与标准品的循环域值(Ct， Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR 过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模板数呈一定比例关 系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度 标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷 贝数。本发明的使用方法包括以下步骤
1、 对贮存液浓度为10"拷贝/li 1标准阳性模板pMD-Bl进行10倍的系列稀释，制 备阳性标准品；
2、 从待测标本中提取DNA;
3、 分别取步骤2中的DNA和同样量的系列稀释的步骤1中的两种阳性标准品加入 到荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；
4、 通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数 进行定量。
以下实验表明试剂盒可以快速检测弓形虫
(1)取新鲜或冰冻动物组织块100mg (0.5cm'!)，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中， 加入lml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K (500y g/ml) 20u 1，混匀。在65。C恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37。C水浴12
24 h，用酚-氯仿-异戊醇(酚氯仿异戊醇=25: 24: 1)抽提2次，无水乙醇沉淀
后用30 u 1 TE (0. 1M Tris-HC1， 0. 001M EDTA pH8. 0)溶解，取1 n 1做PCR反应。
(2) 将阳性标准模板系列稀释为109拷贝/111、 108拷贝/^1、 107拷贝"1、 106 拷贝/iU、 105拷贝/4 1。
(3) 分别取荧光定量PCR反应液各24nl，取第①步所得弓形虫DNA和第②步稀 释的弓形虫阳性标准模板各l "1，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧 光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为95。C预变性60 s ; 95°C 15 s ， 58°C 15 s ， 72°C 45 s ，扩增40个循环。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待测样品拷贝数。结果为弓形虫标准阳 性模板l()9拷贝/yl、 K)8拷贝/ul、 107拷贝/"、 1(f拷贝/ul、 105拷贝/ul的Ct 值分别为19.15， 22.80， 25.48， 28.86， 32.28;阴性对照为0 。
反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析/^>0. 05，数据差异无显著意义，说 明不同批次之间的检测结果具有可比性和良好的重复性。
从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光 定量PCR检测试剂盒对样品(DNA)的检测仅需2个小时就能完成。
本发明与现有技术相比其积极效果在于具有定量准确、检测速度快，仅2小时、 特异性好，灵敏度高、使用步骤简单，可重复性好，可以弓形虫样品进行定性定量检测，可以替代传统的病原学和血清学方法。
图1:弓形虫标准阳性模板1(T拷贝/Ul、 108拷贝/"1、 1()7拷贝/!il、 106拷贝/
U 1、 105拷贝/11 1不同稀释度PCR扩增结果。1为DL2000 Marker; 2 9分别为弓形 虫标准阳性模板107拷贝/til、 1(f拷贝/yl、 K)5拷贝/ul、 1C)4拷贝/nl、 103拷贝/ ul、 102拷贝"1、 10拷贝/yl、 l拷贝/ul稀释度的PCR扩增产物。
图2:质粒pMD-Bl的标准曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明
下列实例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克 等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出 版社，2001，细胞实验指南，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例h试剂盒组成与配制
(1) DNA提取液配制裂解缓冲液，包括如下组分0.1 M Tris-HC1 (pH 8.0)， 0. 1 0.15 M NaCl， 0. 1 0. 5 M EDTA (pH 8. O)和1% 4% SDS。配制蛋白酶K的贮存 液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度 为4ug/ul，即为DNA提取液。
(2) 荧光定量PCR反应液:配制反应液SYBR-Green I (10X) 0. 5ul， 10Xbuffer 2.5ul， dNTP (2.5 mmol/L) 2ul， Taq酶 (5U/ul) 0.2^1， MgCl2 (2, 5蘭ol/L) 3.5ul，正向引物和反向引物各lu 1 (10umol/L)，无菌双蒸水14. 3ti 1。
(3) 标准阳性模板贮存液浓度为1(T拷贝/ul标准阳性模板pMD-Bl。
(4) 阴性指控标准品为无菌双蒸水。 实施例2:试剂盒的特异性试验
用经过DNA有效性验证毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、利什曼原虫、柔嫩艾美 尔球虫等5种对照阳性样品各1 P 1为模板进行荧光定量PCR反应，同时设空白对照组 和阳性对照组。
PCR扩增条件为循环条件为95。C预变性60 s ; 95°C 15 s ， 58°C 15 s ， 72°C 45 s ，扩增40个循环。
结果只有弓形虫检测有扩增曲线，而毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、利什曼原虫、柔嫩艾美尔球虫均无扩增曲线。将弓形虫经三次重复，溶解曲线的溶解温度稳定， 说明目的基因PCR扩增产物特异性较好；获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，均与目 的条带大小(223bp)相近。上述结果说明试剂盒具有较好的特异性。 实施例3试剂盒的敏感性试验
首先将计数后的弓形虫速殖子DNA进行稀释，检测其总DNA含量，采用倍比法作 10X, 100X， 1000X， 2000X， 4000X， 8000X稀释弓形虫DNA，各1 W 1为模板进行 荧光定量PCR反应，同时设空白对照组。
PCR扩增条件为循环条件为95'C预变性60 s ; 95°C 15 s ， 58°C 15 s ， 72°C 45 s ，扩增40个循环。
通过实验结果确定试剂盒的敏感性，通过6个稀释度的扩增曲线，表明该荧光定 量PCR试剂盒最多能检测到0. 5个弓形虫。
权利要求
1、一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于由DNA提取液，荧光定量PCR反应液，标准阳性模板pMD-B1、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品组成。正向引物Toxo-BF5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；反向引物Toxo-BR5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′；标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫保守基因的223个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正、反向引物Toxo-BF 和Toxo-BR、 MgCl2、 dNTPs及无菌双蒸水组成。
3、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是弓形虫标准阳性模 板所包含的Bl基因的核苷酸序列为5'-tccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactg caagagaagtatttgaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgt acgacErtcgcaltc犯gggaagagatccagcagatctcgttcg"tg1:attcgagac犯gagaggtccgcc cccacaagacggctgaagaa-3'。
4、 权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤l)DNA提取液配制裂解缓冲液，包括如下组分0. lMTris-HCl (pH 8.0)， 0. 1 0. 15 M NaCl， 0.1 0. 5 M EDTA (pH 8. 0)和1% 4%SDS。配制蛋白酶K的贮存液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞 基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4ug/ul，即为DNA提取液。2) 定量PCR反应液包括由SYBR-Greenl，正反向引物Toxo-BF 和Toxo-BR、 MgCl2、 dNTPs及无菌双蒸水组成；3) 标准阳性模板pMD-Bl:标准阳性模板pMD-Bl含有弓形虫高度 保守基因Bl基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒， 该重组质粒转化大肠杆菌DH5 a增殖后用碱裂解法提取，用分光光度 计测A26。定量并稀释至1(T拷贝/P 1，使用前进行10倍梯度的系列稀 释；4) 弓形虫B1基因特异性引物正向引物Toxo-BF: 5' -TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3'; 反向引物Toxo-BR: 5'-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3';5) 阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种人兽共患传染病病原体的基因检测技术，适用于弓形虫定性定量检测。本发明由DNA提取液、标准阳性模板、荧光定量PCR反应液、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品组成。本发明定量准确，检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可替代传统的病原学检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101613751SQ200910067020
公开日2009年12月30日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者全 刘, 商立民 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所