专利名称：可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶生产方法
技术领域：
本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产新型蛋白酶及其制剂的方法，特别是
涉及一种可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶生产方法，其制备技术属于发酵工程及生物化工技术领域，其应用技术涉及医药、食品、化妆品领域。
背景技术：
用酶水解低值鱼及鱼类加工下脚料生产高附加值产品是低值鱼及鱼类综合利用的重要途径。淡水鱼及鱼类下脚料含有丰富的胶原蛋白及较少的内源弹性蛋白酶，用目前的商品蛋白酶(碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等)对其进行水解时，普遍存在水解得率低、水解不彻底等问题；因此，如何生产出能高效水解淡水鱼和鱼类加工下脚料的新型蛋白酶制剂对于淡水鱼的精加工及综合利用具有重要意义。 弹性蛋白酶(EC 3. 4. 4. 7，Elastase)是一种以水解不溶性弹性硬蛋白(elastin，如胶原蛋白)为特征的蛋白水解酶，它不仅能高效地水解弹性蛋白，也可以高效地水解肌肉蛋白，因此，用具有弹性蛋白酶活性的新型蛋白酶水解淡水鱼及富含胶原蛋白的鱼类加工下脚料，可大大提高水解效率。 目前，弹性蛋白酶的生产方法是从猪胰腺中提取，产品价格十分昂贵，不适于在食品领域中推广应用。相比从动物脏器中提取弹性蛋白酶，利用微生物发酵法生产弹性蛋白酶具有周期短、效率高、易实现工业化生产等特点，可大大降低弹性蛋白酶的生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶的生产
方法，其工艺步骤包括(1)菌种活化；(2)种子制备；(3)用不含有机氮源的培养基培养枯
草芽孢杆菌至对数生长期；(4)加入从鱼鳞或鱼皮中提取的胶原蛋白诱导蛋白酶的产生，
添加triton-100并提高发酵温度促进蛋白酶的分泌，这样可以在短期内产生大量的蛋白
酶，该蛋白酶具有很强的弹性蛋白酶活性；(5)蛋白酶的分离与制剂。 所用的菌种为枯草芽孢杆菌，所生产的蛋白酶具有很强的弹性蛋白酶活性。 所述步骤(3)中所用的培养基中不包含蛋白胨、牛肉膏等有机氮源，其组分为葡
萄糖1-8 % ，玉米桨粉0.2-1%， K2HP030 . 06-0 . 2 % ， MgS04 7H20 0. 034 % ，，余量为水。发酵
参数为装料系数O. 7，接种量10%，培养温度32-37"，溶氧30% ±5%，pH 7.4±0. 2，培
养时间为10-16h ;溶氧通过与转速偶联而自控，pH值与酸碱偶联而自控。 所述步骤(4)中，当所述步骤(3)结束后，枯草芽孢杆菌处于对数生长期后期，菌
体活力旺盛，但缺少氮源，此时，加入来源于鱼鳞或鱼皮的胶原蛋白就可诱导蛋白酶大量表
达，同时添加triton-100并提高发酵温度增加细胞膜的透性，促进蛋白酶的分泌。 步骤(3)可产生大量氮源缺乏、但活力旺盛的枯草芽孢杆菌的菌体，在这种情况
下进入步骤(4)，即加入胶原蛋白粉作为诱导物，就可大量诱蛋白酶的表达，这种蛋白酶含有较强的弹性蛋白酶活性，步骤(3)和步骤(4)必须共同使用才能获得大量的、能高效水解 淡水鱼及鱼类加工下脚料的新型蛋白酶。所述步骤(5)中蛋白酶的制剂工艺为发酵液经15000r/m离心10min去除菌体， 加入硫酸铵至饱和度为40%，41:冷藏12h，离心去除沉淀，再次加入硫酸铵使饱和度达到 70%，4°〇冷藏12h，离心收集沉淀，用超滤法去除硫酸铵并截留分子量为30-60kDa的组分， 并浓縮至总蛋白酶活力20000U/mL，加入少量糊精吸附酶液，冷冻干燥保存。
*^效果 本发明采用不含有机氮源的培养基培养枯草芽孢杆菌，获得大量活力旺盛，但氮 源缺乏的枯草芽孢杆菌的菌体，在这种情况下加下来源于鱼鳞或鱼皮的胶原蛋白粉就可大 量诱导蛋白酶的表达；该蛋白酶由于是用胶原蛋白做为诱导物而产生的，因此具有很强的 弹性蛋白酶活性，能高效地水解淡水鱼和鱼类加工下脚料；为了促进蛋白酶的分泌，在加入 诱导物后，加入Titron-lOO并将发酵温度提高2_3°C ，这样可以提高枯草芽孢杆菌细胞膜 的透性，促进蛋白酶的分泌。用该方法发酵蛋白酶，发酵液中弹性蛋白酶活力可达到650U/ mL，总蛋白酶活力可达到2216U/mL ;制成的粉状酶制剂中，弹性蛋白酶活力为5423U/g，总 蛋白酶活力为1.8万U/g ;用该方法生产出的蛋白酶制剂不仅具有较强的弹性蛋白酶活性， 还具有其他特性的多种蛋白酶蛋白酶活性，用于淡水鱼及鱼类下脚料的水解，可显著提高 水解度。 如，在蛋白质浓度为2X，加酶量为400U/g蛋白，适宜温度和pH值(中性蛋白酶的
水解温度为55t:，水解pH为7. 0 ;碱性蛋白酶的水解温度为45t:，水解pH值为8. 0 ;酸性蛋
白酶的水解温度为45t:，水解pH为3. 0 ;本专利所提供的蛋白酶的水解温度为55t:，水解
pH为7. 4)的条件下对5种淡水鱼及罗非鱼下脚料进行水解，当水解达到平衡时，测定水解
产物的水解度，结果如表1所示。在所试验的5种淡水鱼及罗非鱼下脚料的水解试验当中，
用本专利生产的蛋白酶所产生的水解效果都最好。 表1几种蛋白酶水解淡水鱼及鱼加工副产物的比较
7'1^解度/%罗非鱼下脚料鳗鱼罗非鱼鲤鱼鲢鱼草鱼
本专利生产的蛋白酶18.517.223.823.419.226.2
碱性蛋白酶17.114.718.322.816.923.9
中性蛋白酶17.414.616.719.417.321.1
酸性蛋白酶13.211.214.420.112.916.具体实施例方式
实施方式l 本发明是一种可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶生产方法，其工艺步骤包 括(l)菌种活化菌种活化的培养基组成为牛肉膏0.4%，蛋白胨0.6%，酵母膏0.2%，
NaCl 0. 5%，琼脂2%，水分96. 3%， pH7. 5 ;菌种活化的培养温度为37"，培养时间为24h ; (2)种子制备种子制备的培养基组成为牛肉膏0.4%，蛋白胨0.6%，酵母膏0.2%，NaCl 0.5%，水分98.3%， pH7.5 ;摇瓶菌种制备是在250ml的三角瓶中进行的，种子培养基装 量为20ml，种子培养基制备好以后，将新活化的斜面菌苔接种至培养基中，放入摇床中，在180r/m、32t:的条件下培养24h ;车间种子的制备是在种子罐中进行的，培养基的装料系数 为0. 7，接种量为1%，搅拌转速为120r/m，通气量为0. 2vvm，培养温度为32。C，培养时间为 14h ;(3)用不含有机氮源的培养基培养枯草芽孢杆菌至对数生长期，制备枯草芽孢杆菌培 养基，培养基的组成为葡萄糖1%，玉米桨粉0. 2%， K2HP030 . 06%， MgS04 7H20 0.034%， 水分98. 71%;培养基的装料系数为0. 7 ;培养基灭菌并冷却后，以10%的接种量接入菌种， 在发酵温度32"、溶氧30% ±5%、pH 7.4±0. 2的条件下培养12h;(4)加入O. 1%的诱导 物、0. 06X的triton-100，将发酵温度提高至34t:并维持发酵溶氧和pH不变，继续发酵16h 按工艺说明书步骤(5)提取弹性蛋白酶并制备酶粉。(5)蛋白酶的分离与制剂，蛋白酶的制 剂工艺为发酵液经15000r/m离心10min去除菌体，加入硫酸铵至饱和度为40%，41:冷藏 12h，离心去除沉淀，再次加入硫酸铵使饱和度达到70%，41:冷藏12h，离心收集沉淀，用超 滤法去除硫酸铵并截留分子量为30-60kDa的组分，并浓縮至总蛋白酶活力20000U/mL，加
入少量糊精吸附酶液，冷冻干燥保存。
实施方式2 本实施例与第一个实施例基本相同，所不同的是(3)制备枯草芽孢杆菌培养 基，培养基的组成为葡萄糖8%，玉米浆粉1%， K2HP03 0.2%， MgS04* 7H200. 034% ，水分 90. 77% ;培养基的装料系数为0. 7 ;培养基灭菌并冷却后，以10%的接种量接入菌种，在发 酵温度37"、溶氧30% ±5%、pH 7.4±0. 2的条件下培养16h(4)加入O. 1%的诱导物、 0. 06 %的triton-100，将发酵温度提高至4(TC并维持发酵溶氧和pH不变，继续发酵16h按 工艺说明书步骤(5)提取弹性蛋白酶并制备酶粉。
实施方式3 本实施例与第一个实施例基本相同，所不同的是(3)制备枯草芽孢杆菌培养基， 培养基的组成为:葡萄糖4. 5%，玉米浆粉0. 6%，K2HP03 0. 13%，MgS04*7H20 0.034%，水分 94. 74% ;培养基的装料系数为0. 7 ;当培养基灭菌并冷却后，以10%的接种量接入新培养 的种子，在发酵温度37。C、溶氧30% ±5%、pH 7.4±0. 2的条件下培养14h后，加入0. 1% 的诱导物、0. 06%的triton-100，将发酵温度提高至37。C并维持发酵溶氧和pH不变，继续 发酵16h按工艺说明书步骤(5)提取弹性蛋白酶并制备酶粉。
实施方式4 本实施例与第一个实施例基本相同，所不同的是(3)制备枯草芽孢杆菌培养基， 培养基的组成为葡萄糖7. 4%，玉米浆粉0. 66%，K2HP03 0. 15% ， MgS04 7H20 0. 034%，水 分91.76% ;培养基的装料系数为0.7 ;当培养基灭菌并冷却后，以10%的接种量接入新培 养的种子，在发酵温度37"，、溶氧30% ±5%、pH 7.4±0.2的条件下培养12h后；(4)加 入0. 1%的诱导物、0. 06 %的triton-100，将发酵温度提高至37。C并维持发酵溶氧和pH不 变，继续发酵16h按工艺说明书步骤(5)提取弹性蛋白酶并制备酶粉。
权利要求
一种可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶的生产方法，其工艺步骤包括(1)菌种活化；(2)种子制备；(3)用不含有机氮源的培养基培养枯草芽孢杆菌至对数生长期；(4)加入从鱼鳞或鱼皮中提取的胶原蛋白诱导蛋白酶的产生，添加triton-100并提高发酵温度促进蛋白酶的分泌，这样可以在短期内产生大量的蛋白酶，该蛋白酶具有很强的弹性蛋白酶活性；(5)蛋白酶的分离与制剂。
2. 根据权利要求书l所述的可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶的生产方法，其 特征在于所用的菌种为枯草芽孢杆菌，所生产的蛋白酶具有很强的弹性蛋白酶活性。
3. 根据权利要求书1所述的可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶的生产方法， 其特征在于所述步骤(3)中所用的培养基组分为葡萄糖1-8 %，玉米浆粉0.2-1%， K2HP030 . 06-0 . 2 % ， MgS04* 7H20 0. 034%，余量为水；发酵参数为装料系数O. 7，接种量 10%，培养温度32-37。C，溶氧30% ±5%，pH7. 4±0. 2，培养时间为10_16h ;溶氧通过与转 速偶联而自控，pH值与酸碱偶联而自控。
4. 据根权利要求书l所述的可高效水解淡水鱼及鱼类下脚料的蛋白酶生产方法，其特 征在于所述步骤(5)中蛋白酶的制剂工艺为发酵液经15000r/m离心10min去除菌体， 加入硫酸铵至饱和度为40%，41:冷藏12h，离心去除沉淀，再次加入硫酸铵使饱和度达到 70%，4°〇冷藏12h，离心收集沉淀，用超滤法去除硫酸铵并截留分子量为30-60kDa的组分， 并浓縮至总蛋白酶活力20000U/mL，加入少量糊精吸附酶液，冷冻干燥保存。
全文摘要
本发明公开了一种新型蛋白酶的生产方法，用该方法生产出的蛋白酶具有较强的弹性蛋白酶活性，能高效地水解淡水鱼及鱼类加工下脚料。该蛋白酶的生产方法可概述为用不含有机氮源的培养基培养枯草芽孢杆菌至对数生长期，加入从鱼鳞或鱼皮提取的胶原蛋白及triton-100，将发酵温度提高2-3℃，继续发酵16h，弹性蛋白酶活力可达到650U/mL，总蛋白酶活力可达到2216U/mL；提取蛋白酶并制成粉状酶制剂，该酶制剂的总蛋白酶活力为1.8万U/g，弹性蛋白酶活力为5423U/g；用该蛋白酶制剂对淡水鱼及鱼类加工下脚料进行水解，可大大提高水解效率。
文档编号C12N9/66GK101705219SQ20091011285
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年11月12日
发明者倪辉, 李利君, 杨远帆, 肖安风, 蔡慧农 申请人:集美大学