川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用的制作方法

专利名称：川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及川西獐牙菜药效成分相关基因一一香 叶醇-10羟化酶基因5)7^7/^及其应用。
背景技术：
高寒藏药材川西獐牙菜(Swer"a MW50"i Franch)系龙胆科(fe""朋aceae)、獐 牙菜属(5Ver"'a)，为青藏高原特有种，俗称"藏茵陈"。生长在青藏高原海拔3600 — 3800米的山坡、灌丛草地、林缘、河滩，以通天河畔两岸最为集中。其含有黄酮武(f lavonoid glycoside)、三萜香豆精微量生物碱、当药黄素、芒果甙、齐墩果酸、苦龙胆甙，还有八 种山酮成份。作凉、糙、味苦，有清肝利胆、退诸热之功能。用于黄疽性肝炎、病毒性肝 炎以及血病、胃病、退烧、缓泻、消化不良、急性骨髓炎、急性菌痢、结膜炎、咽喉炎及 烫伤、胆囊炎、血虚头晕、高血压、月经不调等，并有滋补作用。其有效成分主要为齐墩 果酸，獐牙菜苦甙(Swerti柳arin)等，野生资源极其匮乏。
獐牙菜苦苷味苦、性寒，归肝、胆、肾经，具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、抗突变以 及调节免疫系统，降血脂和胆固醇等一系列药理作用。獐牙菜苦苷为环烯醚萜类化合物， 从GPP(活性焦磷酸香叶酯)合成开始，其代谢途径框架基本清楚，但其完整的生物合成步 骤尚未探明。香叶醇-10羟化酶(geraniol 10-hydroxylase , G10H)属于P450单加氧酶， 能够催化香叶醇C10位的羟基化，使香叶醇再次酶的作用下生成10-羟基香叶醇。此类酶 能够催化环烯醚萜类化合物以及几类单萜生物碱类的合成，已经在不同生物物种中发现此 酶，目前国内外焦点主要集中在长春花中的G10H上。在一些物种中环烯醚萜类化合物作 为一种主要的中产物而积累，而在其他一些植物中则进一步代谢形成不同种类的单萜类生 物碱，例如喹啉，四氢异喹啉类生物碱。由于生物碱类化合物在川西獐牙菜相关药效成分 中并不占主流成分，因此我们认为此酶在此可能为合成环烯醚萜类化合物的关键酶。
P450单加氧酶基因为一个超基因家族，在植物的P450超家族中又分为127个亚家族， 而亚家族成员间的氨基酸同源性一般情况下>55%。但是，由于植物P450的底物多样性和
其酶功能的多样性，使其亚家族成员间在酶活力和催化等功能上也不尽相同。本发明中的 川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5^"W私隶属于植物P450中的76亚家族，与本家族其 他成员间的核苷酸同源性最大为75.87%。该基因5i^70Z/所表达的蛋白在C端有着与其他 亚家族成员不同的信号肽，可能导致其在细胞中的定位不同于其他亚家族成员所编码的蛋 白在细胞中的定位。另外，该基因5M ^^所表达蛋白的酶活力明显高于已报道的植物P450 的76亚家族其他成员的酶活力。综上所述，本发明所报道的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶 基因5"/^7^/非等同于其亚家族其他成员，具有一定的特异性。

发明内容
本发明的目的是提供一种獰牙菜苦苷相关基因一一香叶醇-10羟化酶基因5M^fl^及 其应用。
本发明的技术方案是从川西獐牙菜中分离得到香叶醇-10羟化酶基因5i^7^W，体 内实验证明其功能，然后在真核系统中验证功能，最后将该基因转到原植株川西獐牙菜 中得到獐牙菜苦苷含量高的转基因植株。
3本发明提供的基因名称为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5M^〖W，所述基因cDNA 序列如序列表SEQ ID No. 1所示。
本发明还提供了一种含上述的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5^WW/的酵母表达 载体pPICZA，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种含上述的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5fe67^^的植物表达 载体pROKII，其特征在于所述植物表达载体核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明所述香叶醇-10羟化酶基因5)/^^//在酵母或植株中表达香叶醇-10羟化酶 和提高獐牙菜苦苷含量的应用。其中所述酵母是毕赤酵母；所述植株是川西獐牙菜。
首先在川西獐牙菜植株中克隆到了香叶醇-IO羟化酶基因5"范676^然后通过转化 的方法在大肠杆菌中得到大量克隆，接着通过双酶切把此基因5M7/(W连接到酵母表达 载体pPICZA上，并在酵母上表达；接着筛选转基因酵母，并提取川西獐牙菜香叶醇-10 羟化酶基因5^W^/在酵母中表达的SmG10H蛋白提取液，加入底物香叶醇，使其催化 成10-羟基香叶醇，通过LC/MS的方法检测此催化反应的生成物，从而验证异源表达 的SmG10H的功能。
其次将川西獐牙菜植株中克隆到了香叶醇-10羟化酶基因5"/^7^/通过转化的方法在 大肠杆菌中得到大量克隆，接着通过双酶切把此基因5"/^7^/连接到植物表达载体PR0K II;将此携带基因5i^/(W的植物表达载体PR0Kn转化进原植株川西獐牙菜中，通过该基 因的过表达使獐牙菜苦苷含量得到大的提高，而獐牙菜苦苷的含量是通过HPLC方法测定。
本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了川西獐 牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H并在毕赤酵母中进行表达，使转基因酵母获得了非转 基因酵母所不具备的催化香叶醇为10-羟基香叶醇的能力。通过基因枪转化的方法将该基 因转入原植株川西獐牙菜中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的獐牙菜 苦苷含量可提高1倍以上。本发明为环烯醚萜类化合物獐牙菜苦苷的代谢途径中io-羟基 香叶醇的积累起到了关键性的作用，为提高川西獐牙菜植株中药效成分獐牙菜苦苷的积 累起到了关键性的作用。


图1为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5i^JC^的cDNA电泳图，其中泳道1为基 因的cDNA， M为Marker 。
图2为转基因川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5fe6^W的DNA鉴定图，其中泳道 M为Marker,泳道1、 5、 8、 10、 11、 12均为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5feW(W 阳性DNA。
图3为川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5M77(W在转基因毕赤酵母和川西獐牙菜植 株中表达，通过LC/MS进行的功能验证。10-羟基香叶醇保留时间为8.3分钟，分子量为 171.4;香叶醇保留时间为11.6分钟，分子量为153.2; A，为标准品，购自Sigma公司； B，川西獐牙菜的SmG10H提取蛋白液在加入香叶醇后的反应液；C，为转基因毕赤酵母的 SmG10H提取蛋白液，在加入香叶醇后的反应液；D，为A， B和C中保留时间为8. 3分钟时 的保留峰的质谱图，即10-羟基香叶醇的质谱图。
图4转基因的川西獐牙菜愈伤组织再生植株。
图5为转基因的川西獐牙菜植株和原生植株中獐牙菜苦苷含量变化的HPLC分析图。 其中獐牙菜苦苷保留时间为15. l分钟，分子量为374.34。 A，为獐牙菜苦苷标准品；B,为原生植株中的獐牙菜苦苷；C,为转基因的川西獐牙菜植株的獐牙菜苦苷。
具体实施例方式
实施例l、 5to67《W的克隆 l.l川西獐牙菜总RNA的提取
(1) 川西獐牙菜材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研 磨过程中要保证材料浸在液氮中。
(2) 待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1 ml TRIZ0L溶液，混匀后，于室温放置5 min， 12000r/min, 2-8。C离心10min去沉淀。
(3) 每l ml TRIZ0L溶液中加入0.2 ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置 5 min， 12000r/min, 2-8。C离心15min。
(4) 取上清，每lml TRIZ0L加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10 20min。
(5) 2-8°C 12000 r/min离心10min，弃上清。
(6) 加l ml 75%乙醇洗涤沉淀2次，4。C不超过7500r/min离心5min，弃上清。
(7) 室温放置晾干后，加入15wl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。 1. 2逆转录合成第一链cDNA
(1) 0.2ral Eppendorf管中，加入下列成分
用DNaseI纯化的上述总RNA (0. lug/yl) 2.0ul Olige (dT) anchored primer (2 y M) 2. Oyl
(2) (TC水浴变性10分钟，立即置于冰浴中。
(3) 在10u 1反应体系中加入下列成分2. Oul 5XMMLV RT buffer; l.Oul 250 umol/L dNTP mix;O. 25ul Rnasin;O. 5y 1 (200u/P 1)廳LV逆转录酶；2ul上述RNA 变性液。42。C进行逆转录反应lhr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。
1.3 PCR
以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。
(1) PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成
引物P0:5' — AAACTTCCWCCAGGDCCAT 一 3' 引物P1:5' — CAGCACCAAATGGAATCAGC - 3' W-A/T D=T/A/G
(2) PCR反应体系
10 X PCR buffer 1MgCl2(25mmol/L) 1.5yl
dNTP(each 250 P mol/L) 0. 2 y 1
P0 (10y mol/L) 1 u 1
PI (10 u mol/L) lu 1
逆转录第一链产物 4ul
Ex Taq 0. 2 y 1
无菌水 10. 1 y 1 (3) PCR反应程序
94°C 3min; 94°C 30sec， 51" 30sec， 72°C 1.5min， 35个循环；最后72°C延伸 lOtnin。 PCR产物电泳如图1所示。
1.4 5' -RACE
按照TaKaRa5' -Full RACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳5' -RACE产物。 1.5目的片段的回收
(1) 用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1.5mlEppendorf管中。
(2) 称重，加入3-4倍体积的DR-1 Buffer, 65。C加热lOmin融化胶块，每隔2min 混匀一次保证胶块能充分融化。
(3) 加入DR-1 Buffer量的1/2体积的DR-IIBuffer，均匀混合。
(4) 将Spin Cloumn安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column 中，5000rpm离心lmin，弃滤液。
(5) 将500 y 1 Rinse A加入Spin Column中，5000rpm离心lmin，弃滤液。
(6) 将700ul Rinse B加入Spin Column中，5000rpra离心lmin，弃滤液。
(7) 重复步骤6，然后12000rpm再离心lmin。
(8) 将Spin Cloumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Cloumn膜的中央处加 入预热到60'C的25ii 1的水或洗脱缓冲液，室温静置lmin。
(9) 12000rpm离心lmin洗脱DNA。
(10) 重复步骤9， 2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检査 回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5. 3)和2倍体积的无水乙醇，-2(TC沉 淀lhr。
(11) 然后4。C, 12000rpm离心15min,用70%冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40 P1无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。
1. 6连接用上述的回收目的片段与pMD18-T载体(购自TAKARA有限公司，下同)按摩尔比约 ]:1的比例进行连接，连接体系如下 一
目的片段 7ul
T-vector 1 ti 1
10XT4腿Ligase Buffer lu 1
T4 DNA Ligase 1 n 1
混匀并短暂离心，16'C连接过夜。得到重组质粒pGEM-G6^,用于后面的反应。
L 7 CaCh法制备感受态细胞
(1) 挑取DH10B单菌落接种于5ml LB (购自TAKARA有限公司，下同)液体培养基 中，37'C振荡培养过夜。
(2) 按l: 100-1: 50的比例，取lml菌液接种于100mlLB液体培养基中，37'C振 荡培养至菌液OD卿为0. 3-0. 6。
(3) 将菌液冰浴10min， 4'C 4000rpm离心10min，收集菌体。
(4) 沉淀加10ml预冷的0. 1M CaCl2悬浮后，冰浴30min。
(5) 4。C4000rpm离心1Qmin。沉淀重悬浮于lml预冷的0. lMCaCl2，混匀并冰水浴 中保存，备用或加入15%的甘油置于-7CTC中保存。
1. 8热击法转化￡ coh' DH10B
(1) 在无菌条件下吸取100 y 1感受态细胞，加入1. 5ml预冷的无菌E卯endorf管 中，加入10yl连接产物(1.6中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。
(2) 在42'C恒温水浴中热激90sec (准确记时)。
(3) 冰浴3-5rain。
(4) 加入800u 1不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37'C振荡培养45-60min。
(5) 短暂离心收集菌体，用150ul LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素A卿、 X-gal、 IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。
(6) 将平板于37。C正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37'C培养 12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。
1.9碱裂解法提取大肠杆菌质粒 '
(1) 挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时 也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素A卿(50mg/L)的固体LB平板中，37'C震荡培养 12-16h;
(2) 12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；
7冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；
(4) 加入2(X)y l溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10ii]in;
(5) 加入150u.l冰预冷的溶液in，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成， 冰浴5-10min;
(6) 12000rpm离心3min,取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95%乙醇， 混匀后，室温静置3 min;12000rpra离心3min，使质粒DNA沉淀；
(7) 弃尽上清，取200 u 1 TE溶液溶解沉淀；
(8) 加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA;
(9) 12000rpm，离心3min;
(10) 转移上清到另 一离心管中，加入2倍体积的95%乙醇，混匀后于室温静置3min ， 12000rpra离心3min使质粒沉淀；
(11) 弃上清后用lml 70%乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；
(12) 室温千燥后，取20u 1含RNaseA(20u g/ml)的TE溶液溶解沉淀，37。C水浴 30 60min消化RNA。
(13) 为减少损失，可先用TE将总体积补充至200ul，加入等体积的酚-氯仿-异 戊醇，充分振荡5-10min， 12000rpm离心5min;
(14) 取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；
(15) 取上清，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠(pH5. 3)和2倍体积的无水乙醇， 混匀后-20。C放置15min， 12000rpm离心3min使质粒沉淀；
(16) 弃上清用lml 70%乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40ul TE或无菌水溶解沉淀。 质粒用于后面的反应。
1. 10质粒酶切验证
用EcoRI酶切上述质粒，酶切反应体系如下表所示
重组质粒pMD18-t-5feW^W 16 u 1
EcoRI限制性内切酶 2ul
10 X Buffer 2"
将上述反应体系混匀并5000rpm离心lrain， 37'C水浴反应过夜，然后进行W的TAE琼 脂糖凝胶电泳检测。
1. 11 DNA测序
挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海 博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果基因cDNA序列如序列表SEQ ID No. 1所示。
8经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与长春花的67fW的核苷酸同源75.87%。，证明实
验得到的就是川西獐牙菜香叶醇-io羟化酶基因，命名为川西獐牙菜香叶醇-io羟化酶基
实施例2、在酵母中表达的川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5^67〖肝的功能验证
2. 1酵母表达载体的构建 2. l.l目的基因的获得
(1) 引物设计设计一对PCR扩增带EcoRI和Kpnl酶切位点都6M^0〃基因。 P2: 5'- GAATTCATGGATTTTGATTTCCTCACC - 3'
EcoRI
P3: 5' - GGTACCTCACAGAGGAGTCGCAACA - 3' Kpnl
(2) PCR反应体系
10XPCR buffer1
MgCl2(25mmol/L)1.5ii 1
dNTP(each 250umol/L)0. 2y 1
P2 (4践ol/L)lu 1
P3 (4ytn。l/L)ly 1
重组质粒pMD18-T-S^/fl^lwl
Ex Taq (TalaRa)0. 2u I
无菌水13. 1 u 1
(3) PCR反应条件为
94。C 3tnin; 94。C 30sec, 55°C 30sec， 72°C 1. 5min, 35个循环；最后72°C延伸10min。 PCR产物电泳回收后用于后面的反应。 2. 1.2表达载体的构建步骤
引入酵母表达载体pPICZA(购自Irwitrogen有限公司，下同)，该载体上含有中所含 有EcoR和KpnI两个酶切位点。
将带有EcoR和KpnI酶切位点的cDNA与质粒分别进行EcoR和KpnI的双酶切，再按照5:1 的比例在T4连接酶的催化下进行连接16小时以上。反应体系及条件如下
(1) cDNA酶切反应体系和条件
c腿/EcoR+Kpnl 6 u 1
EcoR 1 u 1
Kpnl 1 u 1
10 XM Buffer 2 y 1
37 °C 16h;
(2) 质粒酶切反应体系和条件
pPICZA质粒 6 y 1
EcoR 1 u 1
Kpnl 1 w 1
10XM Buffer 2 u 1
937 。C 16h;
连接反应用T4 DNA Ligase进行，体系和条件同T载体的连接体系和条件。用连接产 物转化大肠杆菌，从Zeocin抗性的菌落中筛选出重组子，得到酵母表达载体pP工CZA-5)ffW^/。提取阳性克隆pPICZA-5)HW朋的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条 件同鉴定重组子。 2.2 DNA导入酵母
(1) 挑取酵母菌株(毕赤酵母)的单克隆，接种至10ml液体YPD (购自Invitrogen有限 公司，下同)培养基，3CTC， 200rpm，培养2-3天；
(2) 按照l: 50的比例将菌液转移至50ml YPD液体培养基中3(TC， 200rpm，培养3 5h， 此时的菌液OD 0. 4 0. 6。
(3) 将菌液分装至10ml无菌离心管巾，每管5ml;
(4) 3000rpm离心5min，收集细胞。用2.5ml无菌ddH20重悬菌体；
(5) 3000rpm离心5min，收集细胞。用O. lml 100mM (IX) LiAc/TE buffer重悬菌体;
(6) 3000rpm离心l 2min沉淀细胞(仅需将菌体离心至离心管底即可)，用微量移液 器小心吸走上清；
(7) 用50yl lOOmM (IX) LiAc/TE buffer重悬菌体，将菌悬液移至灭菌的1.5ml Eppendorf管中；
(8) 将lml单链担体DNA煮沸5min，快速在冰水中冷却；(注无需每次使用时都煮沸 担体DNA,可分装成小份冻存；冻融3 4次后应再煮沸，取出后应保持在冰上)
(9) 将步骤7准备的样品，3000rpm离心l 2min沉淀细胞，用微量取样器小心吸走上
清''
(10) 按下列顺序加入240 ill PEG (50%w/v)(加入后用枪头上下吹打，尽量将菌 体悬浮)；36u 1 1M(10X)LiAc; 25u 1单链担体DNA(2. Omg/ml)50u l水和质粒DNA(O. 1 lOyg)(—般情况下，质粒加入10 40ul即可)；
(11) 涡旋振荡Eppendorf管lmin，直到细胞完全混匀，3(TC水浴30min;
(12) 42。C水浴中热激20 25min;
(13) 5000rpm离心l 2min，用微量移液器除去转化混合液；
(14) 吸取0.2 1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器轻轻抽提以悬浮沉淀；
(15) 取50yl转化液，均匀涂布在含卡那霉素抗性的培养基上，30。C培养2 4d。用 未转化的酵母做对照。
2.3酵母重组子的鉴定 2.3. 1菌落PCR鉴定初筛
(1) 平板上的菌落长到肉眼可见时。
(2) 将除了模板以外的其他PCR反应液组分准备好，并分装。
(3) 用一根灭菌牙签挑取菌落，在PCR管中测一下，放入一个灭菌的1.5ml离心管，对 、PCR管和1.5ml离心管编号。
(4) PCR扩增，0.8%琼脂糖凝胶电泳。对PCR扩增显现特异性条带的克隆，置于1.5ml 离心管中的半截牙签扔到5mlYTO培养基中，3(TC培养，24±1小时提取DNA，用DNA作为 模板再进行PCR进一步确定。
PCR反应体系及条件如下
1010XPCR buffer MgCL(25,ol/L)
1. 5u 1
dNTP(each 250iimol/L)
0. 2n 1 lu 1 lu 1 1p 1
P2 (4iimol/L) P3 (4umol/L) 菌液
rT叫 (TaKsRa) 无菌水
0. 2p 1
13. ly 1
PCR反应条件为
94。C 5rain; 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C 1.min，35个循环；最后72。C延伸10m]'n。 2.3.2酵母总DNA为模板进行二次鉴定 酵母基因组的提取
(1) 接种重组和空质粒转化子于5ralMD (购自Invitrogen有限公司，下同)培养基， 接菌于YTO培养基作对照，30'C,培养16-18小时。
(2) 室温下，1500g离心5-10min收集菌体。
(3) 100uL TE( pH7. 0)重悬后1500g离心5-10min收集菌体。
(4) 用2ml的SCED(PH7. 5)重悬。
(5) 加入l 3mg蜗牛酶，37°C， 50min。
(6) 加入2ml 1% SDS，轻摇混匀，然后置于冰上5rain。
(7) 加入1.5ml 5M醋酸钾，轻轻混匀。
(8) 10000g离心5-lOmin，弃上清。
(9) 加入2倍体积无水乙醇，室温放置15min。
(10) 10000g离心20min，弃上清。
(11) 加入0.7miTE缓冲液。
(12) 加入等体积的苯酚:氯仿(l:l V/V).
(13) 加入1/2体积的7.5M醋酸铵溶液。
(14) 加入2倍体积的无水乙醇，-20'C放置lhr。
(15) 10000g离心20min。
(16) 加入lml 75°/。乙醇漂洗沉淀一次。
(17) 干燥后，加入50ul的TE或H20溶解，-20。C备用。
PCR反应体系的组成和反应条件同菌落PCR， PCR产物O. 8%琼脂糖凝胶电泳分析。PC'R 产物电泳如图2所示。
2. 4转基因酵母中5"/^/〖W基因表达及生成SmG10H蛋白的功能验证 ' 2. 4. l转基因酵母的培养
(1) 挑取阳性酵母单克隆菌落，置于含有25mlMGYH (购自Invitrogen有限公司， 下同)的250ml三角瓶中，于28'C转速为250rpm的培养箱中培养，直到菌体浓度达到 0D6M=2。
(2) 收集细胞培养液，在室温下于1500Xg离心5分钟。弃上清液并重悬菌体于 MMH (购自Invitrogen有限公司，下同)培养基中，调整菌体浓度到0D6。。=1 。
(3) 把重悬的菌体放置于1L的三角瓶中，瓶口用两成无菌纱布覆盖，重新置于培养箱中培养48小时。
(4) 平均每24小时加入100%的甲醇溶液至终浓度为0. 5% 2. 4. 2转基因酵母中SmG10H的蛋白提取
(1) 取上述酵母细胞培养液10ml，在室温下10000Xg离心1分钟，去除上清液。
(2) 收集沉淀，并置于研钵中，加入液氮研磨10分钟。
(3) 研磨后的细胞破碎物迅速加入0'C预冷的抽提液[50 mM磷酸氢二钾缓冲液 (pH 7. 6)含有0. 5 M蔗糖，1 mM EDTA, 1 mM DTT and 10 u M亮肽酶素；2 mL/g鲜 重]，冰浴5分钟。
(4) 上述细胞混合液通过48咖孔径的尼龙膜过滤后，在4° C 200Xg离心20分钟。
(5) 去除上清液，收集沉淀，在4° C 20000Xg离心60分钟。
(6) 去除上清液，.收集沉淀，并重悬于等体积的储存液中[50 mM磷酸氢二钾缓冲 液(pH 7.6)，含有30% (v/v)丙三醇，1 mM EDTA， 1 mM DTT and 10 y M亮肽酶素]。
(7) 冻存于-80° C，直到需要时取出。 2. 4. 3转基因酵母中SraG10H反应体系的配制
(1) 取上述冻存液于冰浴融化，在4° C 20000 Xg离心10分钟。
(2) 去除上清液，收集沉淀，于100ng/550ul的比例重悬于孵育液中[50mM磷酸氢 二钾缓冲液(pH 7.6)，含有l niMEDTA, 1 mM DTT, 10 y M FAD和10uM FMN]。
(3) 在孵育液中加入l U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，4.5 raM6-磷酸葡萄糖，1 mM MDP+。
(4) 取550y l的孵育液作为反应液，之后在3(T C的条件下静置5分钟。
(5) 在反应液中加入l慮的香叶醇作为底物反应物，在3(T C的条件下反应30分钟。
(6) 加入3ml的乙酸乙酯终止反应，震荡反应体系2分钟，混匀，静置5分钟。
(7) 在真空浓缩仪中室温下干燥掉乙酸乙酯层，残余液中加入150n l甲醇，制备为 液相质谱前液。
2. 4. 4 LC/MS验证转基因酵母中SmG10H的功能
(1) 上述反应液，室温下10000Xg离心10分钟，取上清于一干净的新离心管中。
(2) 上清液通过48 ,孔径的尼龙膜过滤，-20° C冻存。
(3) 冻存液室温下融化，上样量为4ri进行LC/MS分析。
(4) 色谱条件为流动相甲醇水=60: 40，流速lml/min，检测波长为210nm。 LC/MS仪器为美国ABI公司提供的API4000型，色谱柱由Agela Technologies公司提供 的Venusil柱，柱参数为C 18; 5陶46 mm X250咖。
LC/MS分析如图3所示，证明川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5^GM/Z能够在酵母 中表达并生成有酶活力的蛋白SmG10H，此蛋白酶能够催化香叶醇加羟基生成10-羟基香 叶醇。10-羟基香叶醇保留时间为8.3分钟，分子量为171.4;香叶醇保留时间为11.6 分钟，分子量为153.2; A，为标准品，购自Sigma公司；C，为转基因毕赤酵母的SmG10H 提取蛋白液，在加入香叶醇后的反应液；D,为A和C中保留时间为8.3分钟时的保留峰
的质谱图，即io-羟基香叶醇的质谱图。
实施例3、川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因5iHG7(W的功能验证
3. 1川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SwWtW的功能验证3. 1. 1川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶SmG10H的蛋白提取
(1) 取川西獐牙菜植株，置于研钵中，加入液氮研磨10分钟。
(2) 研磨后的细胞破碎物迅速加入0° C预冷的抽提液[50 mM磷酸氢二钾缓冲液 (pH 7.6)含有0.5 M蔗糖，1 mM EDTA， 1 mM DTT and 10 yM亮肽酶素；2 mL/g鲜 重]，冰浴5分钟。
(3) 上述细胞混合液通过48隱孔径的尼龙膜过滤后，在4° C 200Xg离心20分钟。
(4) 去除上清液，收集沉淀，在4° C 20000Xg离心60分钟。
(5) 去除上清液，收集沉淀，并重悬于等体积的储存液中[50 mM磷酸氢二钾缓冲 液(pH 7.6)，含有30% (v/v)丙三醇，1 mM EDTA， 1 mM DTT and 10 u M亮肽酶素]。
(6) 冻存于-80。 C，直到需要时取出。
3. 1. 2川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶SmG10H反应体系的配制
(1) 取上述冻存液于冰浴融化，在4° C 20000Xg离心10分钟。
(2) 去除上清液，收集沉淀，于100y g/550y l的比例重悬于孵育液中[50mM磷酸氢 二钾缓冲液(pH 7.6)，含有l mMEDTA， 1 mM DTT， 10 uM FAD和10iiM F腦]。
(3) 在孵育液中加入l U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，4.5 mM6-磷酸葡萄糖，1 mM NADP+。
(4) 取550u l的孵育液作为反应液，之后在3(T C的条件下静置5分钟。
(5) 在反应液中加入l mM的香叶醇作为底物反应物，在30° C的条件下反应30分钟。
(6) 加入3ml的乙酸乙酯终止反应，震荡反应体系2分钟，混匀，静置5分钟。
(7) 在真空浓縮仪中室温下干燥掉乙酸乙酯层，残余液中加入150ul甲醇，制备为 液相质谱前液。
3. 1. 3 LC/MS验证川两獐牙菜香叶醇-10羟化酶SmG10H的功能
(1) 上述反应液，室温下10000Xg离心IO分钟，取上清于一干净的新离心管中。
(2) 上清液通过48咖孔径的尼龙膜过滤，-20° C冻存。
(3) 冻存液室温下融化，上样量为414进行LC/MS分析。
(4) 色谱条件为流动相甲醇水=60: 40,流速lml/rain，检测波长为210nm。 LC/MS 仪器为美国ABI公司提供的API4000型，色谱柱由Agela Technologies公司提供的 Venusil柱，柱参数为C 18; 5陶；46 , X250 mm。
LC/MS分析如图3所示，证明川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因5feWW/能够 表达并生成有酶活力的蛋白SmG10H，此蛋白酶能够催化香叶醇加羟基生成10-羟基香叶 醇。10-羟基香叶醇保留时间为8. 3分钟，分子量为171. 4;香叶醇保留时间为11. 6分钟， 分子量为153.2; A,为标准品，购自Sigma公司；B，川西獐牙菜的SmG10H提取蛋白液在 加入香叶醇后的反应液;D，为A和B中保留时间为8.3分钟时的保留峰的质谱图，gP 10-
羟基香叶醇的质谱图。
实施例4、植物表达载体的构建
4.1目的基因的获得
引物设计及PCR反应的体系和条件 (1)设计如下一对PCR扩增引物，引入植物表达载体pROKII (购自宝生物工程有 限公司)中所含有的两个酶切位点Sacl和Xball。P4: 5'- CGAGCTATGGATTTTGATTTCCTCA- 3' Sacl
P5: 5' - TCTAGATCACAGAGGAGTCGCAACA - 3
Xball 〔2) PCR反应体系
10XPCR buffer2u 1
MgCl2(25,l/L)1. 5y 1
dNTP(each 250ymol/L)0. 1
P4(4y mo丄/L)lu 1
P5(4timol/L)ly 1
重组质粒pMD18T-AS7liU
rTaq (TaKaRa)0. 2u 1
无菌水13. In 1
(3) PCR反应条件为
94。C 5min; 94°C 30sec, 60°C 30sec， 72°C 1. 5min， 35个循环；最后72°C延伸7min。 PCR产物电泳回收后用于后面的反应。 4.2表达载体的构建
将带有SacI， Xball酶切位点的cDNA与质粒分别进行Sacl和Xball的双酶切，再 按照5:1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下
(1)酶切反应体系和条件
cDNA /Sacl+Xba11 6u 1
Sacl 1 u 1
10 X Buffer 2H 1
ddH20 1 U 1 上表体系30 'C lh，下表体系37。C lh
原反应液 ioyi
Xball 1"
0.1%BSA 2 u 1
0. l%TritonX-100 2nl
10 X Buffer 2u 1
ddH20 3 u 1
14(2)质粒酶切反应体系和条件
pR0KII质粒 6ul
Sacl 1 ii 1
10 X k Buffer 2 ix 1
ddH20 1 u 1上表体系30 °C lh,下表体系37。C lh
原反应液 10 Hi
Xball lyl
0.1%BSA 2 P 1
0. l%TritonX-100 2]i 1
10 X H Buffer 2y 1
ddH20 3 u 1
连接反应用T4 DNA Ligase进行，体系和条件同pMD18-T的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，提取阳性克隆pROK-5) 7^(W的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。
4. 3测序
将含有重组质粒的阳性菌株送上海博亚生物技术有限公司测序，得到的测序结果经过NCBIblast分析，阳性质粒中确实含有川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因5觅67fl^cDNA序列。至此得到了重组表达载体，即含基因5bW朋的植物表达载体pR0K-5"/^/^/。实施例5、基因枪转化川西獐牙菜植株中香叶醇-10羟化酶基因5feWC^
5. 1基因枪转化方法
转化使用继代两周的川西獐牙菜胚性愈伤组织。在微弹轰击之前转至含有渗透剂的MS继代培养基上于黑暗、26'C保温4h进行高渗处理。渗透剂为甘露醇，浓度采用O. 4mol/L。将2mg金粒(直径l u m)、质粒DNA各2. 5 u 1 (1 u g/ u 1) 、 25 u 1亚精胺(0. lmol/L)和50iU CaC12 (215mol/L)混合，涡旋或超声波处理多次使之均匀，10000r/min离心5s后去上清，沉淀用250ul乙醇洗涤并重新悬浮于240n 1乙醇溶液。将包被有DNA的金粒悬浮液涂于微弹承载片，每片涂3. 5 IX 1 ，放置几分钟干燥后用于基因枪轰击;每次涂液前将悬浮液旋涡处理使之均匀。每次轰击的微弹量约2912y g。基因枪型号为PDS1000PHe(BioRad)，气压采用1100psi。5. 2培养选择和再生体系
轰击后16h将胚性愈伤组织块从高渗培养基移至含600mg/mlKan的IB继代培养基上进
15行筛选，将褐色和黑色愈伤去掉，最终获得绿色再生植株。5.3 CTAB法提取转基因植株基因组DNA
(1) 称取0.5g的再生植株叶片，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700y l预热至65"的2xCTAB提取缓冲液及0. 1%的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65'C水浴保温2h，不时颠倒混匀。
(2) 混合物冷却至室温后加入等体积的酚氛仿异戊醇(25:24:1)， 4'C下10000g离心10min。
(3) 将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(24:1), 4'C下10000g离心10min。
(4) 将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-2(TC放置30min沉淀DNA。
(5) 4。C下10000g离心10min，弃去液体，并用70%乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100闪含无DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37。C水浴30min
(6) 加入200ul无水乙醇，温和混匀，-2(TC放置30min沉淀DNA. 4"下10000g离心10min，弃去液体，并用70%乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40y 1无菌水溶解DNA， 4
x:保存待用。
5. 4 PCR检测转基因植株
以CTAB法提取的DNA为模板，PCR法扩增以35S启动子片段。
35S片段启动子引物序列
35SS:5' -GCAGAGGCATCTTCAACG-3'
35SA:5， -GACGATCTACCCGAGCAA-3'
(1) PCR反应体系
10XPCR buffer 2u 1
MgCl2(25,l/L) 1.5ul
dNTP(each 250 y mol/L) 0. 2 u 135SS(4nmol/L) lnl35SA(4iimol/L) 1"DNA模板 1 P 1
rTaq (TaKaRa) 0. 2 u 1
无菌水 13. lnl
(2) PCR反应程序94°C 5min; 94°C 30sec, 53。C 30sec， 72。C 2min, 35个循环;最后72。C延伸7min。反应结束后，反应液于O. 8y。TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例6、转化后阳性再生植株獐牙菜苦苷测定
(1) 转化后筛选得到的阳性植株经液氮研磨后加入10ml氯仿，超声40min
(2) 上述反应液，室温下10000Xg离心IO分钟，取上清于一干净的新离心管中。
(3) 上清液通过48 mm孔径的尼龙膜过滤，-20° C冻存。
(4) 冻存液室温下融化，上样量为20)4进行LC/MS分析。
(5) 色谱条件为流动相甲醇水=70: 30，流速0. 8ml/min,检测波长为254亂LC/MS仪器为美国ABI公司提供的API4000型，色谱柱由Agela Technologies公司提供的Venusil柱，柱参数为C 18; 5Mm; 46 mm X250鹏。
HPLC分析如图5所示，证明转基因的川西獐牙菜植株比非转基因植株的獐牙菜苦苷含量可提高1倍以上。图5为转基因的川西獐牙菜植株和原生植株中獐牙菜苦苷含量变化的HPLC分析图。其中獐牙菜苦苷保留时间为15.1分钟，分子量为374.34。 A，为獐牙菜苦苷标准品；B，为原生植株中的獐牙菜苦苷；C,为转基因的川西獐牙菜植株的獐牙菜苦苷。
17序列表
<10〉山东大学
<120〉川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及其应用
〈141> 2009-3-17
<160> 3
〈210〉 1
<211〉 1488
<212> cDNA
〈213〉川西獐牙菜(&w"a ww5w"/Franch)
<221>川西獐牙菜香叶醇-IO羟化酶基因^y^7^W核苷酸序列
<222〉 (1)…(1488)
<400〉 1
atggattttgatttcctcaccattgctattggattcctt ttcaccataac60
gctcte朋ctttttttcaagaacctacctcctggtccatctcctctgcca120
ctcattggcaatcttcacttactaggtgacetaa8cttgcc180
gggtttacagcttggacaagtgacaacaattgttgttaca240
agtccttcaatagccttttcgagtcgatcg300
ctattcatgcccatgatcagctgttatttggctcccggtt360
gcatctcgatgg卿ggtctccgta犯gctttg犯CtCg3atatgttctccggt獄cgg420
cttgat.gcts3tC3gC3tttg卿agtcgaaacttattgcatattgtagg480
犯aagtagtctgC犯ttg3tgtggggCg3gctgcatttagg3C3tC3ttg540
犯tttgttgtgttttcgaaagatttaaccgacccctattcggattctgct600
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gattatttcccacttcttgat犯agttgatcctcaaggaatt3gg犯3Cg720
cactttgggaageitacttgagctttttggtggtcttettgatgaaagattgcagc鄉ag780
gtgttaatgatgatgttcttga.tgttctcctcactactagtgaagaaagt840
cctg肌ga犯tcgacaggactcata/tcc犯cgcatgtgtttggacttgtttgtggctggg900
c3tc3agcacactggagtgggcgatgtcagagatgcttaaaaacccagag960
cagctcaagccgagttagcac犯gtcatcgggcggt卿a1020
卿gcggaccttgcccgcctgccttacttacgttgtgc犯tc犯agaaactctaaggata1080
catcca6cagtcccactcttgattcctaggcgaaccgagcagtatgtggt1140
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acattgcaga aggctcatcc tttgcgtgct gttgcgactc ctctgtg 1488
〈210〉 2
〈211〉 4509<212>腿〈213〉人工序列
〈221>酵母表达载体pPICZA核苷酸序列
〈222> (1)…(4509)
〈400〉 2
gcgaggttcatgtttgtttatttccg犯tgc犯c犯gctccgcattacacccgaacatca60
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UtcUttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaaca ttatactgaa3720
aaccttgcttg卿aggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagc tggagaccaa3780
catgtgagcaaaaggccagcgaa^ccgtaaaaaggccgcgt tgctggcgtt3840
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ctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcc cttcgggaag4020
cgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtagg tcgttcgctc4080
c犯gctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcct tatccggtaa4140
ctatcgtcttgagtcc犯ccCggt犯g3C3cgacttatcgccactggcag cagccactgg4200
taacaggattagc,gcgaggtatgtaggcggtgctaca gagttcttga agtggtggcc4260
t朋ctacggctac3ctag犯ggac3gtstttggt3tctgcgctctgctga agccagttac4320
卿gttggt3gctcttgatccggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg4380
tUttttgtttgcaagc兆c已gatt已cgcggg3tCtC33g犯g3tCCttt4440
gatcttttctacggggtctgacgctcagtgtcacgttaag ggattttggt4500
catgagatc4509
〈210〉 3 〈211〉 12883 <212> DNA 〈213>人工序列
〈221>植物表达载体pROKII核苷酸序列 〈222〉 (1)…(12883) <400〉 3
ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60 aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120 a咖cttggc cctcactgac卿tgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180
21ccggcgcggc cagcctcgca ③gcctggg
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tcaccgacgagcaaggcaagaccgagcgcctttgcgacgctea12883
28
权利要求
1、一种川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H，其特征在于所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2、 一种含有权利要求1所述川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因5)z^ W/的酵母表达载体 pPICZA，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
3、 一种含有权利要求1所述基因6M^^/的植物表达载体pR0K11 ，其特征在于所述载 体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
4、 权利要求1所述香叶醇-10羟化酶基因5"M7^W在酵母或植株中表达香叶醇-10羟化 酶和提高獐牙菜苦苷含量的应用。
5、 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酵母是毕赤酵母；所述植株是川西獐牙 菜。
全文摘要
本发明公开了一种川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因SmG10H及所述基因SmG10H的酵母表达载体和植物表达载体。本发明还公开了所述基因SmG10H在毕赤酵母和川西獐牙菜植株中催化香叶醇生成10-羟基香叶醇的应用。实验证明，本发明为在毕赤酵母和川西獐牙菜植株中提高目标产物10-羟基香叶醇含量提供了理论依据和实践基础，本发明所述转基因植株比非转基因植株的在积累獐牙菜苦苷的能力上得到了很大程度的提高。
文档编号C12N15/81GK101509005SQ20091012980
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月21日 优先权日2009年3月2日
发明者向凤宁, 王俊峰 申请人:山东大学