专利名称：一种生产去甲万古霉素的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种生产去甲万古霉素的方法。
背景技术：
如图1所示，N端去甲万古霉素是万古霉素的类似物，仅在一位氨基酸的氨基上比 万古霉素少一个甲基。其抗菌谱与万古霉素基本相同，但体外活性比万古霉素高约20%。 主要用于葡萄球菌属(包括甲氧西林耐药菌)引起的内膜炎，肺炎，骨髓炎，败血症和软组 织感染等的治疗。 华北制药集团有限责任公司曾通过传统的菌种选育的方法筛选得到生产去甲万
古霉素的菌株。但是传统的菌种选育方法随机性强，工作量大，很难重复获得预期效果，因
此，有必要提供一种通过定向的基因改造得到产去甲万古霉素的菌株。 而本发明的申请人在申请号为200710036861.5的中国发明专利申请中，公开了
万古霉素生物合成基因簇中的26个基因。根据基因序列比对所得到的信息，其中的vcml2
基因编码N-甲基转移酶，该酶是万古霉素生物合成途径中的一个重要的后修饰酶，它主要
负责催化甲基转移到万古霉素七肽骨架的第一个氨基酸亮氨酸的N端氮原子上。 虽然根据基因序列比对得到的信息，^!1112基因编码^甲基转移酶，但不
能确定在敲除vcml2基因后是否表达得到去甲万古霉素，例如，在Balhimycin的生
物合成基因簇中，根据基因序列比对，就发现有两个与卤化作用相关的卤化酶基因，
bhaA(FADH2_dependent halogenase)禾口 bhp(haloperoxidase/perhydrolase)，Oliver Puk
等在2002年通过基因敲除的方法发现bhaA被敲除后的菌株可产生无氯Balhimycin，而
bhp被敲除后的菌株则不产生Balhimycin。因此，在敲除vcml2基因是否能获得万古霉素
的衍生物，以及所获得的万古霉素的衍生物是否为所预想的去甲万古霉素，则无法确定。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种产去甲万古霉素的方法。 本发明还有一个目的在于，提供一种构建产去甲万古霉素的基因工程菌的方法。
本发明还有一个目的在于，提供一种产去甲万古霉素的基因工程菌。
本发明提供的生产去甲万古霉素的方法，包括以下步骤 (i)阻断产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码N-甲基转移酶的基因，构建产去甲 万古霉素的基因工程菌； (ii)发酵产去甲万古霉素的基因工程菌，以生产去甲万古霉素。 本发明提供的构建产去甲万古霉素的基因工程菌的方法，包括以下步骤 A)构建重组质粒，所述重组质粒包含基因vcml2的左侧同源臂_抗性基因_基因
vcml2的右侧同源臂片段，其中，基因vcml2为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码N-甲基
转移酶的基因； B)将步骤A中获得的重组质粒，转化东方拟无枝酸菌，获得阻断突变株基因工程菌。 本发明提供的基因工程菌是基因vcml2被阻断的东方拟无枝酸菌，其中，基因 vcml2为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码N-甲基转移酶的基因。 本发明提供了一种产去甲万古霉素方法，以及一种产去甲万古霉素的基因工程 菌，所述基因工程菌可用于发酵生产去甲万古霉素。同时，本发明提供的基因工程菌是通过 定向的基因改造得到的，所以能够重复获得，同时，也有利于对该菌株的进一步改造。
图1是万古霉素及去甲万古霉素结构图，其中，当R为CH3时，该化合物为万古霉 素，当R为H时，该化合物为去甲万古霉素。 图2是阻断突变株Amycolatopsis orientalis dNMT的鉴定结果，其中，泳道1为 以PND1和PND2为引物对的PCR产物的电泳结果；泳道2为PNE1和PNE2为引物对的PCR 产物的电泳结果。 图3是Amycolatopsis orientalis dNMT及其出发菌株的发酵产物的HPLC分析图 谱，其中，图(1)是万古霉素标准品的HPLC分析图谱；图(2)是东方拟无枝酸菌ATCC 43491 发酵液上清的HPLC分析图谱；图(3)是去甲万古霉素标准品的HPLC分析图谱；图(4)是阻 断突变株Amycolatopsis orientalis dNMT发酵液上清的HPLC分析图谱。
图4是去甲万古霉素的质谱图。 图5去甲万古霉素的NMR图谱，其中，图5a去甲万古霉素的tfNMR图谱，图5b去 甲万古霉素的C13NMR图谱。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实
验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行，
或参考Kieser等《Practical Str印tomyces Genetics》(Norwich, United Kingdom :The
John InnesFoundation，2000)中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。 本发明的下述实施例中使用的菌株和质粒分别为 pUC18 :Ampr， LacZ，购于Takara公司。 pHP45omega-aac :Aprr， ATCC保藏号87628。 pMD18-T Simple Vector :Ampr，购于TaKaRa公司。 大肠杆菌E. coli DH5a ，购于TaKaRa公司。 大肠杆菌E.coli JM110，购于Stratagene。 本发明的下述实施例中使用的培养基配方如下 LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L， NaCl 5g/L， pH7. 4。 向LB培养基中加入20g/L琼脂粉即得LB固体培养基。 TSB培养基胰蛋白胨20g/L，葡萄糖2. 5g/L， NaCl 5g/L， K2HP042. 5g/L。 R2T20培养基蔗糖200g/L，蛋白胨4g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物6. 5g/L， K2S040. 25g/L，琼脂20g/L，加水至860ml 。灭菌后加入50 %葡萄糖5ml， lmol/L MgCl2 6H2012. 5ml，2mol/L Tris-HCl (pH7. 0) 3. 125ml，微量元素溶液0. 5ml， 0. 5 % KH2P04 1. 25ml， lmol/L NaOH 0. 625ml， lmol/L CaCl2 2H20 12. 5ml。其中微量元素溶液ZnCl2 40mg/L， FeCl3 6H20 200mg/L， CuCl2 2H20 10mg/L， MnCl2 4H20 10mg/L， Na2B407 10H20 10mg/L， (NH4)6Mo7024 4H20 10mg/L。 高氏一号斜面培养基可溶性淀粉20g/L， NaCl 0. 5g/L， K2HP04 3H20 0. 5g/L， KN031. 0g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L， FeS04 7H20 0. 01g/L，琼脂20g/L， pH7. 2-7. 4。
种子培养基可溶性淀粉40g/L，去脂黄豆粉20g/L，甘油20g/L，葡萄糖15g/L， KN03 6g/L， KH2P040. 2g/L， MgCl2 6H20 0. 4g/L。 发酵培养基甘油60g/L，去脂黄豆粉20g/L， KN036g/L， KH2P040. 2g/L， MgCl2 6H200. 4g/L， CaC03 3g/L。 本发明的下述实施例中使用的缓冲液配方如下 BufferI :蔗糖40g， K2S04 0 . 05g， lmol/L MgCl2 6H20 lml，微量元素溶液0. 4ml， 加水至178ml 。 灭菌后加入0. 5 % KH2P042ml， lmol/L CaCl2 2H20 40 ii 1，0. 25mol/L TES(pH8. 0)20ml。 本发明的下述实施例中使用的酶制剂购自TaKaRa公司；DNAMarker均为
Fermentase的GeneRuler lkb DNA ladder ;胰蛋白胨，酵母抽提物购自0xoid公司；
PEG1000购于上海医药集团。 实施例1、重组质粒pLY01D的构建 1. 1、引物的设计与合成 根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列，设计两对引物对PNA1和PNA2及 PNBl和PNB2，分别用于左侧同源臂和右侧同源臂片段的扩增。根据pHP45omega-aac的序 列，设计引物对PNC1和PNC2用于安普霉素(Apr)抗性基因片段的扩增，上述序列及其酶切 位点分别如下所示 PNA1 :TCTAGA AAGATCAAGGAAGACCTG ;
Xbal PNA2 :CTGCAG CAGGACAACCTCCAGGTC ;
Pstl PNBl :CTGCAGTGAGCGCGGCGAGCCTGC ;
Pstl PNB2 :AAGCTT CATCATCGCCGACATCATCGCC ;
Hindi11 PNC1:CTGCAG GGAACTTATGAGCTCAGCCAATCGACT ;
Pstl PNC2 :CTGCAG CTGACGCCGTTGGATACACCA。
Pstl 1.2、PCR扩增 分别以东方拟无枝酸菌ATCC 43491染色体组或质粒pHP45omega-aac为模板，以
步骤1. 1中获得的相应的引物为引物对，进行PCR扩增，具体如下
PCR反应体系(50iiL)为0.5iimol/L每条引物，lXBuffer，50iimol/L dNTPs， 5%DMS0，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1. 5mmol/L。 PCR反应条件为95。C预变性2min ;95。C变性45s， 55。C退火50s， 72。C延伸90s， 30 个循环；72"C延伸5min。 取上述PCR产物，然后参考使用手册，使用杭州维特洁生化技术有限公司的纯化 试剂盒纯化，然后将纯化获得的PCR产物进行测序，确定获得的纯化的PCR产物分别为左侧 同源臂(1. 2kb)，右侧同源臂(1. Okb)及安普霉素抗性基因片段(1. lkb)。
1. 3、质粒pLY01A， pLY01B及pLY01C的构建 将左侧同源臂基因片段与酶切质粒pMD18-T Simple Vector连接，经测序验证，获
得含左侧同源臂的重组质粒pLY01A，其中左侧同源臂序列如SEQ ID NO :1所示。 将右侧同源臂基因片段与酶切质粒pMD18-T Simple Vector连接，经测序验证，获
得含右侧同源臂的重组质粒pLY01B，其中右侧同源臂序列如SEQ ID NO :2所示。 将安普霉素抗性基因片段与酶切质粒pMD18-T Simple Vector连接，经测序验证，
获得含安普霉素抗性基因片段的重组质粒PLY01C。 1. 4、重组质粒pLY01D的构建 分别使用Xbal/Pstl酶切pLY01A质粒获得左侧同源臂、使用Pstl/Hind111酶切 pLY01B质粒获得右侧同源臂、使用Pstl/Pstl酶切pLY01C质粒获得安普霉素抗性基因片 段。 将左侧同源臂片段与右侧同源臂片段克隆到经Xbal/HindlII酶切的载体pUC18 中，再于两个同源臂之间的PstI位点插入安普霉素抗性基因片段，获得包含外源片段的重 组质粒pLY01D。 实施例2、阻断突变株Amycolatopsis orientalis dNMT的获得
2. 1、东方拟无枝酸菌ATCC 43491原生质体的制备 将东方拟无枝酸菌ATCC 43491的菌丝液接种到20ml TSB液体培养基中，并添加 甘氨酸至终浓度为2%。然后于28t:振荡培养36 60hr，离心收集菌体，并使用Buffer I 缓冲液洗涤。用过滤除菌后的10ml溶菌酶溶液(lmg/ml，使用Buffer I缓冲液配制)悬浮菌丝 体，置于2『C保温15分钟，再用装有脱脂棉花的无菌漏斗连续过滤两次除去菌丝体。离心 收集沉淀，经Buffer I缓冲液洗两次，再悬浮于lml Buffer I缓冲液中，获得东方拟无枝 酸菌ATCC 43491原生质体。
2.2、原生质体转化用DNA的制备 将重组质粒pLY01D转化到甲基化缺陷型大肠杆菌E. coli JM110中，再抽提质粒， 经Xbal/Hindl11酶切，获得用于原生质体转化的线形DNA(左侧同源臂-安普霉素抗性基
因-右侧同源臂)。 2. 3、重组菌株制备 取待转化DNA至原生质体溶液中，立即加入200 ii 1 PEG溶液，混合，涂布于R2T20 再生平板。28t:培养24 36h，用lml 2. 5mg/ml安普霉素溶液覆盖平板的表面，待平板表 面溶液被完全吸收后，将平板重新置于28t:继续培养3-5天，收获重组菌株。
2.4、重组菌株鉴定
根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列，于基因vcml2内设计引物对PND1和PND2，用于验证vcml2是否被敲除。根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列及质粒pHP45omega-aac的序列，于基因vcml2上游及安普霉素抗性基因片段内设计引物对PNEl和PNE2，用于验证安普霉素抗性基因片段的插入位置是否在原vcml2的位置，上述序列分别如下所示PND1 :TATCGGGATTTGATCCAGGACG
PND2 :ATCTCCTGGAGCTCCTCCGA
PNE1 :AGTACCGGCACAGCCGGT
PNE2 :TGAATGGGTTCATGTGCAGC 以重组菌株染色体组为模板，分别以PND1和PND2为一对引物对、PNE1和PNE2为一对引物对，进行PCR扩增，对其进行检测，具体如下 PCR反应体系(50iiL)为:引物对各0. 5 ii mol/L， 1 XBuffer， 50 ii mol/LdNTPs， 5%DMS0，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1. 5mmol/L。 PCR反应条件为95。C预变性2min ;95。C变性45s， 55。C退火50s， 72。C延伸90s， 30个循环；72"C延伸5min。 将获得的PCR产物，分别进行凝胶电泳检测，结果如图2所示。
图2的结果显示，PND1和PND2为引物对未扩增出片断，表示该质粒上已没有基因vcml2 ;而PNE1和PNE2为引物对，能扩增出1. 5kb的片段，说明安普霉素抗性基因片段的插入位置在原vcml2的位置。根据图2的结果，安普霉素抗性基因已插入上述质粒，且替换了基因vcml2。将该重组菌株命名为阻断突变株Amycolatopsis orientalis dNMT。
实施例3、 Amycolatopsis orientalis dNMT菌株发酵培养 将东方拟无枝酸菌ATCC 43491及Amycolatopsis orientalis dNMT分别经过自然分离，获得单一菌落。 挑取单菌落涂布于高氏一号斜面培养基上，28t:培养5天，在无菌条件下，刮取一定量的孢子，接入种子培养基中，于28°C ， 220rpm培养40 48h。然后，在无菌条件下以8%接种量，将培养好的种子液转入发酵摇瓶中，于28t:，220rpm振荡培养115 120h。
取发酵液，于12000rpm离心10min，取上清，进行HPLC检测，检测条件如下
流动相配制用0. 2%的三乙胺溶液，磷酸调pH至3. 2作为缓冲液。缓冲液与乙睛和四氢呋喃按92 : 7 : 1的比例混合摇匀，作为A液；缓冲液与乙睛和四氢呋喃按70 : 29 : 1的比例混合，摇匀，作为B液，A液和B液的加入方式如表l所示。
色谱条件色谱柱DiamonsilTM C 18， 0DS， ID 4. 6*200mm 柱温40。C 检测器DAD(HP1100)检测器 检测波长240nm 流速lml/min 进样量5ul 洗脱方法梯度洗脱。 表1、 A液和B液的加入方式
洗脱时间(min)01322262735
A (%)10010000100100
B (%)0010010000 检测结果如图3所示。根据图3的结果，万古霉素标准品在8min左右开始出峰，去甲万古霉素标准品在6分钟左右开始出峰，出发菌株发酵液上清在8min左右开始出峰，基因工程菌株的发酵液上清则除了在8min左右出峰外，同时还在6分钟左右出峰。
实施例4、发酵液纯化及所得化合物结构确认 参考中国专利ZL 200410012146. 4中提供的方法，对实施例3中获得的发酵液进行分离纯化，获得纯化后的化合物，并对所得化合物进行质谱和NMR检测，检测结果分别如图4和图5所示。 根据图4的结果，所得化合物的分子量为1433，与去甲万古霉素的分子量相同。
根据图4的质谱检测结果和图5的tfNMR图谱和C13NMR图谱的结果，并参考图3，可以确定本发明所得的化合物为去甲万古霉素。 综上所述，本发明提供了一种产去甲万古霉素方法，以及一种产去甲万古霉素的基因工程菌，所述基因工程菌可用于发酵生产去甲万古霉素。同时，本发明提供的基因工程菌是通过定向的基因改造得到的，所以能够重复获得，同时，也有利于对该菌株的进一步改造。序列表〈110〉上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司浙江医药股份有限公司新昌制药厂 [o川]〈120〉 一种生产去甲万古霉素的方法 〈130>P5091024〈150>200810201906. 4〈151>2008-10-29〈160>2〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>1211〈212>DNA〈213〉东方拟无枝酸菌ATCC 43491〈400>1朋gatc朋gg朋gacctgat cgcgctgctgaccaagctcc gcgccgagggcaagcgcgtc60gtcggctecg gcgcgacggc caagagcgccacggtgacca acttctgtggcatteccccg120gatctggtgg agttcatctc ggacaccaccccggccaagc agggcaggctcagccccgga180cagcacatcc cggttcgcga gtaccaggcgttcgccggcg accacccggactacgcgctg240ctgttcgcct ggaaccacgc cgacgagatcatgaacgcgg agcaggccttccgcgacgcc300ggcgggcagt ggatccggta cgtgccgaacgtgcacgtga gctgatcgcc3tg3CCCg3g360
8
acctcggcacggaccggatc ctggcgatctccccgcactt ggacgacgcg gtcctgtcct420tcggggcgggcctcgcccag gCgg33Cgggacggcgcgaa agtgaccgtc cacacggtgt480tcgccggtaccgcgacgccc ccgttctcaccggcggcgga ccggctgcac tcgatctggg540ggctgtcgccggacg郷ac gcgtcgctgcgccgccgtga cgaagacatc gccgcactcg600gccacctgggggccgagtec cggcaragccggttcctcga cgccatctat cgcaaggcgg660cggacggccggtggatggcc g3C33CgtgCcaggacggca gaaactggcc atcggacggc720tgtcaccgcaggacgatccg ctgttctccg cggtgcggga ggaaatcgcg tcggtcgtcc7803gg￡lgtgCg￡lcccgacgctg atcctgacct gcgcggccgc cagcgggcat atcgacaacg840agatcacccgggacgccacg ctgctcgtcg cgcggga皿g ggagatcccg gtgcggctgt■gggaagacctcccgcacgcg atgttcgctc agggggaagc cgaactcccg gaaggattcc960ggctcggcgcccccg皿ttc gcctcggtcg aggcggacgc gcgggcgcgg a^ttcgagg1020ccctectgcgctetccgacg cagatgcgga tgctccacgg gccggacaag gatcttttcg1080cgcagttggacgggcacgcc ggg皿g皿cg gcgtgcggtc cgggtecggc g^atgacct1140ggccggtcgtcgtccgcg皿g皿皿cggct g皿tcgggcc tgagacg皿t gtcgacctgg1200aggttgtcctg1211〈210>2〈211>1130〈212>DNA〈213〉东方拟无枝酸菌ATCC 43491〈400>2tgagcgcggcgagcctgctc acgccctcctcgatcagctc cggcgtgagc aggctgatgg60acagccggagctggttgaac ccgtccttcccgccgtagaa gtgatgcatc ggggtgaaca120gcacaccgtggtcgcgggcg gcgtccgccagcagctcgtc gtcgacgatg aagggcacgg180tgacggtgacg^g^cccg CCCgtCggggtgttccagcg gaccccgggg cggtcgccga240gcctgcggtcgagctcgctc agcgtcagctggagattccg ctggtegatc gcggtttccc300ggacgttggccttggtcagg ctgtagtcgttgagcagcag cttcccggcg atcaccgcct360gcgcg3tgggCg3ggtgttC 3Cggtg3gC3tgcccttgag cttcgagagc tggtcggcgt420acaggccaccgcccgccacc cgctgatccgccaccgcgta gccgacccgg gcgccgggca480tgccggtcttggcg^ggat ccgatgtegaccacgttccc cgaccggtcg agcgctttca540gCgtggggElggcgctcggcg CCg33g3gCCcgtacgcgtt gtcttccagc agaaggatcc600CgtgggCCgCggcgacttcg agcagccggt ggcgggacgg cagatccatg ctggtgccgg660tggggttggcgaagttgggc gtcacgtegc aggcccgcac ccgcatgccc tgttcgtcgg720cgcgcttcagctggaggacg agatcctcgg ggtcgatgcc gttctcgccg gaccggaccg780gccagaccggcgtgtcggtg agcagcgccg ccccggtcag gccgacgteg gtgggcgccg840gggCg3gC3gcacgtcccgc tcgttcgccc gcagggtgcg gagcaccagg aacatggcct■cctgggcgccgacggtgacg accaccgatt ccggggcggc gtcgatgttc tcgtcctcgg960ccaggttgcgggcgatgatg tcggcgatga tgcccttcgt ggtgccgtet tgg朋皿gcg1020cgcgggtgacgccggcctcg tccactttcc gatcgcgccg gagatgctcg cagtacgcgt1080cgagateatcgtg皿tgagc cggatgtcga皿皿ctcttc gtetggccgt1130
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权利要求
一种生产去甲万古霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(i)阻断产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码N-甲基转移酶的基因，构建产去甲万古霉素的基因工程菌；(ii)发酵产去甲万古霉素的基因工程菌，以生产去甲万古霉素。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建产去甲万古霉素的基因工程菌包括以下步骤A) 构建重组质粒，所述重组质粒包含基因vcml2的左侧同源臂-抗性基因-基因vcml2的右侧同源臂片段，其中，基因^!1112为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码^甲基转移酶的基因；B) 将步骤A中获得的重组质粒，转化东方拟无枝酸菌，获得阻断突变株基因工程菌。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组质粒转化东方拟无枝酸菌采用原生质体法转化。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述原生质体法转化包括以下步骤A) 制备东方拟无枝酸菌原生质体；B) 酶切重组质粒，制备酶切片段，所述酶切片段包含所述vcml2基因的左侧同源臂-抗性基因-右侧同源臂片段基因；C) 将步骤B获得的酶切片段，转化步骤A获得的原生质体。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤B后还包括筛选的步骤。
6 如权利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述左侧同源臂序列如SEQ ID NO:l所示。
7. 如权利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述右侧同源臂序列如SEQ ID N0:2所示。
8. 如权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述东方拟无枝酸菌为东方拟无枝酸菌ATCC 43491。
9. 一种构建产去甲万古霉素的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤A) 构建重组质粒，所述重组质粒包含基因vcml2的左侧同源臂-抗性基因-基因vcm12的右侧同源臂片段，其中，基因^!1112为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码^甲基转移酶的基因；B) 将步骤A中获得的重组质粒，转化东方拟无枝酸菌，获得阻断突变株基因工程菌。
10. —种生产去甲万古霉素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是基因vcml2被阻断的东方拟无枝酸菌，其中，基因^!1112为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码^甲基转移酶的基因。
全文摘要
本发明提供了一种生产去甲万古霉素的方法。本发明提供的生产去甲万古霉素的方法包括以下步骤(i)阻断产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码N-甲基转移酶的基因，构建产去甲万古霉素的基因工程菌；(ii)发酵产去甲万古霉素的基因工程菌，以制备去甲万古霉素。本发明还提供了一种构建产去甲万古霉素的基因工程菌的方法以及通过该方法获得的基因工程菌。本发明为去甲万古霉素的制备开辟了一条新途径。
文档编号C12N1/21GK101724644SQ20091014892
公开日2010年6月9日 申请日期2009年6月2日 优先权日2009年6月2日
发明者夏兴, 姜卫红, 戈梅, 朱丽, 李航, 杨志钧, 杨晟, 殷瑜, 王天娇, 罗敏玉, 金文翔, 阮林高, 陈代杰, 魏维, 黄鹤, 齐晓丹 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司;浙江医药股份有限公司新昌制药厂