专利名称：一种生产无氯万古霉素的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种生产无氯万古霉素的方法。
背景技术：
如图1所示，无氯万古霉素是万古霉素的类似物，仅是万古霉素分子上的两个氯原子为H所替代。虽然，其体外活性低于万古霉素，但可作为万古霉素衍生物的前体物质。
C.M.Harris等在1985年用化学的方法将万古霉素分子上的两个氯原子去除，得到了无氯万古霉素，但使用化学法生产无氯万古霉素成本高昂，因此，有必要提供一种成本低廉的生产无氯万古霉素的方法。
本申请人在申请号为200710036861.5的中国发明专利申请中，公开了万古霉素生物合成基因簇中的26个基因。根据基因序列比对所得到的信息，其中的vcm8基因编码的酶为卤化酶，即负责催化万古霉素七肽骨架上的2位和6位氨基酸的氯化。
虽然根据基因序列比对得到的信息，vcm8基因编码卤化酶，但不能确定在敲除vcm8基因后就能得到无氯万古霉素，例如，在Balhimycin的生物合成基因簇中，根据基因序列比对，就发现有两个与卤化作用相关的卤化酶基因，bhaA(FADH2-dependent halogenase)和bhp(haloperoxidase/perhydrolase)，Oliver Puk等在2002年通过基因敲除的方法发现bhaA被敲除后的菌株产生无氯Balhimycin，而bhp被敲除后的菌株则不产生Balhimycin。而且，在万古霉素分子中，有2个Cl原子，因此，在敲除vcm8基因后能否获得万古霉素的衍生物，以及所获得的衍生物是否是无氯万古霉素均未可知。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种产无氯万古霉素的方法。
本发明还有一个目的在于，提供一种构建产无氯万古霉素的基因工程菌的方法。
本发明还有一个目的在于，提供一种产无氯万古霉素的基因工程菌。
本发明提供的制备无氯万古霉素的方法，包括以下步骤 (i)阻断产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因，构建产无氯万古霉素的基因工程菌； (ii)发酵产无氯万古霉素的基因工程菌，以制备无氯万古霉素。
本发明提供的构建产无氯万古霉素的基因工程菌的方法包括以下步骤 A)构建重组质粒，所述重组质粒包含基因vcm8的左侧同源臂-抗性基因-基因vcm8的右侧同源臂片段，其中，基因vcm8为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因； B)将步骤A中获得的重组质粒，转化东方拟无枝酸菌，构建阻断突变株基因工程菌。
本发明提供的基因工程菌是基因vcm8被阻断的东方拟无枝酸菌，其中，基因vcm8为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因。
本发明提供了一种产无氯万古霉素方法，以及一种产无氯万古霉素的基因工程菌，所述基因工程菌可用于发酵生产无氯万古霉素。同时，本发明提供的基因工程菌是通过定向的基因改造得到的，所以能够重复获得，同时，也有利于对该菌株的进一步改造。
图1是万古霉素和无氯万古霉素的结构图，其中，当X和Y＝Cl时，为万古霉素；当X和Y＝H时，为无氯万古霉素。
图2是阻断突变株Amycolatopsis orientalis dvcm8的鉴定结果，其中，泳道1为以PCD1和PCD2为引物对的PCR产物的电泳结果；泳道2为PCE1和PCE2为引物对的PCR产物的电泳结果。
图3是Amycolatopsis orientalis dvcm8及其出发菌株的发酵产物的HPLC分析图谱，其中，(1)是东方拟无枝酸菌ATCC 43491发酵液上清的HPLC分析图谱；(2)是阻断突变株Amycolatopsis orientalis dvcm8发酵液上清的HPLC分析图谱。
图4是无氯万古霉素的质谱图。
图5是无氯万古霉素的H1NMR图谱。
具体实施例方式 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行，或参考Kieser等《Practical Streptomyces Genetics》(Norwich，United KingdomThe John InnesFoundation，2000)，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明使用的菌株和质粒分别为 pUC18Ampr，LacZ，购于Takara公司。
pHP45omega-aacAprr，ATCC保藏号87628。
pMD18-T Simple VectorAmpr，购于TaKaRa公司。
大肠杆菌E.coli DH5α，购于TaKaRa公司。
大肠杆菌E.coli JM110，购于Stratagene。
本发明的下述实施例中使用的培养基配方如下 LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，NaCl 5g/L，pH7.4。
向LB培养基中加入20g/L琼脂粉即得LB固体培养基。
TSB培养基胰蛋白胨20g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5g/L，K2HPO42.5g/L。
R2T20培养基蔗糖200g/L，蛋白胨4g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物6.5g/L，K2SO40.25g/L，琼脂20g/L，加水至860ml。灭菌后加入50％葡萄糖5ml，1mol/L MgCl2·6H2O12.5ml，2mol/L Tris-HCl(pH7.0)3.125ml，微量元素溶液0.5ml，0.5％KH2PO41.25ml，1mol/LNaOH 0.625ml，1mol/L CaCl2·2H2O 12.5ml。其中微量元素溶液ZnCl240mg/L，FeCl3·6H2O200mg/L，CuCl2·2H2O 10mg/L，MnCl2·4H2O 10mg/L，Na2B4O7·10H2O 10mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 10mg/L 高氏一号斜面培养基可溶性淀粉20g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KNO31.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，琼脂20g/L，pH7.2-7.4。
种子培养基可溶性淀粉40g/L，去脂黄豆粉20g/L，甘油20g/L，葡萄糖15g/L，KNO36g/L，KH2PO40.2g/L，MgCl2·6H2O 0.4g/L。
发酵培养基甘油60g/L，去脂黄豆粉20g/L，KNO36g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgCl2·6H2O0.4g/L，CaCO3 3g/L。
本发明的下述实施例中使用的缓冲液配方如下 Buffer I蔗糖40g，K2SO40.05g，1mol/L MgCl2·6H2O 1ml，微量元素溶液0.4ml，加水至178ml。灭菌后加入0.5％KH2PO42ml，1mol/L CaCl2·2H2O 40μl，0.25mol/LTES(pH8.0)20ml。
本发明的下述实施例中使用的酶制剂购自TaKaRa公司；DNAMarker均为Fermentase的GeneRulerTM 1kb DNA ladder；胰蛋白胨，酵母抽提物购自Oxoid公司；PEG1000购于上海医药集团。
实施例1、重组质粒pLY02D的构建 1.1、引物的设计与合成 根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列，设计两对引物对PCA1和PCA2及PCB1和PCB2分别用于左侧同源臂、右侧同源臂片段的扩增。根据pHP45omega-aac的序列，设计引物对PCC1和PCC2用于安普霉素(Apr)抗性基因片段的扩增，上述序列及其酶切位点分别如下所示 PCA 1GAATTCATTTCGTCTGGCAGGCCC； EcoRI PCA2TCTAGATTCCCACCATTCCTTTGTCG； XbaI PCB1GCATGCTGACTTCGCCCGACGGGA； SphI PCB2AAGCTTGTCGACAACAACACACGCATCAC； HindIII PCC1TCTAGAGGAACTTATGAGCTCAGCCAATCGACT； XbaI PCC2GCATGCCTGACGCCGTTGGATACACCA。
SphI 1.2、PCR扩增 分别以东方拟无枝酸菌ATCC 43491染色体组或质粒pHP45omega-aac为模板，以相应引物为引物对，进行PCR扩增，具体如下 PCR反应体系(50μL)为0.5μmol/L每条引物，1×Buffer，50μmol/LdNTPs，5％DMSO，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1.5mmol/L。
PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min。
取上述PCR产物，然后参考使用手册，使用杭州维特洁生化技术有限公司的纯化试剂盒纯化，然后将纯化获得的PCR产物进行测序，确定获得的纯化的PCR产物分别为左侧同源臂(1.1kb)，右侧同源臂(1.4kb)及安普霉素抗性基因片段(1.1kb)。
1.3、质粒pLY02A，pLY02B及pLY02C的构建 将左侧同源臂基因片段与酶切质粒pMD18-T Simple Vector连接，经测序验证，获得含左侧同源臂的重组质粒pLY02A，其中左侧同源臂序列如SEQ ID NO1所示。
将右侧同源臂基因片段与酶切质粒pMD18-T Simple Vector连接，经测序验证，获得含右侧同源臂的重组质粒pLY02B，其中右侧同源臂序列如SEQ ID NO2所示。
将安普霉素抗性基因片段与酶切质粒pMD18-T Simple Vector连接，经测序验证，获得含安普霉素抗性基因片段的重组质粒pLY02C。
1.4、重组质粒pLY02D的构建 分别使用EcoRI/XbaI酶切pLY02A质粒获得左侧同源臂片段、使用SphI/HindIII酶切pLY02B质粒获得右侧同源臂片段、使用XbaI/SphI酶切pLY02C质粒获得安普霉素抗性基因片段。
将左侧同源臂片段、右侧同源臂片段和安普霉素抗性基因片段克隆到经EcoRI/HindIII酶切的载体pUC18中，获得包含外源片段的重组质粒pLY02D。
实施例2、阻断突变株Amycolatopsis orientalis dvcm8的获得 2.1、东方拟无枝酸菌ATCC 43491原生质体制备 将东方拟无枝酸菌ATCC 43491的菌丝液接种到20ml TSB液体培养基中，添加甘氨酸至终浓度为2％。然后于28℃振荡培养36～60hr，离心收集菌体，并使用Buffer I缓冲液洗涤一次。
使用10ml过滤除菌后的溶菌酶溶液(1mg/ml，使用Buffer I缓冲液配制)悬浮菌丝体，置于28℃保温15分钟，再用装有脱脂棉花的无菌漏斗连续过滤两次除去菌丝体。离心收集沉淀，经Buffer I缓冲液洗两次，再悬浮于1ml Buffer I缓冲液中，获得东方拟无枝酸菌ATCC 43491原生质体。
2.2、原生质体转化用DNA的制备 将重组质粒pLY02D转化到甲基化缺陷型大肠杆菌E.coli JM110中，再抽提质粒，经EcoRI/HindIII酶切，获得用于原生质体转化的线形DNA(左侧同源臂-安普霉素抗性基因-右侧同源臂)。
2.3、重组菌株制备 取待转化DNA至原生质体溶液中，立即加入200μl PEG溶液，混合，涂布于R2T20再生平板。28℃培养24～36h，用1ml 2.5mg/ml安普霉素溶液覆盖平板的表面，待平板表面溶液被完全吸收后，将平板重新置于28℃继续培养3-5天，收获重组菌株。
2.3、重组菌株的鉴定 根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列，于基因vcm8内设计引物对PCD1和PCD2，用于验证vcm8是否被敲除。根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列及质粒pHP45omega-aac的序列，于基因vcm8上游及安普霉素抗性基因片段内设计引物对PCE1和PCE2，用于验证安普霉素抗性基因片段的插入位置是否在原vcm8的位置，上述序列分别如下所示 PCD1AGGACGCCGACAAGATCCAG； PCD2GAATTCGGCACTGTTCGCGG； PCE1CGTCGCGGGGATGATCGGCTT； PCE2ATGACCCCGAAGCAGGGTTATGCAGC。
以重组菌株染色体组为模板，分别以引物PCD1和PCD2、PCE1和PCE2为引物对，进行PCR扩增，以对其进行检测，具体如下 PCR反应体系(50μL)为引物对各0.5μmol/L，1×Buffer，50μmol/L dNTPs，5％DMSO，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1.5mmol/L。
PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min。
将获得的PCR产物，分别进行凝胶电泳检测，结果如图2所示。
图2结果显示，PCD1和PCD2为引物对未扩增出片断，表示该质粒上已没有基因vcm8；而PCE1和PCE2为引物对，能扩增出1.5kb的片段，说明安普霉素抗性基因片段的插入位置在原vcm8的位置。
根据图2结果，安普霉素抗性基因已插入上述质粒，且替换了基因vcm8。
将该重组菌株命名为阻断突变株Amycolatopsis orientalis dvcm8。
实施例3、Amycolatopsis orientalis dvcm8发酵培养 将东方拟无枝酸菌ATCC 43491及Amycolatopsis orientalis dvcm8分别经过自然分离，获得单一菌落。
挑取单菌落涂布于高氏一号斜面培养基上，28℃培养5天，在无菌条件下，刮取一定量的孢子，接入种子培养基中，于28℃，220rpm培养40～48h。然后，在无菌条件下以8％接种量，将培养好的种子液转入发酵摇瓶中，于28℃，220rpm振荡培养115～120h。
取发酵液，于12000rpm离心10min，取上清，进行HPLC检测，检测条件如下 流动相配制用0.2％的三乙胺溶液，磷酸调pH至3.2作为缓冲液。缓冲液与乙睛和四氢呋喃按92∶7∶1的比例混合摇匀，作为A液；缓冲液与乙睛和四氢呋喃按70∶29∶1的比例混合，摇匀，作为B液，A液和B液的加入方式如表1所示。
色谱条件 色谱柱DiamonsilTM C18，ODS，ID 4.6*200mm 柱温40℃ 检测器DAD(HP1100)检测器 检测波长240nm 流速1ml/min 进样量5μl 洗脱方法梯度洗脱。
表1、A液和B液的加入方式
检测结果如图3所示。根据图3结果，出发菌株发酵液上清在8min左右开始出峰，基因工程菌株Amycolatopsis orientalis dvcm8发酵液上清在8min左右没有出峰，而是在5min左右有峰出现，因此，Amycolatopsis orientalis dvcm8不产万古霉素，而是产生了一个不同于万古霉素的物质。
实施例4、发酵液纯化及所得化合物结构确认 参考文献The Role of the Chlorine Substituents in the Antibiotic VancomycinPreparationand Characterization of Mono-and Didechlorovancomycin.C.M.Harris et al.J.Am.Chem.Soc.1985.107.6652-6658中的方法，对实施例3中获得的Amycolatopsis orientalis dvcm8发酵液进行分离纯化，获得纯化后的化合物，并对所得化合物进行质谱和NMR检测，检测结果分别如图4和图5所示。
根据图4的结果，所得化合物的分子量为1379，与无氯万古霉素的分子量相同。
根据图4的质谱检测结果和图5的H1NMR图谱的结果，并参考图3，可以确定本发明所得的化合物为无氯万古霉素。
综上所述，本发明提供了一种产无氯万古霉素的基因工程菌，可用于发酵生产无氯万古霉素。同时，本发明提供的基因工程菌是通过定向的基因改造得到的，所以能够重复获得，同时，也有利于对该菌株的进一步改造。
序列表
<110>上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司浙江医药股份有限公司新昌制药厂
<120>一种生产无氯万古霉素的方法
<130>P5091025
<150>200810201904.5
<151>2008-10-29
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1108
<212>DNA
<213>东方拟无枝酸菌ATCC 43491
<400>1
atttcgtctg gcaggcccac ggctacgacg tcgtgcgcag gatcctcggt gaccacgaga 60
atttcacgac gcgcccgcaa ttcacccagg cgaaatccgg ggcgcatgtc gaggcccagt 120
tcgtcgggca gatctcgacc tacgatccgc ccgagcacac ccggttgcgg aagatgctga 180
caccggagtt caccgtccgg cggatccgcc ggatggagcc cgcgatccag agcctcgtcg 240
acgatcgcct cgacatgctg gaggccgagg ggtcgcccgc ggacctccag ggcctgttcg 300
ccgatccggt cggcgcccac gccctgtgcg aactgctcgg catcccccgc gacgaccagc 360
gcgagttcgt ccggcggatc aggcggaacg ccgatctgag ccgcggcctc aaggcgcggg 420
ccgccgacag cgcggcgttc aaccggtacc tggacaacct catcgcccgg cagcgcgcgg 480
atcccgacga cggactcctc ggcacgatcg tgcgagagca cggcggcaac gtcacggacg 540
aggagttgcg gggcctgtgc acggcgctga tcctcggcgg tgtcgaaacc gtcgcgggga 600
tgatcggctt cggcgtgctc gccctccttc agcaccccgg ccagataccg ttgcttttcg 660
aaggcccgga aaaggccgac cgcgtcgtca acgagctggt gcgctatctg tcccccgtgc 720
aggcgccgaa tccccggctc gccatcaagg acgtggtcgt cgacgggcag ctgatcaaag 780
cgggggacta tgtcctgtgc tcggttctca tggcgaacag ggacgaagca ctgacccccg 840
atccgaacgt tttcgacgcg aaccgcaccg ctgtttcgga cgtcgggttc gggcacggaa 900
tccattactg cgtcggtgcc gctttggccc ggtcgatgct gcggacggcc tatcagacct 960
tgtggcggcg attcccgggg ctgcggctgg ccgtgcccgt cgaagaagtg aaataccgca 1020
gcgcgttcgt tgactgcccc gatcaagtac cggtcacctg gtgacgaccg gcccggcgaa 1080
gtgacactcg acaaaggaat ggtgggaa 1108
<210>2
<211>1401
<212>DNA
<213>东方拟无枝酸菌ATCC 43491
<400>2
tgacttcgcc cgacgggatg aagtggctgc cgcaccaccc ggcctgaaac ctccgcacgc 60
cggcggtgcg ccggtggtcg agcacgaaac aggggtagcg aaatgcgtgt gttgttgtcg 120
gtgtgcggaa cccgcgggga cgtcgagatc gcggtgtcgc tggcggtccg gctgaaggcg 180
ctcggcgtcg ggacgcggat gtgcgcaccg cccgccgccg ccgagcggct ggccgaggtc 240
gaggtgccgc atgtgccggt cggccttccg cagcacatga tgttgcagga ggggatgccg 300
ccgccgcccc cggaggagga gcggcggctc gcggccatga cggtcgagat gcagttcgac 360
gcgatcccct cggccgccga aggatgcgtg gcggtggtgg cggtcggcga tctggccgcc 420
gcgaccggcg tgcggtcggt ggccgaaaag ctgggcctcc ccttcttcta ctccgtcccg 480
agcccggtct acctggcttc cccgcacttc ccgccgccct atgacgagcc gaccaccccg 540
ggcgtgaccg accaccggac actgtgggaa gagcgtgccc accggttcgc ggaacggtac 600
ggggagacgc tcaaccggcg gcgggccgcg atcggcctgc cgccggtgga ggacgtcttc 660
ggctacggcc acggcgaccg gcccatcctg tcggcggacc cggtcctcgc cccgctgcag 720
ccggacgtcg acgccgtgca gaccggcgcg tggatcctga ccgacgaccg gccgcttccc 780
ccggagctgg aggcgttcct ggccgccggc ccaccgccgg tgcacgtggg tttcggcagc 840
tcgtccggga aggggatcgc cgacgccgcg aagatcgccg tcgaggtgag ccgtgcccac 900
ggccgccggg tgatcctctc ccgagggtgg accgatctgc tcctgcccga cgaccgggag 960
gactgtttcg ccatcggcga ggtgaacttc caggcgctgt tcccccgggt ggccgccgtc1020
atccatcacg gcagcgcggg cacggaacac gtggccacgc gggcgggcgt cccccagctc1080
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cccgcgtgaa ccatcagcga ccggacgccg gccaggaccg gagaaaacgg ggaaatacgt1380
gatgcgtgtg ttgttgtcga c 140权利要求
1.一种生产无氯万古霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤
(i)阻断产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因，构建产无氯万古霉素的基因工程菌；
(ii)发酵产无氯万古霉素的基因工程菌，以生产无氯万古霉素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建产无氯万古霉素的基因工程菌包括以下步骤
A)构建重组质粒，所述重组质粒包含基因vcm8的左侧同源臂-抗性基因-基因vcm8的右侧同源臂片段，其中，基因vcm8为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因；
B)将步骤A中获得的重组质粒，转化东方拟无枝酸菌，构建阻断突变株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组质粒转化东方拟无枝酸菌采用原生质体法转化。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述原生质体法转化包括以下步骤
A)制备东方拟无枝酸菌原生质体；
B)酶切重组质粒，制备酶切片段，所述酶切片段包含所述vcm8基因的左侧同源臂-抗性基因-右侧同源臂片段基因；
C)将步骤B中获得的酶切片段转化步骤A中获得的原生质体。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤B后还包括筛选的步骤。
6.如权利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述左侧同源臂序列如SEQ ID NO1所示。
7.如权利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述右侧同源臂序列如SEQ ID NO2所示。
8.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述东方拟无枝酸菌为东方拟无枝酸菌ATCC 43491。
9.一种构建产无氯万古霉素的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤
A)构建重组质粒，所述重组质粒包含基因vcm8的左侧同源臂-抗性基因-基因vcm8的右侧同源臂片段，其中，基因vcm8为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因；
B)将步骤A中获得的重组质粒，转化东方拟无枝酸菌，获得阻断突变株基因工程菌。
10.一种生产去甲万古霉素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是基因vcm8被阻断的东方拟无枝酸菌，其中，基因vcm8为产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因。
全文摘要
本发明提供了一种生产无氯万古霉素的方法。本发明提供的生产无氯万古霉素的方法包括以下步骤(i)阻断产万古霉素的东方拟无枝酸菌中编码卤化酶的基因，构建产无氯万古霉素的基因工程菌；(ii)发酵产无氯万古霉素的基因工程菌，以制备无氯万古霉素。本发明还提供了一种构建产无氯万古霉素的基因工程菌的方法以及通过该方法获得的基因工程菌。本发明为无氯万古霉素的制备开辟了一条新途径。
文档编号C12N15/74GK101724645SQ20091014892
公开日2010年6月9日 申请日期2009年6月2日 优先权日2009年6月2日
发明者罗敏玉, 李航, 黄鹤, 魏维, 阮林高, 杨晟, 朱丽, 姜卫红, 戈梅, 陈代杰, 杨志钧, 夏兴, 王天娇, 殷瑜, 杨天, 金文翔 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司, 浙江医药股份有限公司新昌制药厂