专利名称：：一种基于多聚ARNA在溶液中合成cDNA的方法
技术领域：
：本发明涉及高通g:分离和)ii一:全血中mRNA。更特别地，本发明涉及用f分离和扩增mRNA的方法和设各，其使用附着到固定寡聚(dT)的多孔板上的白细胞滤器的组合。
背景技术：
：分子生物学领域的研究显示可以从对其核糖核酸(RNA)的研究巾推导出细胞的遗传起源和功能活性。这种信息可以在临床实践中用于诊断感染、检测细胞表达致癌基因的出现、检测家族性疾病、监测寄主防御机制的状态以及确定HLA类型或者特性的其它标记。RNA以—种功能不同的形式存在核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。然而稳定的r:RM和tRNA参与翻译的催化过程，m:RM分了携带遗传信息。总RNA中由只有大约丄5X的mRNA、大约丄5%的UNA以及大约80X的rRNA组成。mRNA是重要的诊断工具,特别是当其用于定量观测基因的上调或者下调时。人的外周血是用TmRNA分析非常好的临床来源。例如，对血中特异性嵌合mRNA的监测可以暗示不正常细胞的出现，并且应用于慢性骨髓细胞性白血病(CM:L)的分子检测(KawasakiE,S,，ClarkS,S,，CoyneM,Y,,Smiths,D.，Cha卿linR,，Witte0,N,和McCormickF.P,1988年，Diagnosisofchronicmyeloidandacutelymphocyticleukemiasbydetectionofleukemia—specificmRNAsequencesamplifiedinvitro,Proc,Natl.Acad,Sci,美国85:56985702，Pachma皿K.，ZhaoS.，SchenkT,，Kantarjian:H,,El-NaggarA,K.，S丄c丄l丄anoM.J,，GuoJ.Q.，Arl丄nghausR,B.和AndreefTM,200丄年，卜:xpressionofbciablemRNAindividuaichronicmyelogenousleukaemiaceilsasdotormincdbyinsituamplification，Br,J,Haematol,112:749-59)。通过监测癌特异性m:RNA可以检测微转移的癌细胞，例如对直肠癌监测癌胚抗原(CEA)、对前列腺癌监测前列腺特异抗原(PSA)和对甲状腺癌监测甲状腺球蛋白(WingoS,T,，Ri卿lM,D,，AndersonJ,S.，PatelA.D.，LukesY.I).，DjuhY.Y.，SolomonB.，Nicholson:[).，Balducci-SilanoP.L.，LevineM.A.,FrancisG.L.禾UTuttleR.M.1999年，Quantitativereversetranscription—PCRmeasurementofthyrog:LobulinmRNAi叩eripheralbloodofhealthysubjects,Clin,Chem,45:785-89)以及对黑色素瘤监测酪氨酸酶(PelkeyT.工，3FriersonH.F,Jr.禾UBrimsD.E,1996年，Molecularandi咖皿ologicaldetectionofcirculatingtumorcellsandmicrometastasisfromsolidtumors，Clin,Chem,42:丄3698i)。而目.，由于这些癌特异性mRNA水平在治疗后发牛改变，特异mRNA的定量在后续治疗过程中提供了有用的指标。由T与白细胞(大约5000白细胞ZuL)相比，血液含有大量的无核红细胞(大约5百万细胞/UL)，冈此通常将从全血巾分离粒细胞或者淋巴细胞作为m:RNA分析的第一步来进行。然而，由于在不同样品中白细胞特异业群回收的不一致，因此分离白细胞的数目由每个样品所确定，并将结果表达为每个白细胞mRNA的量，而不是每pL血mRM的量。而且，mRNA的量可以在冗长的分离过程中改变。尽管没:丫l-方法来从血中分离癌细胞，但基因扩增技术nj以对特异性mRNA水平进行鉴定和定量，甚至从大量不同的基因中，这使全血在可以得到基因特异性引物和探针时成为mRNA分析的理想材料。由于缺乏标准化，科学团体i.l..:面临研究所与研究所之间以及实验与实验之间在基因表达分析方面有差异的巨大问题。尽管目前的基因扩增技术提供丫对模板DNA的完全定量，但由于缺少每个样品巾RNA回收率和d)M合成率的信息，这些数值不能被转换成该基因在原材料中的量。总RNA常被用作mRNA定量的标准化标记，并且通常结果表达为每ug总RNA某因的量。然而，必须要强调的是总RNA不能代表iiiR里，因为mRNA的片断只占总R里的15%，而且即使在总RNA相同的情况下mRNA的量也会变化。总RNA或者mRNA的产量也会随着所采用的方法而广泛变化。一且提取了:RNA,下一步是合成cDNA，其自身会引起不确定性，因为现有的方法不能说明是否在每次实验中每个RNA模板都形成了cDNA的单拷贝。为了避免上面的问题,广泛使用通过将冃标基因数据与看家基因或rRNA的数据进行比较的相对定量。然而，对照基因的量通常是不稳定的，可能在实验中发生变化。而且，这种变化代表了临床巾的严重问题，冈为每个临床样木通常是在时间的不同点进行分析。通常很难从全血中分离纯mRNA,因为全血含有人量RNA酶(来fi粒细胞)和无核红细胞。尽管可以得到各种用于全血应用的RNA提取力'法(deVriesT,J,，FourkourA.,PuntC.J.，RuiterD.J,禾UvanMuijenG.N.2000年，Analysisofmelanomacellsinperiphe:ralbloodbyreversetranscription—polymerasecheiinre;actionfortyrosinaseandMART—丄afLermononucletircellcollectionwithcellpreparationtubes:acomparisonwiththewhoiebloodguanidiniumisot.hiocyanateRNAisolationmethod,MclanomaRcsoarch10:11926JohanssonM,,PisaE,K,，TomanonV.，ArstrandK.禾卩Kag'edalBL2000年，Quantitativeanalysisoftyrosinasetranscriptsinblood,Clin,Chem,46:92127;WingoS,T,，RingelM,D,，AndersonJ,S,，PatelA,D.，LukesY,D.,DjuhY,Y.,SolomonB,，NicholsonI),，Balducci-SilanoP丄，LevineM.A.,FrancisG丄禾UTuttleR.M.1999年，Quantitativereversetranscription—PCRmeasurementofthyroglobulinmRNAinperipheralbloodofhealthysubjects,Clin.Chem.45:785-89)，但是该检验是劳动密集型的，需要多轮离心，以及仃细的操作,这在去除核酸酶活性中是必须的。因此，需耍.,巾用T分离和定量全血中大量mRNA的快速简单方法和设备。特别地，需要具有可重复回收和完全连续操作来扩增基冈的高通^、全血衍生m:RNA处理技术。
发明内容本发明公开了一种直接分离和定量全血中mRNA的有效高通量方法和设备，其具有可重复的回收，其使用附着到同定寡聚WT)的多孔板上的白细胞滤器的组合。本发明一方面包括一种卨通一.t#全血中mRNA的方法，其包括步骤(a)收集全血；(b)通过过滤从全血中去除江细胞和II'IL液组分以生产过滤膜上的白细胞；(c)对白细胞进行细胞裂解以获得含m:RNA的裂解物；(d)将裂解物转移到固定寡聚(dT)的板k以捕获mRNA;以及(e)对mRNA进行定量。在该方法的一个优选实施方式屮，在收集白细胞之前对全血施加抗凝血剂。可以将多个过滤膜叠在一起来提高所捕获o细胞的产量。使用裂解缓冲液对捕获在过滤膜上的白细胞进行裂解以从白细胞中释放mRNA。可以使用离心、真空吸引、正压或者乙醇清洗然后真空吸引来完成将裂解物转移到固定寡聚(dT)的板上。通过产牛d)NA并用PCR扩增该d)NA来对mRNA进行定量。特别优选的实施方式使用TaqManPCR来定量mRNA。本发明另-'方面包括使用人工对照RNA作为通用标准。在优选的实施方式中，检测每个样品巾标准RNA的回收使得基冈扩增的结果可以用来确定每u1全血巾存在的mRM量。本发明实施方式导致样品和实验之间的低变化系数。在优选的实施方式中，在回收RNA、合成d)NA以及定量的过程屮，变化可以被最小化。使用标准化的对照RNA可以进行更有效的检验、定量以及比较检测。本发明另一方面包括一种进行卨通S:全血中mRNA的设备，其中该设备包括(a)多孔板，其含有多个样品传输孔，在孔下方捕获白细胞的过滤器，以及在滤器下含有固定的寡聚(dT)的mRNA捕获带；和(b)真空盒，其用于容纳过滤板以在板和盒之间形成密封。在该设备的优选实施方式中，白细胞被捕获在多个^叠在-'起的过滤膜上。在该设备的另一优选实施方式巾，真空盒用于容纳真空源。在该设备的另一优选实施方式中，在真空盒和多孔板之间插入多孔支持物。本发明另一方面包括一种试剂盒，其包括用于进行高通量定量全血屮iiiR里的设备、肝素、低渗缓冲液和裂解缓冲液。本发明另一方面包括一种用f进行高通量定量全血中mRNA的全自动系统，其包括将血样品、低渗缓冲液和裂解缓冲液施加到设备的遥控设备；自动真空吸引仪、离心机以及自动PCR仪。图1是高通量mRNA设备的分解图；图2显示高通量mRNA设备的多孔板，其包括白细胞过滤器和固定寡聚(dT)的过滤器孔；图3是表不在过滤板上捕获新鲜和冷冻血液样品白细胞效率的图表；图4是表示淸洗血液数目对mRNA定量影响的图表；图5是表示细胞裂解前对过滤板的最终处理对m定缺彩响的图表；图6是表示裂解缓冲液如何抑制RNA酶的图表；图7是表示用于mRNA定量的反转录酶最佳浓度的图表；图8是表示用于PCR以捕获mRNA的cDNA的最佳量的图表；图9是表示本发明杂交动力学的图表；图10是表不每孔所使用全血体积和mRNA定量之间平行关系的图表；图ii是表示硫氰酸胍最佳浓度的图表；图12是表示蛋白酶K最佳浓度的图表；图13A13D是表示检验有效性的图表；图14A1.4D是表示回收合成的掺标(spiked)RNA的图表；图15表示由特异性反义引物(NNN)和固定的寡聚(dT)合成cDNA;图16是表示使用和不使用变性特异性引导的:RNA回收的图表；图17是表示使用和不使用特异性引物对RNA扩增的图表；图18A表不本发明典型的捕获mRNA的不意；图i8B是表示各种杂交性能的图表；图18C是表示各种捕获总RNA和多聚(A)RNA的方法效率的图表；图18D是表示PCR循环最佳数目的图表；图18E是表示用于捕获RNA的裂解缓冲液最佳范闱的图表；图19A是表示PCR循环数目相对各种抗凝血剂的图表；图19B是表示PCR循环数目相对存储时间的图表；图19C是表示PCR循环数目相对杂交温度的图表；图19D是表不PC:R循环数目相对杂交时间的图表；图i9E是表示PCR循环数目相对MMLV单位的图表；图19H是表示PCR循环数冃相对每孔cDNAPi的图表；图20A是表示掺标的标准RNACt值的图表；图20B是表示掺标的标准RMCt回收百分率的图表；图20C是表示抑制剂dA20Ct值的图表；图20D是表示抑制剂dA20抑制百分率的图表；图20E是表示每U1血Ct值的图表;图20F是表不每li1血mRNA回收的图表；图2iAE表示对每个对象mRNA的回收；图21A是表示在各种对象中标准RNA回收百分率的图表；图21B是表示在各种对象中所回收的每U1血CD4mRNA的图表；图21C是表示在各种对象巾所回收的每U1血p21mRNA的图表；图21D是表示在各种对象中所回收的每U1血FasLmRNA的图表；图21E是表示在各种对象屮所回收的每P1血LTC4SmRNA的图表；图22A是表示在全血中体外诱导的mRNA的图表；图22B是表不在体外剌激前的血储存的图表；图22C是通过对剌激和载休对照二者分别显示mRNA分子/mL血，表示在各种对象中HasLmRNA的体外诱导的图表，；图22D是通过对剌激和载体对照二者分别显示mRNA分子/mL血，表示在各种对象巾p21mRM的体外诱导的图表；图22E是与图22C相同的通过旋转直至回归线成水平的图表；图22F是与图22D相同的通过旋转直至冋归线成水平的图表；图22G是与图22C相同的通过显不每个对象的倍数增加的数据；图22H是与图22D相同的通过显示每个对象的倍数增加的数据。具体实施例方式木发明允许进行较大体积未制备全血的分析，提供分析单独从白血细胞得到的mRNA的有效方法，去除rRNA和tRNA，提供稳定的mRNA回收并容易适合自动化。本发明提供了灵敏的定量系统,其包括使用即时PCR的完全定量，以及变化系数在2025%范围内优异的可重复性。而且，本发明适合各种疾病目标(表I)。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明不限定于任何特定的机械结构。然而，图1和2表示用于完成本发明高通量mRNA定量的优选结构。真空盒10形成该结构的基础。真空盒可以由任何充分结实足以忍受真空吸引的材料制成；『fr]优选fill]一;t性塑料材料。真空盒被改装成接收真空源来进行真空吸引i2。过滤器塞i4宝P什H'T盒的真空吸引仪转接器之间。真宇盒iO优选具有突出物16来与多孔过滤板40或AH」选择的多孔支持物2()相配。在真空盒上部内可选择设有多孔支持物20以便支持多孔过滤板40。密封垫30优选包括硅基橡胶或者其它软艰料，位于多孔支持物的顶端。在密封垫的l:面，有多孔过滤板40，其包括多样品孔46、在样品传递孔下面的多个捕获白细胞过滤器42、以及在滤器下面的mRNA捕获带44。mRNA捕获带的孔屮含有固定的寡聚(dT)。—个优选的实施方式涉及从全血中简单、可重复和高通量定量mRNA的方法。快速实验方案使取血后mRNA的二级诱导或降解最小化，同时96孔过滤板和微板的使用使得nj以同时进行96个样品操作。在程序中最小化的操作提供了非常小的样品与样品间的变化，其中变化系数(CV)值小于3()%，即使在使用PCR作为定量方法的时候。在-寸实施方式中，该方法包括制备真空盒。在-寸优选实施方式中，在真空盒中加入血胞囊例如聚丙烯酸酯聚合物基质(RedZ，Safetec)以固化血液。接着在真空盒中放入多孔支持物。然后将由硅基橡胶或其它软塑料制成的密封垫放于多孔板支持物的顶部。将过滤器塞(X-695),60uFilterPlugH:DPE,PorexProductsGroups)放置在真空盒的真空吸引仪转接器内。在这个实施方式中，该方法包括制备过滤板。使用玻璃纤维膜或者白细胞过滤膜来捕获o细胞。为了简化检测，使用玻璃纤维膜或者o细胞过滤膜来构迂-孔过滤板，以能够同时处理多个血样。在美国专利No,4，925，572和4，880，548中么、J|了川来捕获白细胞过滤器的实施例，其所公开的内容在这里引入作为参考。通常采用将白细胞吸附在过滤器表面作为去除白细胞的机制。由于给定重量纤维的表面与纤维的直径成反比，因此,预期更细的纤维将具有更高的能力，并且如果所使用纤维直径更小，达到期望效率所必需的纤维重量将更小。大還:通常使用的纤维包括聚酷、聚酰胺和丙烯酸树脂，其进行辐射枝接，由于其对在所需接枝水平的y-射线所引起的降解有充分抗性，并且具有可获得单体进行反应的结构。PBT已经成为用于开发本发明产品的主要树脂，并且是实施例屮所使用的树脂。然而，需要注意的是发现其它树脂可以纤维化或者收集作为1.5微米或更小的纤维垫或者网，以及临界湿润表面张力被调节到最优范围内的产品nj以很好的适合制造相同效率但更少白细胞损失的设备。相似的，适当处理的玻璃纤维对于制造有效设备是有用的。当使用PBT基过滤器时，a)4mRNA的吸附是玻璃纤维基过滤器的4倍。过滤板置于真空盒内。在另--优选实施方式中，多个过滤膜被^叠在-'起来提高从全血中捕获白细胞的量。在-^个优选实施方式中，过滤板置于板支持物和密封垫l:。在另一实施方式巾，过滤板用塑料胶带(Bio-Rad223-9444)密封，并且该胶带被切割使得允许以希望数目的孔进入。在另一实施方式屮，用低渗缓冲液(20pL5mMTris，pH7.4)对加入样品的每个孔进行清洗。该方法优选包括收集血、将血加到多孔过滤板以及去除红細胞和其它非0细胞组分。在一个优选实施方式中，全血被吸入含有抗凝血剂的血收集管中，其提高了白细胞的过滤效率。抗凝血剂，肝素，在提高白细胞过滤效率方面是特别有效的。在-一个优选实施方式中，血样品被冷冻，这去除了某些破坏mRNA的RNA酶。用低渗缓冲液对孔进行清洗。一旦血被加入到过滤板上期望数目的孔中，将血过滤通过过滤膜。可以通过本领域技术人员任何已知的技术来实施过滤，例如离心、真空吸引或者正压。在--个特别优选的实施方式中，在将血样品加入到过滤板孔中后开始真空吸引(使J1:j6cmHg)。ltj低渗缓冲液(12X，20()uL5mMTris，pH7.4)对每个孔清洗多次。在另一优选的实施方式中，使用乙醇(1X，200uL100%乙醇)对含W样品的每个孔进行清洗,其是在真空吸引过程中T燥过滤膜并显著提高捕获白细胞的效率。在另一实施方式中，采用真空(20cmHg进行大于2分钟)。该方法包括细胞裂解以及mRNA杂交到固定在mRNA捕获带内的寡聚(dT)上。将裂解缓冲液应用到过滤板孔(40uL/'孔)，进行孵育(室温下进行20分钟)以从被捕获的白细胞巾释放出mRNA。在一个优选的实施方式中，将多孔过滤板密封在塑料包中并进行离心(IECMultiRF，2000转/分钟，4C进行1分钟)。接着再加入裂解缓冲液(20uL/孔)，接下来进行离心(誦ultiRF，3000转/分钟，4-C进行5分钟)。接着从离心机屮去除多孔过滤板并进行孵育(室温下2小时)。根据优选的实施方式，裂解缓冲液包括去污剂、盐、pH:缓冲液、硫氛酸胍和蛋白酶K。裂解缓冲液的优选实施方式含有至少一种去污剂,但可以含有一种以....匕去污齐U。本领域技术人员可以利用具有不M强度的去污剂浓度的fH组合来得到各种类型细胞不同膜的不同水平的裂解。例如，I:GEPALCA-630是比N-月桂肌氨酸(N-Laurosarcosine)弱的去污剂，在一个实施方式中，单独IGEPALCA-630足以裂解细胞质膜。在另--实施方式中，强去污剂例如N-月桂肌氨酸可以与一种或者更多种弱去污剂结合使用来优化对细胞核膜的裂解。去污剂优选足以裂解至少细胞质膜。另一优选的实施方式包括足以裂解细胞核膜的去污剂，因为显著量的mRNA残余在细胞核中。在某些情况下，希望只检测细胞质mRNA，而其它情况下希望检测细胞质和细胞核中的mWA。裂解缓冲液的强去污剂优选包括但不限TN-月桂酰肌氨酸、S.D.S、脱氧胆酸盐和十六烷基三甲基溴化铵。弱去污剂包括IGEPALCA-630、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、辛基-P-D-吡喃型葡萄糖苷或者其它本领域技术人员已知的去污剂。裂解缓冲液屮可以使用().052%的去污齐U。-一个特别优选的裂解缓冲液实施方式含:丫/0.5XN-月桂酰肌氨酸。另-一个优选的裂解缓冲液实施方式含有0,12%IGEPALCA-630。特别优选的实施方式含有0,1%IGEPALCA-630。盐和螯合剂的组合也可以作为裂解剂。例如75uMNaCI和24PMNa-KI)TA可'以作为裂解剂。裂解剂的实施方式可以含有其它本领域技术人员已知的其它裂解剂。裂解缓冲液的盐作为mRM-寡聚(d':[')杂夂剂。按照木领域技术人员可以确定的，优选具有不超过4XSSC的严格程度(与其力:补DNA序列杂交在--起的严格程度)。裂解缓冲液的其它实施力'式包括NaCl或者其它本领域技术人员已知的盐。优选裂解缓冲液贮液的pH缓冲液维持在7.08.OpH。一个实施方式含仃ImMl()()mM:Tris:HCl，pH7.'1。在特别优选的实施方式中，pH:缓冲液含有].OmMTrisHCl，PH7.4。裂解缓冲液的其它优选实施方式含有本领域技术人员已知的PH缓冲液，其包括具有().03%H2()2的().1M柠檬酸盐—磷酸盐，pH5.()。根据裂解缓冲液特别优选的实施方式，硫氰酸胍作为RNA酶失活剂。我们发现，在现有技术中通常使用的硫氰酸胍不具有有效的浓度。冈此，优选的，硫氰酸胍的浓度大于1.4M。硫氰酸胍浓度可以高到IOM，更优选不高于2M。然而，如图11所示，浓度超过1,7M时,裂解缓冲液的效率降低了。因此，优选实施方式使用大约i.4大约i.75:M:的硫氰酸胍。一个优选的实施方式含W1.71.8M硫氰酸胍。按照下面实施例4所描述的，工作裂解缓冲液nj以从贮液中制备，其具有1.791M硫氛酸胍的精确浓度。在将其它试剂加入到裂解缓冲液时，硫氰酸胍的浓度被稀释。将55ml的其它试剂加入到iml实施例4中的缓冲液时，优选的裂解缓冲液含有大约1.61大约1.71M的硫氰酸胍。这样，优选的实施方式含有浓度在大约1.6大约1.7M的硫氰酸胍。特别优选的实施方式进一步含有2()mg/ml的蛋白酶K作为:RNA酶失活剂。裂解缓冲液的--一个优选实施方式含有200ug/ml20mg/ml的蛋白酶K。另一优选实施方式含有200pg/ml1,()mg/ml的蛋白酶K。另一优选实施方式含有200uKml500ug/ml的蛋O酶K。十二烷基硫酸钠也可以作为RNA酶失活剂。另一实施方式含丫]0.110%的2-巯基乙醇作为RNA酶失活剂。一个特别优选的实施例包括1%2-巯^t乙醇。RNA酶失活剂的其它实施方式可以优选包括本领域技术人员已知的降低RNA酶中一硫健的材料。裂解缓冲液的优选实施方式进一步含有螯合Mg2+和C的&曰、剂。一个优选的实施方式含有0,1mM5mMEDTA。特别优选的实施方式含有1mMEDTA。裂解缓冲液贮液的其它优选实施方式含有木领域技术人员已知的螯合剂，其包括但不限于EDTM:P、2，3-二巯基丙醇和EGTA。裂解缓冲液的优选实施方式可以含l7tRNA，其来自各种来源并含:fj—其以抑制非特异性血衍生DNA和RNA吸附到过滤板上。另外，t:RNA的存在防止血衍生:RNA的降解。在优选实施方式中，工作裂解缓冲液的LRNA包括i0mg/ml大肠杆菌(E.coli)LRNA。其它实施方式可以含有来自任何本领域技术人员已知来源的tRNA。裂解缓冲液的优选实施方式可以含有来自广泛多种来源的DNA,其被加入以抑制非特异性血衍生DM和RM吸附到过滤板k。工作裂解缓冲液的DNA包括lOmg/ml的超声降解的鲑鱼精子DNA。在其它实施方式中，可以使用来fi其它生物的DNA。裂解缓冲液特别优选的实施方式可以含有掺标对照RM来计算目标mRNA在原始样品中的精确量。在本发明的实施方式之前，难以将一个实验的结果与其他实验的结果进行比较，因为研究所与研究所之间的变化和缺少标准化。然rfn，在本发明的优选实施方式中，通过将利用TaqMan检验所得到的数值除以每个样品中掺标对照RNA剂量的回收百分率，来确定冃标的精确量。F面描述并在实施例5中示范了这样的粘确C^,裂解缓冲液的优选实施方式每个孔中含有101Xo'。，更优选lXo°1X,个掺标RNA的拷贝。在优选实施方式中，所使用对照RNA的量至少足以被检测，但不能多到显著地干涉需要定量的目标mRNA的量。在优选实施方式中，加入到裂解缓冲液中的对照RNA是多聚(A)+RNA。在特别优选实施方式屮，其屮检测样品是人血，对照RM与人血屮存在的RNA不同源。在某些优选实施方式中，对照RNA的序列与目标mRNA的同源性小于90%，或者与目标mRNA在K度上有大f10%的差异。在其它优选实施方式中，对照RNA的序列与目标mRNA的同源性小于85%，或者与目标mRNA在长度上有大于5%的差异。在进-一歩实施方式中，对照,A的序列与冃标mRNA的同源性小于75%，或者与冃标mRNA在长度....匕有大于2%的差异。在可以替代的实施方式中，对照RNA的序列与目标mRNA的M源性小丁'65%，或者与目标mRNA在长度l:有大于1%的差异。在一个实施方式中，对照RNA可以优选地通过PCR方法扩增模板寡聚核苷酸来制备。因此，可以使用正向引物(SEQIDNos:10、11、15和8)、反向引物(SEQIDN():9、16禾P9)以及TaqMan探针(FAM-SEQIDNO13-TA:M:RA、F雄-SEQIDN017-TAMM和FAM-SEQIDNO12-TAMM)来扩增各种对照RNA寡聚核昔酸。可替代的实施方式包括使用多个不同的需要定量的目标DiRM。进一步的实施方式包括使用多个对照RNA。该方法包括对mRNA进行定量，在优选实施方式中需要由mRNA合成cDNA和使用PCR扩增cDNA。在-'个优选实施方式中，使用裂解缓冲液(150ul/孔X3次，手工)和清洗缓冲液(150u1/孔X3次，手工或者BioTekftG4)对多孔过滤板进行清洗。接着，将cDNA合成缓冲液加入到多孔过滤板(40u1/孔，手工或者顆6)。将Axymat(AmgenAM-96-PCR-RD)放置在多孔过滤板上，接着将其放在热块(37C，VWR)上并孵育(>90分钟)。然后，将多孔过滤板进行离心(2000转Z分钟,4C下1分钟)。将PCR引物加入384孔PCR板，将cDNA从多孔过滤板转移到384孔PCR板。对:PCR板进行离心(2000转/分钟，4C下丄分钟)，开始即时PCR(TaqMan/SYBER)。如下面实施例6所述，另一优选实施方式包括在mRNA杂交或者d)NA合成过程中应用特异性反义引物。寡聚(dT)和特异性引物(NNNN)M时在多聚-ARNA的不M位置引导cDNA的合成(图15)。如图15所示，特异性引物(NNNN)和寡聚(d':[')在扩增过程巾引起cDNA的形成。即使通过在95。C对每个孔加热2分钟将特异性引物衍生的cDNA去除，由加热变性程序(使用T叫Man定量PCR)所得到特异性CMcDNA的量也与由未加热阴性对照中所得到的量相似(图16)。不希望被任何解释或者理论所限制，这种结果一个可能的解释就是在扩增过程中寡聚((JT)衍牛的cDNA可以杼换引物衍牛的d)NA(图i5)。这是特别方便的，因为加热变性程序被完全排除。而且，为不同冃的加入多种反义引物，可以从残余的cDNA扩增出每种基因，将GonoPlatc内寡聚(dT)衍生的cDNA贮存以用丁'将来。木发明的另一优选实施方式包括进行高通還:定.S来自全血mRNA的设备。该设备包括多孔过滤板，其含有多个样品传输孑L、在样品传输孔下方捕获白细胞的过滤器、以及在滤器下方的niMA捕获带，其含有固定在niRM捕获带的孔屮的寡聚(d':[')。为了提高白细胞的收集效率，将多个过滤膜层叠在一起。将多孔板安装在真空盒上，其适合容纳过滤板并在多孔板和真空盒之间形成密封。在该设备的一个优选实施方式中，真空盒适合容纳真空源以进行真空吸引。在另-一优选实施方式中，多孔支持物置--丁良个'盒内，在多孔过滤板的下方。在该设备的一个优选实施方式中，将可以由软塑料例如硅^枚胶制成的密封垫插入多孔支持物和多孔过滤板之间。尽管许多传统的扩增技术可以与木发明结合使用，但木发明特别优选的实施方式包括使用全血衍生RNA和对照RNA进行即时定量PCR(TaqMan)。Holland等人的PNAS88:72767280(1.991)描述了一种T叫Man检验的检验。在聚合酶链式反应产物检测系统屮采用Taq聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性以伴随扩增产生特异性可检测的信号。一种寡聚核苷酸探针，3'末端不能延伸，5'末端被标记，并被设计成在目标序列内部杂交，将该探针引入到聚合酶链式反应检验中。在扩增过程中，探针与聚合酶链式反应产物链中之一的退火产生了适合核酸外切酶活性的底物。在扩增过程中，Taq聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性把探针降解成更小的片段，其可以与未降解的探针区别开。这种检验是敏感和特异性的，并且相对于更多麻烦的检测方法有显著的改进。Gelfand等人的美国专利No,5，210，015和Holland等人的PNAS88:72767280(1991)描述了这种检验的一个版本，在这里引用作为参考。进-一歩，Fisher等人的美国专利No,5，491，063提供了TaqMan型检验。Fisher等人的方法提供了一种反应，其导致被发射光标记所标记的单链寡聚核苷酸探针的剪切，其中该反应是在出现DNA结合化合物时进行的，该化合物与标记相—Ef—作用以修饰标记的发射光。该方法利用标记探针的发射光变化，其来自于探针的降解。该方法通常可以应用于利用导致寡聚核-ff酸探针剪切的反应的检验，特别的，可以应用TM源扩增/检测的检验，其中杂交的探针随着引物的延伸而被剪切。提供了同源扩增/检测的检验，其可以同时进行扩增目标累积的检测和目标序列的序列特异性检测。Fisher等人的美国专利No.5，491，063在此引入作为参考。TaqMan检测的检验为经典的PCR检验提供了多种优点。'宵先，T叫Man检测将PCR的灵敏性和目标序列中存在的内部寡聚核苷酸序列的杂交结合在一起。经过PCR，样品不需要必须在琼脂糖凝胶上分离，并目.取消了用来确定PCR产物同一性所必须的后续SouLheiii印迹和杂交步骤。这些附加的PCR后确认步骤可以容易地连续多天以进行精确的鉴定。使用TaqMan系统，在2.5小时内完成该检验。进-'步,检验步骤中所采用的方法使有效地处理大一的样品并没有夂叉污染成为可能，冈此其适合遥控取样。其结果是，使用T叫Man检验可以在非常短的时间内处理人量的检测样品。TaqMan系统的另-一个优点是用于多元化的潜力。由于可以使用不同的荧光报告子染色剂来构建探针，因此在相同的PCR反应中可以结合几种不同的:H:[v系统，这样降低了在每个检验是单独进行的情况下会发生的劳力成本。快速和最终数据的优点结合劳力和成本效率使得使用本发明特异性引物的TaqMan检测系统成为用于监测mv存在的有利的系统。在优选的实施方式中，通过简单的为每个目标改变引物和探针，可以对各种mRNA进行定量。冈为肝素含有细胞外Ca2+，这是发挥最大生物学活性的重要冈素之一，冈此可以在全血中对药物作用进行分析，而不需要分离白细胞。在本发明优选的实施力'式屮，使用已知量掺标标准:RNA来确定给定样品总效率的能力来自于无关于剂量和无关于序列的实施方式。使用已知量的对照RNA可以将PCR检测转化为原始样品中目标DiRNA的量。随着时间对个体的大样品进行这样的计算，以确定每ul全血中各种基因mRNA存4:的通常范闺。将本发明的实施方式用于在给定时间检测个休全血时，表明存在暗示疾病的mRNA的结果，其水平落在止常范围之外，发出疾病存在的信3。本发明的实施方式用丁'检测各种疾病的检验。例如，通过在许多样品中诱导mRNA到最大希望的水平，检测给定样品的mRNA，并检测样品的mRM水平以确定其是否降到最大水平以下，从而来检测暗示疾病的mRNA。相似的，本发明的实施方式可以用于确定医疗领域的效率。相似的，本发明的实施方式可以用于氧化压力测试，其屮对使州不同量抗氧化剂的人样品的mRNA水平进行互相比较。另一优选的实施方式涉及一忡卨通gg全血中mRNA的试剂盒。该试剂盒包括高通量定量全血中mRNA的设各、含月l素的lfll收^'R'、ftX湾缓冲液和裂解缓冲液。另一优选的实施方式涉及一种川f卨通^',i:#全血中mRNA的全自动系统，其包括向设备加入血样、低渗缓冲液和裂解缓冲液的遥控设备；自动真空吸引仪和离心机，以及自动PC:R仪。实施例实施例1对本发明方法的各种方案进行测试并将其用于定量全血的肌动蛋白mRNA和CD4m醒。检测三种抗凝血剂ACD、EDTA和肝素，其中肝素导致了最大比例的白细胞保留。白血球吸附(I.eukosort)膜已经用于输血中的ACD血，即使将M层膜同日寸使用，也通过了大约1540%的白细胞。对EDTA血进行测试，发现其能力和白细胞保留与ACD的相似。然而，特别注意的是1()()%肝素血液中的白细胞被捕获在白血球吸附膜I:。对来自肝素血液白细胞的100X捕获表现了使用本发明mRNA定量的有效性。这些数据说明使用肝素血最适合m:RNA的精确定量，而ACD血对于需要大体积血和较小定量结果的应ltj是有jlj的。对使用冷冻血和新鲜血样品的结果进行了比较。如图3所说明的，从新鲜血泄漏细胞中回收了比冷冻样品泄漏细胞多的CMmRNA。还测试了玻璃纤维过滤器全血保留的效率，相对于raT-基过滤膜的保留值。如表Ii所示，即使在使用低渗缓冲液(5()niMTris，pH7.4)对膜进行清洗的时候，玻璃纤维膜只接受40uL的全血。然而，如表II所示，白血球吸附过滤器接受丫.M著地比玻璃纤维过滤器较大量的全血。表11,扩增全血中P-肌动蛋白mRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>VWR)并孵育(>90分钟)。然后离心多孔过滤板(2000转Z分钟,4C下1分钟)。将PCR引物加入到3M-孔PCR板，并将c:[)NA从多孔过滤板转移到384-孔PCR板。图8说明用于PCR的最佳cDNA值为2uL/孔。对PCR板进行离心(2000转/分钟，4C下丄分钟)，然后开始即时'PCR(T叫Mati/SYBBR)。本发明的方法具有卨'm隠特异性；使用T叫ManqPCR对CMmRNA进行扩增达到'/无法检测的DM浓度(<10拷贝/孔)。如图9所示，木发明达到m脂A定.S变化的低系数。与传统的变化系数大约300%的mRNA定量变化系数相比，杂交两个小时可以达到小于13%的变化系数。而且，如图IO所示,线性结果表示所捕获的m:RNA的量与每孔全血的体积有接成比例，这使得本发明是定量mRNA的仃效和可重复方法。实施例2将50uL肝素化的冷冻人血应用到白血球吸附过滤板。对每个孔进行真空处理并使用150pL5mMTrispH7.4和150uL1()()%的乙醇进行清洗12次。接着，将40uI,含有1.7071.856M硫氰酸胍的裂解缓冲液加入到孔中。在室温下孵育15分钟后，将过滤板置于GenePlatek并以2000转/分钟在4C下离心1分钟。再加入20uL裂解缓冲液，样品离心5分钟。在将GenePlate孵育2小时后，使用100uL裂解缓冲液对每个孔进行清洗3次，接着应rtj3次150uL清洗缓冲液(l()iiiMTrispH:7,4,ImMEDTApH:8,0,0,5:M:NaCl)。在GenePlate内合成cDNA，并使用2uLcDNA用于TaqMan检验以定量CD4。图11中表示了i亥结果。实施例3将5()PIJ干素化的冷冻人血应用到白血球吸附过滤板。对每个孔进行真空处理并使用150uL5mMTrispH7,4和150uL100%的乙醇进行淸洗12次。接着，将40uL含有1.791.M硫氰酸胍和()0.5mg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液加入到孔巾。在室温下孵育15分钟后，将过滤板置于GenePlate上并以2000转./分钟在4C下离心1分钟。再加入20uL裂解缓冲液并再离心5分钟。在将GenePlate孵育2小时后，使用100UL裂解缓冲液对每个孔进行清洗3次，接着应用150uL清洗缓冲液(lOmlTrispH7,4,1mMEDTApH8.O，O.5MNaCl)3次。在GenePlate内合成c醒,并使用2PLd)NA用fTaqMan检验以定量CD4。图丄2中表示了该结果。实施例4裂解缓冲液ll::液().5%N-月桂酰肌氨酸4XSSCl()mMTrisH:C1，p:H7,41mMEDTA0,1%IG:EPALCA—630丄.79丄M硫氰酸胍工作裂解缓冲液裂解缓冲液贮液lml2-巯基乙醇10PL超声降解的鲑鱼精子DM(10mg/ml)10uL大肠杆菌-t.RNA(lOmg/ml)蛋白酶K(20mg/ml贮液)10uL25uL(最终().5mg/ml)实施例5制备对照隠为了合成对照隠，使用T7-止:向引物(S卜:Q11)NO3、5和6)以及dT切反向引物(T40-SEQIDNO1和T4。-SEQIDNO7)对模板寡聚核—ff酸(SEQIDNO2和4)以及来自K562细胞的c:[)NMRNMure，Irvine,CA)进行扩增，其分别通过30个95。C变性30秒、55。C退火20秒，然后72。C延迟20秒的循环。寡聚核苷酸是从IDT(Coralville，IA)或者Proligo(:Boulder，C())购买的。序列如下SEQIDNO1:5'-GGGTGCTGTGCTTCTGTGAAC-3''，SEQIDNO2:5'-GCCCCCTCACTCCCAMTTCCAAGGCCCAGCCCTCACACATTGTTCACAGAAGCACAGCACCC-3'，S卜:QIDNO3:5'-GT'AATACGACTCACTAT'AG(;GGGACAGCCCCCTCACTCCCAAA-3'，SEQIDNO4:5'-GAAGCGTGTGTCACTGTGTGTTTCCAAGGCCCM〗CCCTCACACATTGTTCACAGAAGCACAGCACCC-3''，SEQIDNO5:5'—GTAATACGACTCACTATAGGGGGACGGAAGCGTGTGTCACTGTGTGT-3''，SEQIDNO6:5'-GTAATACGACTCACTATAGGGGGACGCATTCCGCTGACCATCAATA-3'，S卜:QII)NO7:5'—T'CCAACGA(;C(;(;CTTCAC—:V。通过体外转录系统(T7RiboMaxExpress,Promoga)在37。C下进行30分钟来从纯化的PCR产物合成:RNA，接着用DNA酶处理15分钟两次。将纯化的RM产物悬浮在无核酸酶的水中，并以rRNA作为标准通过RiboGreen(MolecularProbes)检验来确定其浓度。通过毛细管电泳芯片(iChip,H:itachiChemical，日本东京)来分析其质量。收集白细胞从健康的成年志愿者收集静脉血样。由指定的供应商获得玻璃纤维过滤板(RNAture)和白血球吸附膜(PallLifeSciences,AnnArbor,MI)。tilWhatman-Polyflltronics(Cl丄fton，NJ)制造定制的96-孔白血球吸附过滤板。由于认为人血样是传染的材料，因此设计了一次性真空管，并由Ambritt.Bngineering(SantaAna,CA)制造定制的产品。将过滤板置T.'次性真空管上并用200uL磷酸缓冲盐水(PBS:I:nvitrogen，carlbad，CA)清洗两次。停止真空后，接着向过滤板施加新鲜或者化冻的血样(达到200liLZ孔)。在将所有的样品分配入过滤板中后，开始14cmllg的真空过滤，接着用PBS清洗(200PL/孔)12次。最后一次清洗后，继续真空5分钟以使膜完全千燥并从膜去除残余量的ras。裂解细胞和制备mRNA将过滤板置f空白微孔板上，接着应用'10PL裂解缓冲液(RNAture,Irvine,CA)，其含有反向引物(终浓度为25nM)、作为定量标准的合成隠、1()()Ug/mL鲑鱼精子隱(Bppendorf'-5Prime,West.bury，NY)、l()()ug/mL大肠杆菌(E,coli)t.RNA(Sigma)、500ug'/mL蛋白酶K(Piorcc,Rockford，IL)以及1:100稀释的2-巯基乙醇(BioRad，:Hercules，CA)。将样品在室温下孵育1.个小时。在某些实验中(图14C14D)，将各种浓度的寡聚dA加加入到裂解缓冲液中。接着将过滤板置于固定寡聚(dT)的微孔板上(GenePlate，RNA-ture),接着在650Xg下离心1分钟。然后加入20uL裂解缓冲液，接着在1450Xg下离心5分钟。进行该步骤后，在GenePlate每个孔中裂解缓冲液的休积大约为50uL。将GenePlate进行孵育后，使用i00uL淸澈的裂解缓冲液对该板进行清洗3次，然后用150PL清洗缓冲液清洗3次(H)mMTrispH7.4，ImM卜:DT'A,().5MNaCI)。合成cDNA通过加入30uLcDNA缓冲液在GcncPlato内合成cDNA，其含有1XRT缓冲液、0.5m:MdNTP、15申.位的rRNasin和37.5竿.位的M:MLV反转录酶(:Promega)。将该样品在37'C孵育2小时。由于反向引物加入到裂解缓冲液中，cDNA合成反应中不包括引物。合成c:[)NA后，将50uL无核酸酶的水加入到每个孔屮，并使ltj2uL进行下面所述的Taq:M:an检验。TaqMan即时:PCR通过PrimerExpress2,0版(ABI，FosterCity,CA)设计对照RNA用的引物和T叫Man探针。对于bcr-abl，我们使用公开的序列。在某些实验中，使用HYB模拟器(RNAture)来设计反向引物。使用止:向引物(S卜:QH)NOl()、11、15和8)、反向引物(SEQIDNO9禾卩16)以及TaqMan探针(FAM-SEQIDNO13-TAMM，FAM-SEQIDNO17-TAMRA和FAM-SEQIDN01.2-TAMRA)来扩增对照RNA。为了确定血样巾CD4mRNA的量，在PCR板的不同孔中分析CD4和对照RNA，而不是在-一个孔中进行多个PCR。对于P-肌动蛋白，使用可商业获得的引物和探针(ABI)。将下列物质混合入384孔PCR板(ABI)屮2uLcDNA、5uLTaqMan通用主混和(mastermix)(ABI)、1uL5uM的正向引物、1UL5uM的反向引物以及l"L2uM的TaqMan探针。在ABIPRISM7900HT(AB]:)中进行PC:R，1个循环90°Ci0分钟，接着进行45个循环的90°C20秒、接着55°C20秒和最后的60°Ci分钟。使用SDS2.()版(则对数据进行分析。在某些实验中，直接在GenePlate(()pticon，MJRos痕h)内进行TaqMan检验。使用寡聚核甘'酸(SEQIDNO2、4和14)以及PCR产物作为对照RM的定量标准。序列如下SEQIDNO8:5'-AAATGCCACACGGCTCTCA-3'SEQIDNO9:5'-CAAGTGTCTTCGTGTCGTGGG-,'SEQIDNO10:5'-AGCCC'CCTCAC'TCCC'AAA-3'SEQIDNO11:5''-AGCCCCCTCACTCCCAAA-3'SEQIDNO丄2:5'-CAGTGGCTAGTGGTGGGTACTCAATGTGTACTT-3's卜:qii)no13:5''-c薩；gccca(;ccctcacaca-3'SEQIDNO14:5''-CAGGGACAAATGCCACACGGCTCTCACCAGTGGCTAGTGTACTCA雄TGTACTTTTGGGTTCACM蒸;C濕GCACCCAGGG-,'■，SEQIDNO15:5''-CCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAA-:3'SEQIDNO16:5'-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3'SEQIDNO17:5''—C'AGCGGCC'AGTAGCATCTGAC'TTTGA—3'。分析数据使用每个基因的标准曲线来确定PCR产物的量。然后将TaqMan结果乘以稀释系数(X40:80uLcDNA中取出2"L用于PCR，并Xi,67:从50"L裂舰德油液/孔合成3()PLd)NA)。进一歩通过将回收的掺标RNA除以预先确定的掺标RNA的g(通常为每孔107个拷贝)，从而确定每个样品掺标RNA的回收率。对TCMmRNA，将1<^皿皿结果乘以稀释系数，除以体积，再除以相同样品巾掺标RM的回收率。将每个血样施加到过滤板的3个孔中(3份)，每个孔得到每个基因的单cDNA和单PCR。检验心效性图13A表示了杂交动力学，其中在室温下2小时后杂交达到平稳期。图l:犯中描述了血剂量依赖性，其中CMmRNA检测为0.05uL,并以对数级线性提高到200uL。我们也发现杂交效率在i525。C之间显著变化(图i3C)。如图i3D所示，CMmRNA在肝素化血中非常稳定，并大部分在37TT卩7小时或者4,C过夜而不改变。这说明Cl)4可以是全血中基因表达分析的良好对照。图13中的结果表达为基因数目的平均值±标准偏差。尽管循环极限(Ct)的CV小于1.2%，但在通过从对数级别转化成线性级别而将Ct转化成基因数目时，其实质性地提高。然而，如图13所示，即使当起始材料为全血时，CV仍低到10:碼。定景本次研究中定景的目的是通过掺标对照RNA的使用来确定每个样品的总检验效率,其被进一步用作计算原样品中目标mRNA精确量的标准。该原理包括两个假设:RM的回收是不依赖于剂量，以及该回收不依赖于种类。换句话说，在高拷贝数和低拷贝数mRNA之间，以及在不同序列的mRNA之间，回收率应该是相同的。这些假设不仅应用于mRNA纯化步骤，而且应用T从细胞裂解到PCR的整个mRNA定量过程。为丫使第-、个假设有效，将不同说的多聚(A)i对照:RNA加入到裂解缓冲液中，并将其暴露到应用50uL血的白血球吸附膜上。在我们确认对照RNA没有从单独人血中扩增后，通过TaqMan检验来确定对照RNA的隨。如图14A所示，在l()5l()9拷贝/孔的检测范围内，观察到对照醒依赖于剂量的冋收。如果将相同的数据转化成冋收率,这些数值将在大约20%处变得相似(图14B)。图MA和14B的数据是整个过程的总和，其包括mRNA纯化和cDNA合成。在杂交平衡的情况下，解离常数(Kd)按照如下进行计算Kd=[隠]X[寡聚dT]/[隠:寡聚clT'];其中[隠]和[寡聚d'「]分别代表RNA和寡聚dT自由状态的浓度，[RM:寡聚dT]代表与寡聚dT杂交的RNA的浓度。这意味着[RNA:寡聚d':[']是随所应用RNA的&釘变化的。事实匕在用Yoyo-1.核酸染料检测杂夂的RM时，[RNA:寡聚dT]是与所应用醒的量成比例提高的(Miura，Y,，Ichikawa，Y,，Ishikawa，T,，()gura，M:,，deFries,R.,Shimada,H.，&Mitsuhashi,M.FluorometricdeterminationoftotalmRNAwitholigo(dT)immobilizedonmicrotiterplates.ClinC'hem.42，17586-1，1996年)。然rfi]，因为图14B中对照RNA是每个孔中总mRNA非常小的一部分，因此其实际上不影响这个范闺内M的数值。当合成cDNA的歩骤中含有引物时，我们将面对种类内和种类间重复性的问题。然而，通过在杂交过程中加入引物，重复性提卨'，说明即使在弓I物序列不M的情况下，cDNA也是从预杂交的引物中被M等合成。尽管回收率本身可以在依赖样品巾mRNA量的个体之间变化，但是图1.4A和14B说明来自一个浓度的回收率可以应用到在相同样品的其它浓度中。为了t》;则第二个假设，即M收不依赖种类，杂交被裂解缓冲液屮的寡聚dA竞争性抑制，其中-'种合成的多聚(A)—;—RNA。如图14B所示，冋收的RNA在-:种掺标RNA以及目标原有CI)lm廳屮变化，因为我们特意使用了不同量的醒。然rff]所有RNA都被3X1012丄0"拷贝/孔的寡聚dA所抑制(图i4C)。有意思的是，在将相同的数据转化成目前的总百分率时，所有四种RNA表现了与大约3X1()12个拷贝/孔的IC5。非常相似的抑制曲线。这说明，在我们系统中mRNA的纯化是寡聚(A)特异性并且不依赖序列。如图14C所述，即使在应用1()is个寡聚dA拷贝时，某些非特异活性仍然保留。然而，如图14D所示，这种非特异性活性小于总活性的5%。这样，非多聚(A)序列似乎在该检验中没有发挥重要的作用。因为图14B和14C是mRNA定量全部歩骤的总和，因此，这^同表示，即使在序列不相同的情况'卜'，目标基因的检验效率与掺标合成的RM相同。这同日」说明将T叫Man检验所得到数值除以每个样品中掺标对照RNA单剂量的回收百分率，从而获得目标mRNA的精确量。如图13和14所示，检验中的变化为大约1()2()%。为了估计检验之间变化，除了来自相M个体的新鲜或者冷冻血外,还使用相NJ的冷冻部分进行7个不NJ的实验。在每个实验巾，使用不同的过滤板和GenePlate，并制备用于裂解、d)M合成和PC:R的新鲜材料。如下面表III所示，对照RNA的回收率为429%。当不考虑对照RNA的回收，我们比较CM量的时候,这些数值会广泛地变化。然而，在用每个样品屮回收率调整后，数值会变得很相似，旦:中检验间的CV是714%。表111掺标:RNA回收和CD4mRNA记g:的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*:拷贝数=1()'(AXCt+B)**:第一次后两天，从相同个体取出的第二次血图13A13D证明了检验的有效性。对来fi50uL肝素化人全血(图13A、:B和D)或者合成对照RNA(图13C)的cDNA进行T叫Man检验。图13A表示杂交动力学。血等分在-80i:冷冻。在不同的时间对同样的血等分进行化冻，并应用到过滤板上以调整杂交杂交长度在室温下从30270分钟。图i3B表示剂量反应。使用PBS进行i0、i00和i000倍稀释，并将5()2()()uL的样品应用到过滤板。图13C表示杂交温度。在4、15、25和37。C下进行杂交2个小时。图13D表示肝素化全血的稳定性。将血样保存在4"C或者37"C下不同的时间长度，将每个样品进行申.独冷冻。将样品同时解冻并将其应用到过滤板。数据表达为平均值±标准偏差。图14A141)代表合成的掺标RNA的回收。在图14A和14-B屮，将0个RNA34的拷贝应用到每个孔。在进行mRNA纯化和cDNA合成后，通过T叫ManPCR确定对照醒的量。图1'1A表不回收的对照隱的量相对f加入的对照RNA的*(拷贝数)。图14B表示回收百分率，其按下式算出%回收率=回收的对照RNA/加入的对照RNAXl()()。图14C和14D表示在有寡聚dA存在时的回收百分率。将50uL肝素化血应用到白血球吸附过滤板后，将含有各种量对照RNA34(□)、对照RNA36(O)和对照bcr-abl(△)与015个寡聚dA2。拷贝施加到每个孔中。在mRNA纯化和cDNA合成后，通过TaqManPCR确定对照RNA的量。图14C表示冋收的RNA的量(拷贝数)相对于寡聚dA2。的量。在图MD中，总百分数按照下式算出%总数=回收的含有寡聚dA2。RNA的量/回收的不含有寡聚dA2。RNA的量X100。实施例6将50uL肝素化人血应用到附着4^白血球吸附膜的过滤板。对血进行真空吸引并用150uL5m:MTris(pH:7,4)清洗12次。接着将过滤板置于GenePlateI-—，并将40uL裂解缓冲液(含有或者不含CM的反义引物)应用到每个孔。通过离心将细胞裂解物从过滤板转移到GenePlate。使用40uL裂解缓冲液承::g该过程一次。将GenePlate在室温孵育2小时后，使用100uL裂解缓冲液对每个孔洁冼3次，然后-:次应用150uL清洗缓冲液。通过加入cDNA合成缓冲液和适当的酶在GenePlate每个孔i|!合成d)NA。在37°C孵育2小时后，使用i50"L9(TC的水将每个孔淸洗三遍。接着通过TaqMan即时PCR对GenePlaLe内的CD4mRNA进行检测。为'/使寡聚(dT)替代被特异引导(被NNNN)的cDNA的假设有效，在GonoPlato中使用或者不使用特异性引物来合成c:[)M。接着，直接从Genen:Plate中扩增CD4基冈。如图17所示，由两个样品扩增CM。这暗示上游cDNA被从固定的寡聚(dT)衍生的cDNA替代。实施例7整体方案如图18A所示，将全血应用到过滤板以捕获0细胞(1)。在用磷酸缓冲盐水(PBS:Invitrogen)清洗过滤板后，去除了红细胞和细胞质组分。这个过程比传统的密度梯度分离外周l(l单核细胞(P腿C)是更简单和更高通量的。如图i8B所示，(标准隠(O)、Cl)'l()、p21(i)、卜'asL()和白细胞二亚乙基M胺Oukotrien)C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))过滤板的杂交性能比密度梯度方法稍好。在PBMC中，白细胞三亚乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)mRM显著地少，可能冈为去除了粒细胞。然而，在:PBMC巾，p21mRNA显著地高，因为在长分离工艺中的二级诱导(图22)。比较了另--种方法，其中将全血进行离心，并沉淀悬浮在低渗溶液(l()mM:隨)3、15mMNH:4C1、()，14-mMEDTA,pH7,2)屮以使红细胞破裂，然后立刻离心以沉淀O细胞(图18B:低渗)。然而，C'D4、p21、FasL和LTC4S的水平都比过滤板方法中的低。如图iSA(II)所示，下-一歩是将裂解缓冲液应用到过滤板上并将裂解物转移到固定寡聚(dT)的微孔板以纯化mWA。为了评价该步骤，采用了二种其它的方法来进行比较。将苯酚/异氰酸胍(Trizol，Invitrogon)(图18C:P/GI)或者试剂盒供给的裂解缓冲液(RNeasy，Qiagen)(图18C:Silica)应用到过滤板的每个孔，接着根据产品的说明书手册由离心柱(硅)沉淀固A(P/GI)或者洗脱RNA。为了直接纯化多聚(AVRNA，将裂解缓冲液应用到过滤板，并将裂解物转移到固记S聚(dT)的微孔板(GenePlate，:RNAt.ure)(图18C:dTMP)或者新的微管中，其含W寡聚(dT)纤维素(Invitrogen)(图18C:dTC)。虽然在微管屮使川大别勺分离P:BM:C时，P/G]:、硅(Silica)禾Pd'TC方法表现了充分的性能，但是这些方法刈T过波:板休系不能很好地作用，其中只使用了50uL血(图i8C)。而日.，如果在管中裂解细胞沉淀，机械强度(震荡或者吹打(pipetting))的程度对于释放mRNA是必须的，这个步骤会造成实质性变化。然而，使用过滤板方法，细胞分散在膜内，而且应用裂解缓冲液足以工作而不需要任何附加的机械力。由于裂解缓冲液优选含有引物的混合物，因此两个独立的杂交反应同时发生(图18A)。一个发生在同定的同定寡聚(dT)和mRNA的多聚(A)尾端之间。另-一个杂交反应发生在特异性引物和mRNA的适当位置之间(图18A(n))。尽管特异性引物的设计是关键的，但是充分杂交时间使检验比在cDNA合成过程中引物的杂交更可重复。首先出现好像d)NAiRNA复合体通过与固定的寡聚(dT)杂交停留在固体表面(图18AH)。因此，通过在95i:加热5分钟从固体表面去除cDNA。然而，扩增基因的量与未热处理对照的相比没有变化(图1.8D嵌入物)。为了检测d)M-mRNA复合体是否被以某种方式从固体表面除去，在合成cDNA后，用水仔细地清洗微孔板，并直接用于PCR。然而，杂交步骤中使用或者不使用特异性引物都成功地扩增了目标基因(图181))。这些数据表明特异性引物引导的d)M可以被寡聚(dT)引导的cDNA代替(图18A(III、IV))。这使该系统^优势，因为溶液中的cDNA川十朵冈o^，微孔板自身可以作为cDM库用作有效、储存和将来使用。为/确认在裂解和后续杂交过程中RNA的稳定性，使用水或者浓縮的嗜曙红细胞提取物稀释含有相同量标准R,的各种浓度裂解缓冲液。如图18K所示，在将嗜曙红细胞提取物悬浮在清洗缓冲液(lOmlTrispH7.4,1mME亂0.5MNaCl)中时，其自身大大地破坏了标准:RNA的定量，其中将杂夂严格性维持在没有主要的裂解缓冲液组分。然而，当将嗜曙红细胞提取物悬浮在裂解缓冲液中时，RNA被保留并且与其水稀释溶液相似(图18E)。宽范围的最佳缓冲液浓度(70120%)使该体系耐用并且可至复。浓度高于140%的裂解缓冲液会显著降低检验性能。^tMi进行研究以确定最佳和nJ重复的条件，其表现出如图]9AF所不在5个不同目标RNA中相同的性能(标准RNA(O)、CD4(籲)、p2i(i)、FasL()和白细胞二亚乙基M胺C4合成酶ni^A(I..TC4S)(■))。可重复条件对于后续基因'疋'tt部分是关键的。图19中的每个数据点是来自单个典型实验三份(每份50uL)血等分的平均值±标准偏差(s.d.)。但是每个实验重复至少二到三次。首先，检测三种典型的抗凝血剂。尽管肝素表现出比ACD和EDTA稍好的性能，但是三种抗凝血剂都是可接受的(图19A)。由于ACD和EDTA螯合钙,其是许多生物学活性的关键组分，因此肝素是这个使用全血进行体外刺激项g的抗凝血剂的选择(图22)。在血解冻后保持全血的稳定性是主要的考虑。因此，某些商用系统(PAXgene、PreAnalyUx)使用特定的即刻裂解细胞的血容器，并日.释放的RNA稳定相对长时间。然而，大体积裂解物的操作使得整个体系有问题。而且，由于该项目的目标之一是在体外基因诱导之前和之后对mRNA进行定量(图22AH)，因此肝素化全血贮存在4°C以及检测在mRNA水平的变化。尽管四个正基冈(CD4、p21、FasL和LTC4S)的水平在血解冻后不稳定，但是一旦将血贮存在4E两小时后，该水平都变得稳定和恒定(图19B)。使用寡聚(dT)制备多聚(A)+m:RNA通常在室温进行。然而，其性能在2030。C之间会变化(图19C)。当使用短合成RNA时,在2023t:之间的变化是显著的(图19C)。因此，制备mRNA的步骤在4。CK进行。杂交的K度也是关键的。某些RNA(标准RNA和FasL)在两小时后达到了稳定状态，而其它需要四小时以上到八小时来稳定(图i9D)。因此，在4"C——R4行制备mRNA的步骤过夜。通过切换到这种条件，实质....匕改善了检验与检验之间的变化。不使用任何附加的引物合成c:[)NM图1.8D)。尽管短合成RNA和大還:RNA(CD4)需要少量的反转录酶，但其它RNA需要人约100单位的丽LV反转录酶拉达到稳定状态(图19E)。丫/趣的是，RNaseli-腿LV(S叩erscript，Invitrogen)与该体系中原来的丽LV相比表现出差的性能。在37t:孵育90分钟以上对f所有检测的:RNA的种类是充分的(数据未显示)。溶液中的齒直接用于后续的TaqMan即时PCR。该检验对转入PCR的c隱量的比例敏感。通常可以得到的缓冲液含有二硫苏糖醇(DTT)，其抑制PCR。因此，如图19F所示，最大的cDNA体积是2uL/10pL:PCR。通过从缓冲液巾去除DTT，c隱的体积提高到4uL/10liLPCR。皿本研究定量步骤的目标是通过利用已知量的掺标标准:RNA来确定每个样品中总检验效率，^进-一歩用作将PCR结果转化成原样品中目标mRNA量的标准。这个原则依赖两个假设具有不同丰度的相似DiRM样品之间的效率是一致的(不依赖剂量)；以及不同mRNA序列之间的效率是相同的(不依赖序列)。为了确认第-一个假设，将不同量的合成RNA标准加入到裂解缓冲液中，其暴露到含有5()iiL血的过滤板中。在确认标准RNA没有由单独人血中被扩增后，通过T叫ManPCR确认标准RNA的回收。如图20A所示(标准:RNA(O)、CD4(籲)、p21.(i)、FasL()和白细胞三亚乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))，在测试的104109个分子孔的范围内观察到标准RNA不依赖于剂量的回收。由于与50uL血屮存在的总iiiRM量相比，标准RNA的这个范围是充分小的，因此四种其它自身mRNA的水平保持不变(图20A)。将相同的数据转化成冋收百分率时，这些数值全部大约23%相似(图20B)。在杂交的平衡条件K，解离常数(Kd)按照如卜'进行计算:Kd=[RNA]X[寡聚(dT)]./[RNA:寡聚(dT)]其中[RNA]和[寡聚(dT)]分别代表RNA和寡聚(d'T)自由状态的浓度，[RNA:寡聚(dT)]代表与寡聚(dT)杂交的RNA的浓度。这意味着Kd在该系统中维持作为-'个稳定的数值，并且[RNA:寡聚(dT)]取决于应用的RM的量而变化。事实匕在用Yoyo-l.核酸染料检测杂交的总RNA时，[RNA:寡聚(dT)]是与应用的RNA的量成比例提高的。这些数据也表示，由标准RNA的一个浓度得出的M收百分率可以应用到相同样品内mRNA的任何浓度。对于第二个假设，使用或者不使用寡聚(dT)作为竞争性抑制剂来进行杂交。如图20C中所不，所有5个目标醒的Ct值被每孔3Xl()12以上分了的寡聚(d':[')显著抑制，尽管这*RNA的表达水平都不同。有趣的是，当相同的数据转化成抑制百分率时，所有的5个RNA表现出几乎相同的抑制曲线,其具有大约3Xl()13个分子/孔的IC5。(图2()D)。这说明该系统是多聚(A)特异性和不依赖序列的。如图20C所示，即使在应用1015个分子寡聚(dA)(标准醒与CD4)后，仍保留某些非特异性活性。然而，如图201)所示，当Ct数值(对数级)转化成分子数目(线性级)时，这些非特异性活性是可以被忽略的。因此，非多聚(A)序列似乎在这个系统屮没有发挥歪要的功能。因为图20AD是对mRNA定量整个过程的总和，因此这些数据表示任何目标基因的总检验效率与掺标的标准RNA的效率是相同的。这对f多聚(A)+:RNA来说是特殊的，因为在传统总:RNA纯化方法中的K和短RNA之间存在实质性的标准偏差(数据未显示)。下一歩是将每孔中RNA的量转化成每UI,血RNA的说。如图2()K所示，叫个原来mRNA的Ct值儿乎线性降低，其依赖丁'应用血的体积。即使O,OOluL(l:105稀释，毎孔100uL)血巾也可以检测到大量mRM例如CIM(图20E)。由于裂解缓冲液巾标准RNA的量是相同的，因此即使血体积变化很人时，标准RNA的回收也不变，如图20E。在每孔人于100iiL血时，Ct值达到了稳定状态(图20E)，这表明来自过滤板的O细胞增加的泄漏。一曰.将相同的数据转化成每PL血的量，该数值将在每孔350iiL血之间保持稳定(图20F)，这对于所有四个原有mRNA是真实的(图20F)。记^14:依赖于两个绝对数值应用的标准RNA的数量，以及TaqManPCR中标准DNA模板的数量。为了确保标准RNA产品的纯度，在这个项目中使用RNA寡聚核——ff酸。尽管合成具有1.00个碱基的:RNA寡聚核苷酸是难以达到的，但是这种长度是希望的，冈为:RNA寡聚核苷酸优选含有两个引物位点、TaqMan探针位点和多聚(A)尾端。在本研究中的合成RNA是通过I)hariiiacon合成的，通过HPLC分析，具有86%的纯度。HPLC纯化的I)NA寡聚核苷酸也被用作T叫ManPCR的模板，因为扩增曲线的斜率(表示PCR效率)在寡聚核苷酸和cDNA之间是相同的。产生了具有每孔1()6l()个分了寡聚核苷酸的标准曲线。在对PM浓度的贮液进行i061012倍稀释时，出现了-一个问题。当使用TE或者水来作为稀释剂时，标准曲线变化很大，特别是在少于l()3个分子/孔的时候。在切换到含().1%20之间的无核酸酶水时，这个问题被完全消除。确定正常数值为了确定健康对象每UL血中mRNA的对照值，对来自52个个体(54个数据点，其中1个个体重复了3次)的CM、p21、FasL和LTC4S的水平通过15个不同的实验检测2个月以上。每个数据点来自于3个50uL全血的等分。如图21A所示,标准R里的冋收为3.56±0.49%(CV=13.7%)。尽管这个C'V比fl》允的免疫分析大得多，但因为其使用:PCR，还是可以接受的，其中一个循环差别代表产物g屮的两倍。使用标准RM回收值，成功地将每个mRNA的数值转化成每UL血的分子数，而不是依赖于i0———12摩尔或者i0———15摩尔。如图21BE所示(标准RNA(0)、CM(籲)、p21(i)、FasL(命)和白细胞三亚乙基四胺C4合成酶mRNA(L':['C4S)(■))，CI)4、p21、FasL和LTC4SmRNA的对照水平分别是每UL全血.100，772±59，184(CV=58,7%)、1，692士858(CV=50,7%)、17，841±12，190(CV=68,3%)以及42，058±22，521(CV=53,5%)个分子。50%的CV意味着残余在TaqManPCR—个Ct内的正常数值。心意思的是，当平均值士ls.d.数值在每个图中被遮蔽时，某些个体表达高数值(图21B:E)。将表达高FasLm醒水平的个体重复3次(图21D)。mRNA正常数值的确定结合低CV数值以及通过本发明优选实施方式，可获得标准的确定可以用于检测本领域技术人员已知各种疾病检测的检验中。体外响应为'/评定作为模式系统白细胞对12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(P脆)和钙离子载体A23187(Cal)(Sigma)的响应，p21和FasLmRNA的水平进行定量(图22，其中，对照剌激中的p21(△)、PMA+CAI剌激中的p21(i)、对照刺激中的FasL()和PMA+CAI刺激屮的FasL())。在另一优选实施方式屮，分析对各种生物活性试剂刺激响应的各类型mRNA，其包括但不限于，例如放射线、紫外线、氧化压力、臭氧、温度、机械压力、化学试剂、肽、激素、蛋白质、抗原、抗体、药物、小分了化合物、有古材料、环境剌激、细胞-细胞间通讯、传染性试剂以及过敏原。由于该系统使用肝素化的全血，而不是人造溶液中分离的A细胞的悬浮液，因此该结果反映了生理学--匕精确的条件。如图22A所示，p21和FasLmRNA水平在PM和Cal的刺激后都快速上升，在90120分钟后达到丫大约升高10倍的稳定状态。p21的升高比FasL要快得多(图22A)。通过在37tT下孵育，而没有任何刺激，也会提高p21的水平，而FasL保持不变(图22A)。有趣的是，即使在将肝素化全血贮存在4°CT21个小时，也可以观察到响应(图22B)，这提供了功能型分子分析的宽适应性。在分析mRM表达的上调或者'卜'调中，提高倍数是通常使用的参数。然而，如图22CD所示，在PMA-Cal剌激后所诱导的p2i和FasLmRNA的量线性增长依赖于mRNA基础水平的量。因此，即使当样品比ii:常人群多2个标准偏差时(图22C)，提卨倍数检测也不能够确定位T回归线的非正常样品(图22G)。提高倍数检测鉴定'/位T回归线外(图22D)的非正常样品(图22H)。图22CD的两个二维图表清楚地区别了两种情况巾正常和非正常的样品。在图22CII中，每个数据点是三次检测的平均值。为了简化图表，没有显示标准偏差。然而，由于在X轴和Y轴平均值士2s.d.的遮蔽面积(图22CD)含有左上角和右下角的开放空间，因此这些角落中的非正常样品是难以确定的。通过将X轴旋转移到回归线(图22EF)，将遮蔽面积最小化。这些图表(图22EF)提供了检测正常人群外非正常样品的更好方法。序列表<110>I--l立化成工业株式会社日立化成研究巾心公司〈120>--------种基于多聚ARNA在溶液中合成cDNA的方法〈130〉0:I:JP0910586〈140>10/796，298〈14D2()(M-03-09〈丄50〉丄0/698'967〈151>2()()3-10-3()<160>17〈170〉FastSEQforWindowsVersion4,0〈210>1〈211)21〈212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列<400>1gggtgctgtgcttctgtgaac21〈210>2〈211)63〈212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223>合成的寡聚核苷酸序列<400>2g'ccccctcactcccaaattccaaggcccagccctcacacattg'ttcacag'aagcacagca60ccc63〈210>3<211M3〈2丄2〉腿〈213>人工序列<220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>3gtaatacgactcactatagggggacagccccctcactcccaaa43〈210>4<211>67〈2丄2〉腿〈213>人工序列<220>〈223>合成的寡聚核苷酸序列〈400>4gaagcgtgtgtcactgtgtgtttccaaggcccagccctcacacattgttcacagaagcac60agcaccc67<21()>5〈2丄丄〉47〈212>睡<213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈4.00>5gt肌tacgactcacta;tegggggacgg朋gcgtgtgtcactgtgtgt47<21()>6〈2丄丄〉46〈212M)NA<213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈4.00>6gt肌tacggictcacta;tegggggacgcattccgctgaccatc肌ta46<21()>7〈2丄丄〉丄8〈212>睡<213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸序列〈400>7tccaacgagcggcttcac〈2丄0〉8〈211>19<212>DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>8aaatgccacacggctctca〈2丄0〉9〈211>21<212>DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>9caagtgtcttcgtgtcg'tggg〈2丄0〉丄0〈211>18<212>DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>10agccccctcactcccaaa〈2丄0〉丄丄〈211>18<212>DNA〈213>人工序列〈220>〈223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>11agccccctcactcccaaa〈2丄0〉丄2〈211>33<212>DNA〈213>人工序列〈220><223>合成的寡聚核苷酸探针序列〈'1()()M2CfcigLggcUigLggLgggtticLcfcifciLgLgUicU〈21()>13<211>21〈212>:隱〈213>人工序列<22()><223>合成的寡聚核苷酸探针序列〈'1()()M3ccfcifciggcccagcccLctictica〈21()>14<211>89〈212>:隱〈213>人工序列<22()><223>合成的寡聚核苷酸序列100M4CfcigggfcicfcifcifciLgccfcicticggcLcLcfciccfcigLggcLtigLggLgggLticLctialgLgLticUttgggttCfiCfigfifigCfiCflgCfiCCCfiggg<210>15〈211)24〈212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈4Q0〉丄5CCflCtggfitt.tfifigCfiga.gttCfifi<210>16〈211)18〈212>DNA<213〉人工序列<220><223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈4Q0〉丄6tccaacgagcggcttcac18<210>17〈211)26〈212>DNA〈213〉人工序列<22()>〈223>合成的寡聚核苷酸探针序列<4()()〉17cagcggccagtagcatctgactttga2权利要求1.一种基于多聚ARNA在溶液中合成d)NA的方法，包括在RNA多聚A尾端和固定的寡聚(dT)杂交过程中应用特异性反义引物。全文摘要文档编号C12N1/06GK101696442SQ20091014938公开日2010年4月21日申请日期2004年10月29日优先权日2003年10月30日发明者三桥将人申请人:日立化成工业株式会社;日立化成研究中心公司;