专利名称：用于诊断桑细菌性枯萎病的引物及诊断方法
技术领域：
本发明属于农作物防病治病及植物检疫领域，尤其涉及一种PCR法诊断桑细菌性 枯萎病的引物及诊断方法。
背景技术：
自2006年开始在桑树主栽区浙江杭嘉湖地区发现一种严重的桑树病，桑农在夏 伐整枝后出现大面积桑树树枯死现象，被称为"桑树瘟"。经过对桑园的发病情况与病株症 状的细致观察及深入研究，发现该病为一种全新的桑树细菌病害，中文命名为"桑细菌性枯 萎病"，病原菌为"Enterobacter morus"(朱勃，王国芬，谢关林，周勤，徐福寿，李斌，陈建 锋 2009. Enterobacter s卯.:引起"桑枯萎"病的新证据.中国科学C辑211-219.)。
近年来由于该病不断蔓延而且发病程度日趋严重，已对蚕农造成了重大的经济损 失，然而目前已报道的桑树细菌病害已达8种，特别是桑细菌性枯萎病的田间症状难以与 "桑(细菌性)青枯病"和桑树因失水引起的生理性"凋萎"相区别，桑农和一般技术人员很 难用常规的方法直接区分，进而导致防治措施没有针对性，不但浪费人力物力，更延误了防 治该病的最佳时机以致造成重大损失。对田间桑细菌性枯萎病的早期诊断与病原检测刻不 容缓。 传统病害诊断采用肉眼症状识别、病原菌分离、革兰氏染色、生理生化反应特性测 定、Biolog等鉴定方法，周期长达一周，过程繁琐，且检测结果不一定可靠。PCR技术作为一 种现在流行的病害分子诊断和病原检测手段，可有效地对这一未知病原的检测和病害诊断 提供良好的帮助。
发明内容
本发明提供了一种用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，该引物特异性高，解决了传 统检测方法检测周期长的问题。 用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，其上游引物的碱基序列如SEQ IDN0 :1所示，下 游引物的碱基序列如SEQ ID N0 :2所示。 本发明还提供了一种利用上述引物诊断桑细菌性枯萎病的方法，包括以下步骤
将经表面消毒的桑树根去皮、切碎，置于无菌水中，离心振荡制得水悬液，以水悬 液为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，如凝 胶上存在DNA条带，则桑树感染了细菌性枯萎病，如无DNA条带，则桑树未感染细菌性枯萎 病。
所述的PCR扩增反应条件优选如下 95。C预变性5min ;95。C变性30s，65。C退火30s，72。C延伸30s，共进行40个循环; 72t:延伸5min。 —种包含上述引物的试剂盒，该试剂盒PCR体系采用20 iU体系时，具体组成如 下
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2xTaq PCR Mix 10 ii 1 上游引物 0.25 ill 下游引物 0.25 ill ddH20 8.5 iil。 本发明引物特异性高，利用该引物检测桑细菌性枯萎病，检测周期短，比用常规方 法节省时间90%以上，灵敏度和准确率较高。
图1为各菌株利用本发明引物PCR扩增所得产物的凝胶电泳图； 图2a为附着在桑树根各菌株利用发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图； 图2b附着在桑树茎各菌株利用发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图； 图2c为附着在桑树叶的各菌株利用发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图； 图3为采集的22个桑树根样本水悬液利用本发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图。 图4为桑细菌性枯萎病病原与8株国际标准菌株rpoB序列的比较图。
具体实施方式
引物合成 通过比对桑细菌性枯萎病病原(Enterobacter morus)Ll、 L2、 L3、 L4禾P 7株 国际标准菌株(国际标准编号分另ll为Enterobacter cloacae subsp. dissolvens LMG2683T， E. canceroge墜LMG2693T， E. pyri墜LMG22970T， E. turicensis LMG23730T， E.helveticus LMG23732T， E. nimipressuralisLMG102451及E. agglomerans LMG25571) 的rpoB序列，如图4所示，发现两个桑细菌性枯萎病病原的特异性区域(灰色)，根据该 两个特异性区域，利用联配软件(ClustalW)及引物合成软件(Primer5)，得到一对引物， 该引物的上游引物(EMrpobF)为5' -GCCAAGCCGATTTCTGGAGCA下游引物(EMrpobR)为 5' -GCATACAGGTTAGCTTTGC，通过该对引物能特异性扩增大小约为300bp的DNA片段。上述 引物可以通过常规方法合成，本实施例引物由上海生工生物工程有限公司合成。
提取DNA 取1. 5ml的细菌培养物10000r/min离心2min ;沉淀物加入467iU的TE缓冲 液(pH 8. 0)，用吸管反复吹打使之重悬。加入30 ill 10% (重量/体积)的SDS和3 ill 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37"水浴lh ;加入等体积的酚氯仿，轻轻混匀，12000r/min离 心10min，取上清液，加入占上清液体积1/10的NaAc (pH5. 2)，混匀；加入占上述混合溶液 体积0. 6的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，冰浴20min， 12000r/min离心5min ;弃上 清，加入lml 70% (体积)的冰乙醇洗涤30s，12000r/min离心2min ;弃上清，干燥，重溶于 100 ill的TE缓冲液(pH 8. 0) ， -20。C保存。 上述细菌培养物是指分别含有如下菌株的培养物桑细菌性枯萎病病原Ll、 L2、 L3禾口 L4 ;桑青枯病病原(Pseudomonas solanacearum)、桑疫病病原(Pseudomonas syringae pv. mori)及8株与桑细菌性枯萎病病原近缘的国际标准菌株(国际标准 编号分别为Enterobacter cloacae subsp. dissolvens LMG2683T， E. canceroge皿sLMG26931， E. pyri墜LMG229701， E. amnige應LMG27841， E. turicensis LMG237301， E. helveticusLMG237321， E. nimipressuralis LMG102451及E. agglomerans LMG25571)。
为了进一步说明本发明引物的特异性，还分离纯化了了附着在桑树根、茎、叶的菌 株的DNA，具体操作如下 选取健康桑树根、茎、叶样本，浸入无菌水中，用接种针在NA平板上划线，选取形 状不同的单菌落，置于NB培养液培养至指数期，按上述方法提取分离得到的菌株的DNA。
特异性检测 以上述提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:l和SEQ ID NO :2所示的引物进行PCR 扩增，反应条件如下95。C预变性5min ;95。C变性30s，65。C退火30s，72。C延伸30s，共进行40个循环；
72t:延伸5min。 PCR体系如下 1 ill DNA模板(约lng)，上、下游引物各20pmol， 2xTaq PCR-Mix 10 iU (上海申 能博彩公司生产)，ddH20补足到总体积20 iU。 PCR产物用1. 5%的琼脂糖在1 XTBE缓冲液中电泳后，用Goldview显色拍照，如 图1所示，1 4道为桑细菌性枯萎病病原；5 12为桑细菌性枯萎病病原近缘的8个国际 标准菌株；13 14分别为桑青枯病病原和桑疫病病原。可以发现四株桑细菌性枯萎病病 原呈阳性反应，其它菌株均呈阴性反应。如图2所示，从桑树根、茎、叶分离的所有菌株均呈 阴性反应，由此可见，本发明引物特异性高。
检测病原菌 选取表现出"凋萎"症状的桑树，截取桑树根作为试验材料，总共21个样本，具体 检测操作如下 先去掉桑根外层的土壤，然后用70X酒精泡洗3min，剥去外皮，用无菌水冲洗3 次，每次lmin。 接着将每个样本作两种处理，其中一种处理为将桑树根用灭菌剪刀剪成小段，装 入事先放有lml无菌水的离心管中，装入离心机充分漩涡震荡，制得水悬液。
以该水悬液为模板，利用SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2所示的引物进行PCR扩增， 反应条件与特异性检测中的扩增反应条件相同，PCR反应体系如下 2iU水悬液，上、下游引物各20pmol，2xTaq PCR-Mix 10 iU (上海申能博彩)， (1朋20补足到总体积20111。 扩增产物用1. 5%的琼脂糖在1XTBE缓冲液中电泳后，用Goldview显色拍照，观 察凝胶电泳上DNA条带分布情况。如图3所示，2、10 15、21号样本均扩增出大约300bp 的DNA片段。 另一种处理为先去掉桑根外层的土壤，然后用70X酒精泡洗3min，剥去外皮，用 无菌水冲洗3次，每次lmin。然后用接种针在TTC平板上划线，置于3(TC下培养，观察菌落 生成情况，挑选不同形状的单菌落进行鉴定(朱勃等.2009.Enterobacter spp.:引起"桑 枯萎"病的新证据.中国科学C辑211-219.)，鉴定结果与PCR检测方法得到的结果一致， 说明利用本发明引物可以诊断桑细菌性枯萎病病原。 为了进一步提高检测速率，可以利用本发明引物制成试剂盒，该试剂盒和传统的PCR分子诊断试剂盒结构一样，由盒体和盒体内的PCR体系组成，如选用20iU体系时，其组 成为2xTaq PCR-Mix 10 ii 1、上、下游引物各0. 5 iU以及ddH20 8 iU。进行PCR扩增时，直 接加入模板DNA即可，简单方便。SEQUENCE LISTING〈110〉浙江大学〈120>用于诊断桑细菌性枯萎病的弓1物及诊断方法<130>〈160〉2〈170〉Patentln version 3. 3<210>1〈211>21<212>DNA〈213〉桑细菌性枯萎病病原(Enterobacter morus)〈400〉1gccaagccga tttctggagc a〈210>2〈211>17〈212〉DNA〈213〉桑细菌性枯妻病病原(Enterobacter morus)〈400>2Cggt朋C33C accgtcg
权利要求
用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，其特征在于上游引物的碱基序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO2所示。
2. —种利用权利要求1所述的引物诊断桑细菌性枯萎病的方法，包括以下步骤将经表面消毒的桑树根去皮、切碎，置于无菌水中，离心振荡制得水悬液，以水悬液为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，如凝胶上存在DNA条带，则桑树感染了细菌性枯萎病，如无DNA条带，则桑树未感染细菌性枯萎病。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应条件如下95。C预变性5min ;95。C变性30s，65。C退火30s，72。C延伸30s，共进行40个循环；72。C延伸5min。
4. 一种包含权利要求1所述的引物的试剂盒。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒内的PCR体系组成如下2xTaq PCR Mix 10 ii 1上游引物 0.25 ill下游引物 0.25 illddH O 8. 50 ii 1 。
全文摘要
本发明公开了一种用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO2所示。本发明还公开了一种利用该引物诊断细菌性枯萎病的方法，包括以下步骤将经表面消毒的桑树根去皮、切碎，置于无菌水中，离心振荡制得水悬液，以水悬液为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，如凝胶上存在DNA条带，则桑树感染了细菌性枯萎病，如无DNA条带，则桑树未感染细菌性枯萎病。发明引物特异性高，利用该引物检测桑细菌性枯萎病，检测周期短，比用常规方法节省时间90％以上，灵敏度和准确率较高。
文档编号C12N15/11GK101724692SQ20091015700
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者余山红, 周勤, 朱勃, 李斌, 楼妙苗, 王国芬, 谢关林 申请人:浙江大学