专利名称：一种以造纸短纤维为碳源发酵生产液体纤维素酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种纤维素酶的生产方法，具体地说，涉及一种以造纸短纤维为碳源
发酵生产液体纤维素酶的方法。
背景技术：
纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生性天然
资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相当于6400亿吨的石油所含的能量，而
且纤维素的可再生性是石油等矿质能源所不可比拟的。充分利用纤维素酶处理纤维素，有
可能从根本上解决人类所面临的能源与粮食问题，其深远影响是不可低估的。 纤维素酶在纺织、食品发酵、饲料、造纸、日用化工、中草药提取等诸多领域具有广
泛的应用，特别是在秸秆生产酒精方面，具有巨大的潜在价值，其前景十分广阔，纤维素酶
的研究已成为一个战略性课题。 纤维素酶在我国每年有几十亿元的市场销售额，在纺织、酒精、饲料等工业具有广 泛的应用，但目前国内90%以上的市场份额被国外产品所占领，因此开展纤维素酶发酵技 术的研究，提高液体发酵酶活力、降低生产成本具有很重要的现实意义。已成功开发出纤维 素酶高产菌和高活力的发酵方法，具有很好的应用开发价值。 液体纤维素酶的生产主要用微晶纤维素、乳糖、槐糖、纤维二糖等作为诱导物，这 些原料用量较大而且价格较贵，在液体纤维素酶的生产成本中占有很大一部分比例，导致 纤维素酶液体发酵成本居高不下，很难与纤维素酶固体发酵竞争。 在以亚硫酸盐和碱法造纸的过程中，螺旋挤桨机工作中可以产生约占总纸桨含量 1 5%短纤维，未有很好的出路，给环境造成污染。以造纸生产中短纤维为培养基生产纤 维素酶，成本低，原料来源丰富。因此本发明采用短纤维作为诱导物来发酵生产液体纤维素 酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种以造纸短纤维为碳源发酵生产液体纤维素酶的方法，该 方法生产的纤维素酶成本低、质量稳定、活力高、组分合理、生产周期短。 为了实现本发明目的，本发明的一种发酵生产液体纤维素酶的方法，其采用以绿
色木霉菌株作为生产菌株，并以造纸短纤维为发酵培养基的碳源进行发酵培养。 所述造纸短纤维为麦草、稻、甘蔗渣等农作物秸秆经过亚硫酸盐或碱法造纸过程
获得的造纸短纤维，其主要成分为纤维素50 70% 、半纤维素20 30% 、木质素8 15% 。 所述造纸短纤维在发酵培养基中的用量为2 10%。 所述发酵培养基的组分的重量百分比为2 10%造纸短纤维、2 4%玉米浆、 1 3%尿素、2 5%硫酸铵、2 5%磷酸氢二钾；其余为水。
所述发酵培养方式为液体分批发酵生产液体纤维素酶。
其中，发酵温度为26 3(TC，培养时间为6 IO天。
本发明的生产液体纤维素酶的方法，在发酵培养前，需先经斜面培养、振荡培养。
所述斜面培养采用在无菌操作条件下，将原种接入PDA试管斜面培养基中，27 30。C培养4 8天； 所述振荡培养采用在无菌条件下，将斜面菌种接入三角瓶的种子培养基中，置摇 瓶机上振荡培养12 48小时，培养温度20 30°C 。 所述种子培养基的组分的重量百分比为3 5%葡萄糖、2 4%玉米浆、1 3%
尿素、2 4%硫酸铵、2 4%磷酸氢二钾，0. 5 1%硫酸镁；其余为水。 本发明采用绿色木霉诱变菌株为生产菌种，在试管、三角瓶、种子罐中培养后接入
含有亚硫酸盐和碱法造纸中产生的短纤维为碳源和营养盐的液体发酵培养基中。在发酵罐
中进行培养，生产出液体纤维素酶，该酶可以经过压滤、浓縮得到液体纤维素酶成品。该方
法生产的纤维素酶成本低、质量稳定、活力高、组分合理、生产周期短。 本发明所述的亚硫酸盐和碱法造纸的过程中产生的短纤维，已对麦草、稻、甘蔗渣 等农作物秸秆进行了酸解或碱处理，因此产生的废料短纤维已是经过轻度酸解或碱处理的 纤维原料，属于易被利用的纤维素组分。当把短纤维应用于纤维素酶液体生产中，一方面可 以促进绿色木霉菌丝体的生长发育，同时又具有诱导性，促进了纤维素酶的生产，因此，以 造纸短纤维为碳源发酵生产液体纤维素酶与使用微晶纤维素相比，滤纸酶活基本相同或略 高，微晶纤维素的价格为1. 1 1. 8万元/吨，而造纸短纤维的生产成本为2000 3000元 /吨，成本降低80%，成功解决了纤维素酶液体发酵过程中需要添加昂贵碳源，导致成本居 高不下的问题。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下面实施例中所使用 的方法如无特殊说明均为常规实验方法。
滤纸酶活的测定采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定。 试验条件为底物使用Whatman滤纸50mg，加入适当稀释倍数的酶液，在50°C 、80r/min下 反应lh，测定酶解产生的葡萄糖量。 一个滤纸酶活的国际单位(IU)定义为标准反应条件下 每分钟生成1 P mol葡萄糖量的酶量。
对比例1 斜面培养在无菌操作条件下，将绿色木霉菌株(菌株编号CICC13052)接入PDA 试管斜面培养基中，3(TC培养8天； 振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种接入三角瓶的种子培养基中，置摇瓶机上振 荡培养36小时，培养温度28t:;种子培养基中各成分的质量百分比为5%葡萄糖、3%玉米 浆、2%尿素、4%硫酸铵、2%磷酸氢二钾，0. 6%硫酸镁；其余为水； 然后再在装液量为50mL的250mL三角瓶中利用商品纯纤维素为碳源生产纤维素 酶，发酵温度0 72小时为30°C ， 72 120小时为26 28°C ，转速为250转/分钟。其中 发酵培养基中各成分的质量百分比为8%商品纯纤维素、3%玉米浆、2%尿素、4%硫酸铵、 2%磷酸氢二钾；其余组分为水。 结果表明，使用纯纤维素滤纸酶活力最高为9. 42IU/mL。
对比例2
斜面培养在无菌操作条件下，将绿色木霉菌株(菌株编号CICC13052)接入PDA 试管斜面培养基中，3(TC培养8天； 振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种接入三角瓶的种子培养基中，置摇瓶机上振 荡培养36小时，培养温度28t:;种子培养基中各成分的重量百分比为5%葡萄糖、3%玉米 浆、2%尿素、4%硫酸铵、2%磷酸氢二钾，0. 6%硫酸镁；其余为水； 然后再在装液量为50mL的250mL三角瓶中分别利用微晶纤维素发酵生产纤维素 酶，发酵温度为0 72小时为30°C ， 72 120小时为26 28°C ，转速为250转/分钟。其 中发酵培养基中各成分的质量百分比为8%微晶纤维素、3%玉米浆、2%尿素、4%硫酸铵、 2%磷酸氢二钾；其余组分为水。 结果表明，使用微晶纤维素滤纸酶活力最高为15. 24IU/mL。
实施例1 斜面培养在无菌操作条件下，将绿色木霉菌株(菌株编号CICC13052)接入PDA 试管斜面培养基中，3(TC培养8天； 振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种接入三角瓶的种子培养基中，置摇瓶机上振 荡培养36小时，培养温度28t:;种子培养基中各成分的重量百分比为5%葡萄糖、3%玉米 浆、2%尿素、4%硫酸铵、2%磷酸氢二钾，0. 6%硫酸镁；其余为水； 然后在装液量为50mL的250mL三角瓶中分别利用纸浆短纤维发酵生产纤维素酶， 发酵温度为0 72小时为30°C，72 120小时为26 28°C，转速为250转/分钟。其 中发酵培养基中各成分的重量百分比为8%造纸短纤维、3%玉米浆、2%尿素、4%硫酸铵、 2%磷酸氢二钾；其余组分为水。其中，造纸短纤维为由麦草经过亚硫酸盐法造纸过程获得 的造纸短纤维，其主要成分为纤维素60 % 、半纤维素25 % 、木质素8 % 。
结果表明，使用纸浆短纤维滤纸酶活力最高为16. 20IU/mL。(三角瓶发酵成本低、 但相对于发酵罐来说，摇瓶产酶要低些)
实施例2 斜面培养在无菌操作条件下，将绿色木霉菌株(菌株编号CICC13052)接入PDA 试管斜面培养基中，2『C培养4天； 振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种接入三角瓶的种子培养基中，置摇瓶机上振 荡培养36小时，培养温度26°C ;种子培养基中各成分重量百分比为3%葡萄糖、4%玉米 浆、1%尿素、3%硫酸铵、4%磷酸氢二钾，0. 5%硫酸镁，其余为水； 然后在装液量为30L的50L不锈钢标准发酵罐中利用纸浆短纤维发酵生产纤维素 酶，发酵温度为0 72小时为30°C，72 120小时为26 28。C，搅拌转速为300转/分 钟，通风为0. 8vvm，罐压为0. 05Mpa。其中发酵培养基中含有10%造纸短纤维、2%玉米浆、 3%尿素、2%硫酸铵、5%磷酸氢二钾、泡敌0.01%、吐温-800.0005%;其余组分为水。发酵 每8小时取样测定。其中，造纸短纤维为由麦草经过亚硫酸盐法造纸过程获得的造纸短纤 维，其主要成分为纤维素65%、半纤维素25%、木质素10%。 结果表明，使用纸浆短纤维发酵生产纤维素酶，滤纸酶活力最高为28. 59IU/mL。
实施例3 斜面培养在无菌操作条件下，将绿色木霉菌株(菌株编号CICC13052)接入PDA 试管斜面培养基中，27C培养6天；
振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种接入三角瓶的种子培养基中，置摇瓶机上振 荡培养24小时，培养温度28°C ;种子培养基各成分的重量百分比4%葡萄糖、2%玉米浆、 3%尿素、2%硫酸铵、3%磷酸氢二钾，1%硫酸镁；其余为水； 种子罐扩培ln^种子罐，装液量为600L，接种量为1%，培养温度28°〇，通风为 0.8vvm，搅拌转速200转/分钟，培养周期24小时。培养基中各成分的重量百分比为4% 葡萄糖、2 %玉米浆、3 %尿素、2 %硫酸铵、3 %磷酸氢二钾，1 %硫酸镁，其余为水。
然后在装液量为30m3的50m3不锈钢标准发酵罐中利用纸桨短纤维发酵生产纤维 素酶，发酵温度为0 72小时为30°C ， 72 120小时为26 28°C ，搅拌转速为150转/分 钟，通风为O. 8vvm，罐压为0. 05Mpa。其中发酵培养基中各成分的重量百分比为2%造纸短 纤维、4%玉米桨、1 %尿素、5 %硫酸铵、4%磷酸氢二钾、泡敌0. 01 % 、吐温-800. 0005 % ;其 余组分为水。其中，造纸短纤维为稻草经过碱法造纸过程获得的造纸短纤维，其主要成分为 纤维素70 % 、半纤维素20 % 、木质素8 % 。 发酵80小时后流加新鲜培养基。流加的培养基中成分的重量百分比为8%造纸 短纤维、1%玉米桨、1%豆粕粉、0. 05%硫酸铵、0. 03%磷酸氢二钾、0. 002%泡敌、0. 0005% 吐温80 ;其余组分为水。(发酵培养基中造纸短纤维含量低，流加培养基主要是为了补充底 物造纸短纤维，其它成分适当补充发酵液中的营养)每次放出的发酵液都要立即测定纤维 素酶活力和残糖。 结果表明，使用纸浆短纤维发酵生产纤维素酶，滤纸酶活力最高为35. 89IU/mL。
以上实施例通过摇瓶、50L发酵罐的不补料分批发酵及补料分批发酵，可以看出纤 维素酶滤纸酶活有较大提高。 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
一种发酵生产液体纤维素酶的方法，其特征在于，其采用以绿色木霉菌株作为生产菌株，并以造纸短纤维为发酵培养基的碳源进行发酵培养。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述造纸短纤维为麦草、稻、甘蔗渣经过亚硫酸盐或碱法造纸过程获得的造纸短纤维。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述造纸短纤维在发酵培养基中以重量百分比计的用量为2 10%。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有2 10%造纸短纤维、2 4%玉米浆、1 3%尿素、2 5%硫酸铵、2 5%磷酸氢二钾；其余组分为水。
5. 根据权利要求l-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养采用分批发酵，发酵温度为26 3(TC，培养时间为6 10天。
6. 根据权利要求l-5任意一项所述的方法，其特征在于，该方法先将绿色木霉菌株接入种子培养基中，在20 3(TC下条件培养12 48小时。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为3 5%葡萄糖、2 4%玉米浆、1 3%尿素、2 4%硫酸铵、2 4%磷酸氢二钾，0. 5 1%硫酸镁；其余组分为水。
全文摘要
本发明提供了一种以造纸短纤维为碳源发酵生产液体纤维素酶的方法，其采用绿色木霉菌株为生产菌种，并以造纸短纤维为发酵培养基的碳源进行发酵培养，生产液体纤维素酶。该纤维素酶可以经过压滤、浓缩得到液体纤维素酶成品。该方法生产的纤维素酶成本低、质量稳定、活力高、组分合理、生产周期短。
文档编号C12N9/42GK101705216SQ20091021015
公开日2010年5月12日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者尚海涛, 李维理, 李荣杰, 穆晓玲, 薛培俭 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司