专利名称：一株羰基还原酶重组菌高效制备(s)-苯基乙二醇的方法
技术领域：
从近平滑假丝酵母基因组中钓取新型羰基还原酶基因scr II，通过基因工程手段
构建重组菌株，用于高效制备(s)-苯基乙二醇的方法及其应用，属于生物催化不对称转化
技术领域。
背景技术：
光学纯的苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，也是制备具 有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展苯基乙二醇拆分方法的研究极具 意义。 手性化合物的制备方法包括化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法或手性固体 膜拆分的膜拆分法和生物法。其中生物法具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域 选择性和化学选择性较高，能完成化学合成法难以进行的反应。
在生物制备(S)-苯基乙二醇的反应中，仅少数真菌或酶能催化底物2-羰基苯 乙酮，产生不同空间构型的苯基乙二醇。Bakers' yeast和Geotrichum sp.能将低浓度 的2-羰基苯乙酮分别还原为(R)-和(S)-苯基乙二醇。来源于近平滑假丝酵母(Candida par即silosis)CCTCC NO :M203011的(R)-和(S)-羰基还原酶能催化2-羟基苯乙酮产生 苯基乙二醇的不同对映体。但多数已报道的不对称还原反应中，酶催化的底物浓度和终产 物的光学纯度都较低。通过构建基因工程菌来增加目标蛋白的表达量以促进转化反应，但 是效果不显著。吕腾飞等采用过量表达(S)-羰基还原酶SCR的重组菌制备(S)-苯基乙二 醇，底物2-羰基苯乙酮的浓度只有3g/L，产物的光学纯度也仅为91%。
近平滑假丝酵母(Candida par即silosis)CCTCC NO :M203011可催化制备(S)-苯 基乙二醇，在此基础上，利用全基因组分析方法从中钓取一种新型(s)-羰基还原酶基 因scrr II，构建了目标基因的重组菌，实现了高底物浓度下高效低成本不对称转化制备
(s)-苯基乙二醇。 本发明的目的在于根据近平滑假丝酵母基因组序列分析方法，克隆出一种新型 (S)-羰基还原酶基因scrr II，利用构建的重组菌CCTCC NO :M 209289催化2-羟基苯乙
酮，高效制备具有光学活性的(s)-苯基乙二醇的方法，产物(s)-苯基乙二醇的光学纯度和
产率分别为100% e. e.和98. 1%。 本发明的技术方案一株制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆 菌(Escherichia coli)BL21/pETSCR II，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO :M 209290。 苯基乙二醇的化学结构为<
发明内容
所述重组菌株CCTCC NO :M 209290的构建方法，将羰基还原酶基因scrll插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II，重组质粒pETSCR II转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100 g/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E. coli BL21/pETSCR II，即CCTCC NO :M 209290 ;步骤为
①(S)-羰基还原酶基因scr II的获取 用于钓取scr II基因的菌种为近平滑假丝酵母(C. par即silosis)CCTCC NO :M203011 ; 羰基还原酶基因scr II的克隆以近平滑假丝酵母(Candida par即silosis)CCTCC NO :M2030H基因组为模板，以含有BamHI酶切位点的 SCR II_F :5' -ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3'，和含有Xhol酶切位点的 SCR II_R :5' -TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3'为引物，PCR扩增反应获得scr II基因，基因全长840bp ;基因scr II的GenBank编号为:GQ411433 ;
PCR体系为ddH20 35. 5 ii L， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L Mg2+3 ii L，2. 5,1/L dNTP 4 ii L， Taq DNA Polymerase 0. 5 ii L， 25pmo1/ ii L的引物SCRII—F和SCRILR各1 ii L ; PCR反应条件94 °C 4min ;94 °C lmin、56 °C lmin、72 °C lmin，30个循环；72°C lOmin ; ②重组质粒pETSCR II的构建 利用限制性内切酶BamHI和Xhol对目的基因scr II和表达载体pET28a分别进行双酶切，处理后的DNA片断通过粘性末端连接，获得带有羰基还原酶基因scr II的重组质粒pETSCRII ; ③重组质粒转化大肠杆菌取重组质粒pETSCR II 2iiL，转化大肠杆菌E. coliBL21(DE3)感受态细胞，转化液涂布到含有100i！ g/mL卡那霉素的LB平板上，37t:倒置培养过夜，获得阳性克隆E. coli BL21/pETSCR II。 利用重组菌CCTCC NO :M209290不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法
(1)重组菌株CCTCC NO :M 209290的培养 LB液体培养基，以g/100mL计胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%， NaCl 1%，pH7. 0 ;需要时使用前加入卡那霉素100 g/mL，固体培养基再添加1. 5%琼脂粉；
培养条件挑取重组菌CCTCC NO :M 209290的单菌落接种于3mL含100 y g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37t:，200rpm振荡培养过夜；取lmL培养液转接于50mL含100 ii g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C，200rpm振荡培养至0D6。。0. 6，在培养物中加入诱导物异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)O. lmmol/L，于3(TC诱导培养6h;10， OOOrpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞；
(2)以重组菌全细胞为催化剂，以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应在lmL 0. lmol/L pH4. 5 6. 0的醋酸缓冲液，或者lmL 0. lmol/L p朋.5 7. 5的磷酸缓冲液，或者lmL 0. lmol/L pH8. 0 9. 0的Tris-HCl缓冲中进行反应，底物2-羰基苯乙酮浓度为5g/L，反应温度为25 35°C ; 采用重组菌全细胞生物转化重组菌全细胞浓度为0. lg/mL，反应48h，反应前不需要加入辅酶，产物为(S)-苯基乙二醇； 或采用重组菌破碎后的上清液经纯化后的重组蛋白SCRII生物转化重组蛋白 SCRII浓度为1 2ii g/mL，反应8h，反应前加5mmol/L辅酶NADPH，产物为(S)-苯基乙二 醇； 反应结束后，将反应混合物离心除去固体物质，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃 取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HPllOO)进行分析，条 件为Chiralcel OB-H柱(4. 6mmX 25cm ;Daicel Chemical Ind. ， Ltd. ， Japan)，流动相为正 己烷/异丙醇(9/1，VN)，流速0. 5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过
量值来衡量。 产物(S)-苯基乙二醇对映过量值的计算 对映过量值(e. e. % ) = [ (CS_CK) / (CK+CS) ] X 100 % 产物(S)-苯基乙二醇产率的计算产率(％ ) = CS/C。X 100% 式中CK为反应后(R)-苯基乙二醇的浓度，Cs为反应后(S)-对映体的浓度，C。为
反应前底物(R)-苯基乙二醇的浓度。 以重组菌细胞为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(S)-苯基乙二醇。 所述重组蛋白SCRII的纯化MCAC-0缓冲液20mmol/L Tris/HCl， pH8. 0 ;MCAC-20 :在MCAC-0缓冲液中加入20mmol/L的咪唑，pH8. 0 ;MCAC-200 :在MCAC-0缓冲液中加入200mmol/L的咪唑，pH8. 0 ; 菌体收集将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎工作时间2s， 间歇时间6s，共20min ;破碎液16， OOOrpm离心40min ;弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯化 工作； 蛋白纯化先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍，用MCAC-20缓冲液洗脱杂蛋 白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hi trap柱蛋白脱盐，利用 Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液；接着用Pharmacia 公司的Resource Q阴离子交换柱，1 X lcm，进行蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的 Superdex 200， HiLoad 26/60，进行蛋白纯化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到95%以 上。 本发明的有益效果 成功从近平滑假丝酵母基因组中克隆出一种新型(S)-羰基还原酶基因scr II， 该基因全长840bp， Genbank序列号为GQ411433。 将scr 1I插入表达载体pET28a中，转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)，构建带有目 的基因的重组菌株E. coli BL21(DE3)/pETSCR II。 通过生物转化反应条件的优化，在pH5. 5的醋酸缓冲液中，利用0. lg/mL重组细胞 对5g/L的底物2-羟基苯乙酮催化转化48h，最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100% e. e.，产率为98. 1%。 在pH5. 5的醋酸缓冲液中，利用约2ii g的重组纯蛋白对6g/L底物2_羟基苯乙酮
催化转化8h，最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100% e. e，产率为98.9%。 这些工作不仅为制 高光学纯度的(S)-苯基乙二醇提供了一种优良的催化剂，同时也为工业上采用生物法合成(s)-苯基乙二醇提供了有效途径。生物材料样品保藏
大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETSCRII，保藏单位中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号:CCTCC NO :M 209290，保藏日期2009年11月29日。
具体实施例方式
实施例lscrll基因的获得 以scr基因(DQ675534)为出发序列，在近平滑假丝酵母基因组中(htWZ丽w.Sanger, ac. uk/cgi_bin/blast/submitblast/c par抑silosis)发现一段同源序歹ljscr II，利用引物SCR ILF和SCR n—R，以近平滑假丝酵母基因组为模板，采用PCR的方法来扩增scr II基因。 SCRII—F:5' -ATCGGATCCATGGGCGAAATCGAATCTTATTGC-3' (BamH I) SCR II_R:5' -TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATC GAC-3' (Xho I)PCR体系为ddH20 35. 5 ii L， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L Mg2+3 ii L，
2. 5,1/L dNTP 4 ii L， Taq DNA Polymerase 0. 5 ii L， 25pmo1/ ii L的引物SCRII—F和SCR
ILR各1 ii L ;PCR反应条件94 °C 4min ;94 °C lmin、56 °C lmin、72 °C lmin，30个循环；72°C 10min。 PCR反应获得scr II基因，GenBank编号为GQ411433。
实施例2重组质粒pETSCRII的获得 利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因scr II和载体pET28a分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有scr II基因的重组质粒pETSCR II。利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid R即id Isolation Kit (购买于北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETSCR II。 实施例3重组菌株E. coli BL21/pETSCRII的获得 重组质粒pETSCR II转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，通过含有100 ii g/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E. coli BL21/pETSCRII 。该重组大肠杆菌送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC NO :M209290。 重组质粒转化大肠杆菌在每管的100 ii L E. coli BL21 (DE3)感受态细胞悬液中加入10iiL连接产物，轻轻混匀后冰浴30min。转入42。C水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700iiL LB液体培养基，37t: 100rpm摇床温育培养lh。培养后菌液3， OOOrpm离心2min，弃上清600 y L，剩余菌液混匀后涂布含100 y g/mL卡那霉素的LB平板上，37t:倒置培养过夜。 LB液体培养基胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl l%，pH 7.0。使用前加入卡那霉素(100 ii g/mL)，固体培养基添加1. 5%琼脂粉。 挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有100 y g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37。C培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。经下列酶切体系验证10XBuffer H2 ii L，质粒DNA 5 ii L， BamH I 0. 5 ii L， Xhol 0. 5 ii L， ddH20将体系补足20 ii L。酶切结果为阳性的菌体即为重组菌E. coli BL21/pETSCRII。
实施例4重组菌的培养
7
挑取实施例3中E. coli BL21/pETSCR II的单菌落接种于3mL含100 y g/mL卡 那霉素的LB液体培养基中，于37°C ， 200rpm振荡培养过夜，取lmL培养液转接于50mL含 100 ii g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37t:，200rpm振荡培养至0D6。。为0. 6后，加入 0. lmmol/L异丙基-B-D-硫代半乳糖苷，于3(TC诱导培养6h ;10，000rpm离心lOmin收集菌 体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集重组菌全细胞。
实施例5 取0. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L醋酸缓冲液(pH5. 0)中， 加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在3(TC恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合 物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为83. 1% e. e.，产率为68.4%。
实施例6 取0. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L醋酸缓冲液(pH5. 5)中， 加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在3(TC恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合 物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100% e. e.，产率为98. 1%。
实施例7 取0. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L醋酸缓冲液(pH6. 0)中， 加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在3(TC恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合 物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为95. 3% e. e.，产率为79. 7%。
实施例8 取O. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L磷酸缓冲液(pH6. 5)中， 加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在3(TC恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合 物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为88. 7% e. e.，产率为68. 2%。
实施例9取O. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L磷酸缓冲液(pH7. 0)中， 加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在3(TC恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合 物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为71. 5% e. e.，产率为57. 6% 。
实施例10 取0. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L的Tris-HCl缓冲液 (pH8.0)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在3(TC恒温摇床上振荡反应48h。反应 结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为51. 9% e. e.，产率 为39. 1%。
实施例11 取0. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L醋酸缓冲液(pH5. 5)中， 加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在25t:恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合 物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为84.5% e. e.，产率为68.6%。
实施例12 取0. lg/mL实施例4中的重组菌全细胞，在lmL 0. lmol/L醋酸缓冲液(pH5. 5)中， 加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在35t:恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合 物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为94. 3% e. e.，产率为73. 7%。
实施例13目标蛋白的表达
用实施例4中的菌液，进行SDS-PAGE检测，凝胶定量软件(Quantity One)分析蛋白表达；将收集的重组菌溶解于20mmol/L， pH8. 0的Tris-HCl缓冲液中，超声破碎20min，工作时间2s，间歇时间6s。将破碎后的菌体于16， OOOrpm离心40min，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE检测目标蛋白的表达。
实施例14目标蛋白的纯化 用实施例12中所获得的菌体上清在AKTA蛋白纯化系统中进行蛋白纯化。第一步将上清挂Ni柱(His-Tr即Kit, Pharmacia)两次，用MCAC-50的缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200的缓冲液洗脱含有目的蛋白的溶液；第二步用Hitr即(Pharmacia)柱蛋白脱盐，缓冲液A :20mmol/L Tris/HCl， 500,1/L NaCl，pH8.0。缓冲液B :20mmol/L Tris/HCl，pH8. 0。利用AKTA蛋白纯化系统(Pharmacia, Uppsala, Sweden)，将蛋白溶液由A缓冲液换为B缓冲液；第三步用Resource Q阴离子交换柱(IX lcm， Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液A:20mmol/L Tris/HCl，pH8. 0。缓冲液B :20mmol/L Tris/HCl， lmol/LNaCl，pH8. 0。利用AKTA蛋白纯化系统(Pharmacia, Uppsala, Sweden)，收集含有目的蛋白的溶液；第四步用Superdex 200(HiLoad 26/60， Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液20mmol/LTris/HCl，150mmol/L NaCl，pH8.0。利用AKTA蛋白纯化系统(Pharmacia,Uppsala， Sweden)，最终收集目的蛋白。 经过以上四个步骤的纯化工作，蛋白液经SDS-PAGE检测为单一条带，纯度可达
95%以上。 实施例15 用实施例13中所获得的1 y g纯蛋白进行生物转化实验。在lmL 0. lmol/L醋酸缓冲液(pH 5. 5)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，5mmol/LNADPH，混匀后在3(TC恒温摇床上振荡反应8h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物为(R)-苯基乙二醇的光学纯度为96. 8 % e. e.，产率为90. 2 % 。
实施例16 用实施例13中所获得的2 ii g纯蛋白进行生物转化实验。在lmL 0. lmol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，5mmol/L NADPH，混匀后在30。C恒温摇床上振荡反应8h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物为(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100% e. e.，产率为98. 9%。
权利要求
一株制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pETSCRII，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM 209290。
2. 权利要求1所述重组菌株CCTCC NO :M 209290的构建方法，其特征是将羰基还原酶基因scr II插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II，重组质粒pETSCRII转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100 y g/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E. coli BL21/pETSCRII，即CCTCCN0 :M 209290 ;步骤为:① (S)-羰基还原酶基因scr II的获取用于钓取scr II基因的菌种为近平滑假丝酵母(C.par即silosis)CCTCC NO :M203011 ;羰基还原酶基因scr II的克隆以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCCNO :M203011基因组为模板，以含有BamHI酶切位点的SCR II_F:5' -ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3'，和含有Xhol酶切位点的SCR II_R :5' -TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3'为引物，PCR扩增反应获得scr II基因，基因全长840bp ;基因scr II的GenBank编号为GQ411433 ;PCR体系为ddH20 35. 5 iiL， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L Mg2+3 ii L，(2. 5,1/L dNTP 4 ii L， Taq DNA Polymerase 0. 5 ii L， 25pmo1/ ii L的引物SCR II—F和SCRILR各1 ii L ;PCR反应条件94。C 4min ;94。C lmin、56。C lmin、72。C lmin，30个循环；72。C 10min ;② 重组质粒pETSCR II的构建利用限制性内切酶BamHI和Xhol对目的基因scr II和表达载体pET28a分别进行双酶切，处理后的DNA片断通过粘性末端连接，获得带有羰基还原酶基因scr II的重组质粒pETSCR II ;③ 重组质粒转化大肠杆菌取重组质粒pETSCR II 2iiL，转化大肠杆菌E. coliBL21(DE3)感受态细胞，转化液涂布到含有100iig/mL卡那霉素的LB平板上，37t:倒置培养过夜，获得阳性克隆E. coli BL21/pETSCR II。
3. 利用构建的重组菌CCTCC NO :M209290不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是(1) 重组菌株CCTCC NO :M 209290的培养LB液体培养基，以g/100mL计胰蛋白胨1 %，酵母提取物0. 5%， NaCl 1 %， pH7. 0 ;需要时使用前加入卡那霉素100 ii g/mL，固体培养基再添加1. 5%琼脂粉；培养条件挑取重组菌CCTCC NO :M 209290的单菌落接种于3mL含100 y g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37t:，200rpm振荡培养过夜；取lmL培养液转接于50mL含100ii g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37t:，200rpm振荡培养至0D6。。 0. 6，在培养物中加入诱导物0. lmmol/L异丙基-P -D-硫代半乳糖苷，于3(TC诱导培养6h ; 10， OOOrpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞；(2) 以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应在lmL 0. lmol/LpH4. 5 6. 0的醋酸缓冲液，或者lmL 0. lmol/L p朋.5 7. 5的磷酸缓冲液，或者lmL 0. lmol/L pH8. 0 (9. 0的Tris-HCl缓冲中进行反应，底物浓度2-羰基苯乙酮为5g/L，反应温度为25_35°C ;采用重组菌全细胞生物转化重组菌全细胞浓度为0. lg/mL，反应48h，反应前不需要加入辅酶，产物为(S)-苯基乙二醇；或采用重组菌破碎后的上清液经纯化后的重组蛋白SCRII生物转化重组蛋白SCRII浓度为1 2 ii g/mL，反应8h，反应前加5mmol/L辅酶NADPH，产物为(S)-苯基乙二醇。
4.根据权利要求3所述的不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是重组蛋白SCRII的纯化菌体收集将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎工作时间2s，间歇时间6s，共20min ;破碎液16， OOOrpm离心40min ;弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯化工作；蛋白纯化先将上清挂Pharmac ia公司的Ni柱两遍，用MCAC-20缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitr即柱蛋白脱盐，利用Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液；接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱，1 X lcm，进行蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的Superdex 200， HiLoad 26/60，进行蛋白纯化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到95%以上。
全文摘要
一株羰基还原酶重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一种新型的近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)羰基还原酶基因scr II，Genbank序列号为GQ411433，将scrII插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II，再转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coliBL21/pETSCRII，保藏编号CCTCC NOM209290。该重组菌细胞不对称还原5g/L 2-羰基苯乙酮，催化获得(S)-苯基乙二醇，产物的光学纯度为100％，产率达98.1％。本发明为高效制备(S)-苯基乙二醇提供了新型功能基因和有效途径。
文档编号C12N15/53GK101717745SQ20091026314
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者张荣珍, 徐岩, 耿亚维 申请人:江南大学