专利名称：从人骨髓单核级分获得结缔间质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得间质干细胞的方法。具体来说，本发明涉及一种从人骨髓细胞的单核级分获得间质干细胞的方法。所述方法包含获得所述单核骨髓级分的阶段，回收和预扩增间质干细胞的阶段，以及扩增间质干细胞直到获得可能的治疗应用所必需的临床剂量的阶段。
背景技术：
间质干细胞(MSC)是多能细胞，已被证实可有效地治疗肌骨病变和提高心血管疾病中的心脏功能(Le Blanc K. ,Pittenger M. ,Mesenchymal stem cells progress toward promise. Cytotherapy 2005 ；7 :36-45)。MSC可从包括骨髓、脂肪组织和脐带血在内的多种成人组织分离。除此以外，这些细胞可在体外扩增。单核骨髓级分(MMF)是通过基于离心从骨髓获得的血液的分离操作来获得。MMF 是异种细胞群，其除了包含间质干细胞外，还可能包含造血祖细胞。相对于在MMF中同样存在的成熟造血细胞，这两个细胞群体以极小浓度存在。Fridenshtein 等人(Fridenshtein A. J. , Deriglazova U. F. , Kulagina N. N.等 A Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hemato1. 1974 第 2 卷第 83-92页)最先从骨髓获得了间质干细胞，其技术是基于间质干细胞粘附塑料表面的能力，这是大多数造血细胞所不具有的性质。这种方法的缺点是间质细胞的回收产率很低， 这可能是因为所述细胞在骨髓中的含量并不高，估计在0.001%与0.01%之间(Alhadlag A.禾口 Mao J. Mesenchymal Stem Cells :Isolation and Therapeutics. Stem Cells and Development. 2004. 13 :436-448 (3))。然而，所述细胞与塑料粘附已被确立为获得间质干细胞的方法的进一步改良的起点。Heynesworth等人使用胎牛血清作为培养基的补充物，已经成功获得了间质干细胞，其具有高粘附能力、高增殖水平且历经长时期仍保持多能性(Heynesworth S. Ε.， Goshima J.，Goldberg V. Μ.，Calplan Α. I. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow//Bone. 1995.第 13 卷·第 81-85 页)。这禾中方法的缺点是搜索细胞培养的合适批次和胎牛血清的相应分析要花费大量时间且非常繁琐。 此外，因为胎牛血清的批次与批次之间显示巨大变化，所以无法确保结果可以再现。这种方法的另一个缺点是，为了获得足量的用于临床应用的间质干细胞，细胞必须培养4到6周，且在一些情况下，例如在患有骨代谢疾病的患者中，培养时间可能更长。之所以需要所述长培养时间的原因是，如先前所述，从骨髓获得的间质细胞的数量很少。长细胞培养时间可能增加污染风险且显著增加培养物的维持成本。此外，由于复制数增加，因此细胞存在可能丧失多能性或进入衰老的风险，这会损害其治疗能力。通常用于缩短间质细胞培养时间的方法的关注点集中在例如培养基的补充物、 塑料表面的性质、接种剂量和所用培养方式等因素(Sotiropolou P.A.，Perez S. A.，
3Salagianni M, Baxevanis C. N. , Papamichail M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006 ；24 :462-471)。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种用于体外培养人骨髓的间质干细胞的方法，其中获得间质干细胞的临床剂量所必需的时间和复制数相比常规方法有所减少。这种程序是基于组合用于从单核骨髓级分分离间质细胞的高特异性条件和使用AB血型的人血清作为培养基的补充物的协同效应。所述程序可用作昂贵且很难再现的胎牛血清的替代方案。此外， 人AB血清具有以下优点，即其比胎牛血清更经济且提供更好的再现性。另外，与常规策略中使用的条件相比，提议的分离条件允许从单核级分容易地回收大量间质细胞。当认识到分离的可用间质细胞的起始数量越多，获得必需临床剂量所需要的时间和资源就越少时， 所述事实尤其重要。通过系统性研究这些分离条件对于从接种体回收间质细胞以及在补充有人AB血清的培养基中的单核骨髓细胞的洗涤时间的影响，已经实现了所述条件。本发明的另一个目标是提供一种可获得间质干细胞的相同备用拷贝的方法，所述备用拷贝在增殖和分化能力方面具有与初始间质干细胞相同的特征。根据本发明的方法可用于从例如脂肪组织、胰腺、肝脏、肌骨、真皮、滑膜、小梁骨、 脐带血、肺组织、牙髓和牙周结缔组织等其它来源获得间质细胞。在间质细胞来源不是骨髓的情况下，对于用作来源的每一种细胞类型，初始治疗将适当地有所区别。
具体实施例方式因此，本发明的一个目标是提供一种从通过密度梯度离心获得的人骨髓单核级分获得间质干细胞的方法，其特征在于其包含以下阶段a)遵循以下培养方案，通过原代培养回收和预扩增间质干细胞，其中将单核骨髓细胞接种到补充有人AB血清(10%)的DMEM培养基中-在第5天用盐水溶液洗涤单核培养细胞，并加入补充有人AB血清(10%)的培
养基，-在9天后用如上所述的相同培养基置换培养基，-在第12天用胰蛋白酶消化原代培养物。这些细胞产生扩增培养物(C)，b)继代培养遵循以下培养方案，将在(a)中经洗涤的单核细胞再接种到补充有人AB血清(10%)的培养基中-在第5天用盐水溶液洗涤培养物，并加入补充有人AB血清(10%)的培养基，-在第9天用如前所述的相同培养基置换培养基，-在第12天用胰蛋白酶消化原代培养物。回收间质干细胞并在氮气容器中冷冻和储存。c)扩增培养在第12天扩增a)中获得的间质细胞。遵循以下培养方案，将这些细胞在补充有人AB血清(10% )的培养基中再接种和扩增-在第3天和第6天用如前所述的相同培养基置换培养基，
-在第12天用胰蛋白酶消化培养基。包装这些细胞以便转移到手术室。在一优选实施方案中，在原代培养中每平方厘米表面积接种200，000到400，000 个细胞。此外，用于原代培养和继代培养(阶段b)的培养基优选是补充有10% (ν/ν)人 AB血清的杜贝卡改良依格培养基(Dulbecco modified Eagle ;DMEM)。根据本发明的方法的优点是，与常规方法相比，在介于6与8之间的低复制数下和较短时期(约20天)内可获得介于40xl06与50xl06之间的大量间质干细胞。此外，另一个优点是，通过冷冻在继代培养(步骤b))中获得的间质干细胞，可以产生必需剂量的细胞以防止该方法因意外原因失败，或获得间质干细胞的相同备用拷贝根据本发明的方法还具有操作简单和成本低的额外优点，这是因为既不需要大规模培养也不需要使用胎牛血清。下文参考实施例更详细地描述了本发明。然而，此实施例并不打算限制本发明的技术范围。实施例实施例1将通过骨髓血提取物的梯度离心而获得的单核骨髓细胞以每平方厘米300，000 个的密度接种到636cm2商用培养瓶中，所述培养瓶含有补充有人AB血清(10%)的DMEM培养基。5天后洗涤培养物，并将上清液接种到另一个636cm2商用培养瓶中，所述培养瓶含有补充有人AB血清(10% )的DMEM培养基。将培养基(补充有人AB血清(10% )的DMEM) 加入所述培养基中，培养面积与培养基体积的比率是3 1。在第9天，置换培养基并加入培养基(补充有人AB血清(10%)的DMEM)，培养面积/培养基体积的比率是3 1。在第 12天，用胰蛋白酶消化培养物，并获得15xl06到20xl06个间质干细胞，纯度为约80%。这些细胞以4000个细胞/平方厘米的密度接种到两个636cm2商用培养瓶中，所述培养瓶含有补充有人AB血清(10%)的DMEM培养基。将细胞培养8天，期间使用补充有人AB血清 (10% )的DMEM培养基，以3 1的培养面积/培养基体积比置换两次培养基(第3天和第6天)。将原代培养中的非粘附细胞接种到继代培养(步骤b))中，在继代培养(步骤b)) 开始5天后洗涤，并丢弃洗涤液。在第9天，置换培养基并加入培养基(补充有人AB血清 (10%)的DMEM)，培养面积/培养基体积的比率是3 1。在第12天，用胰蛋白酶消化培养物，并获得3xl06到6xl06个间质干细胞，纯度为约65%。所得细胞在氮气罐中冷冻。在原代培养中获得的细胞所展示的免疫表型谱图中，展示了标志物105、90、73的共表达，但未展示标志物⑶45、⑶31、HLA-DR的表达，这通常和来源于骨髓的间质干细胞相关。此外，所得细胞展示了从骨细胞系分化的能力，这证明已经保持了多能性。另一方面， 在继代培养(步骤b))中获得的细胞的免疫表型谱图中，展示了标志物105、90、73的共表达，但未展示标志物⑶45、⑶31、HLA-DR的表达，这通常和来源于骨髓的间质干细胞相关。 除此以外，所得细胞展示了从骨和脂肪细胞系分化的能力，这证明已经保持了多能性。虽然已参考优选实施方案的实施例描述了本发明，但这些实施例不应理解为限制本发明，本发明是由以下权利要求的最广泛的解释限定范围。
权利要求
1.一种从通过密度梯度离心获得的人骨髓的单核级分获得间质干细胞的方法，其特征在于包含以下阶段a)遵循以下培养方案，通过原代培养回收和预扩增所述间质干细胞，其中该单核骨髓细胞接种到补充有人AB血清(10% )的DMEM培养基中1.在第5天用盐水溶液洗涤所述单核培养细胞，并加入补充有人AB血清(10%)的培养基， .在第9天用如前所述的相同培养基置换所述培养基，iii.在第12天用胰蛋白酶消化原代培养物，这些细胞产生扩增培养物(c)，b)继代培养遵循以下培养方案，将在(a)中经洗涤的所述单核细胞再接种到补充有人AB血清(10%)的培养基中iv.在第5天用盐水溶液洗涤所述培养物，并加入补充有人AB血清(10%)的培养基，v.在第9天用如前所述的相同培养基置换所述培养基，vi.在第12天用胰蛋白酶消化所述原代培养物，回收所述间质干细胞并在氮气容器中冷冻和储存，c)扩增培养在第12天扩增(a)中获得的所述间质细胞，遵循以下培养方案，将这些细胞在补充有人AB血清(10% )的培养基中再接种和扩增vii.在第3天和第6天用如前所述的相同培养基置换所述培养基，viii.在第12天用胰蛋白酶消化所述原代培养物，包装这些细胞以便转移到手术室。
2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在阶段(a)中接种的单核骨髓细胞的数量介于每平方厘米表面积200，000与400，000个细胞之间。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在阶段(b)中接种的间质干细胞的数量介于每平方厘米表面积3000与5000个细胞之间。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在来自阶段(a)的所述原代培养物中获得15x IO6到20x IO6个间质干细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述继代培养物(阶段(b))中获得 3x IO6到6x IO6个间质干细胞。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在阶段(a)的所述原代培养物中获得的所述间质干细胞的纯度是80%。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述继代培养物(阶段(b))中获得的所述间质干细胞的纯度是65%。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在阶段(c)中获得40xIO6到50x IO6 个间质干细胞。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中细胞复制数介于6与8之间。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中获得间质干细胞的总时间不超过21天。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述继代培养物(阶段(b))被冷冻和保存以作为备份拷贝。
全文摘要
本发明涉及一种使用AB型人血清作为补充物，从人骨髓细胞单核级分获得结缔间质干细胞的方法。所述方法包含获得所述骨髓单核级分的步骤，回收和预扩增结缔干细胞的步骤，以及扩增结缔干细胞直到获得其治疗应用所必需的临床剂量的步骤。
文档编号C12N5/0775GK102388129SQ200980157235
公开日2012年3月21日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年1月2日
发明者乔迪·琼·开罗巴迪洛, 卢西亚诺·罗德里格斯戈麦斯, 弗朗西斯科·戈迪亚卡萨布兰卡斯, 琼·加西亚洛佩兹, 阿尔诺·普拉卡尔韦 申请人:血液与组织库