专利名称：一种融合蛋白多聚体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种多价的重组抗体。
背景技术：
“靶向治疗”是根据肿瘤的不同的特异性位点，抗肿瘤药物靶向性地与其发生作用 从而杀死肿瘤细胞，而对正常组织影响较小。这是目前最理想的治疗模式。“靶向治疗”包 含许多不同的策略，主要可以分为直接的和间接的两大类。直接的策略是指在靶向肿瘤相关或特异的蛋白时直接改变其信号传导，手段包括 抗体结合相关抗原或者利用小分子药物干扰这些蛋白。例如表皮生长因子受体(EGFR)和 血管内皮生长因子受体(VEGFR)由于与肿瘤细胞的增殖、生长、浸润、转移等关系密切同时 二者在许多肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞中均呈高表达，是抗肿瘤理想的靶点，可以用抗 体结合这些靶点，从而抑 制肿瘤细胞的生长、转移。间接的策略是通过携带有各种效应分子的融合蛋白靶向到肿瘤细胞表面表达的 肿瘤相关蛋白来实现。常见的效应分子包括小分子药物、毒素、免疫调节分子等。抗人CD3 抗体由于具备结合并活化CTL的功能，可以利用其与靶向抗体的融合，从而介导CTL杀伤肿 瘤细胞。克隆抗体的重链可变区或者轻链可变区后得到的最小抗原识别结合单位称为单 区抗体(SdAb，Single domain antibody) 0根据需要，单区抗体可以来源于不同的物种，比 如人、鼠、兔。来源于人抗体可变区的单区抗体在考虑到用于临床时理论上免疫原性应当 很低。通常情况下，由于人抗体在体内重链与轻链是结合在一起的，故人单区抗体单独存在 时，易于聚集。但是借助于噬菌体技术和体外加热可以筛选出抗聚集的人单区抗体库。进 一步通过DNA扩增技术可获得更大库容量的抗聚集人单区抗体库(Christ等，Protein Eng Des Sel,20,2007,413-416)。我们可以从该库中筛选到有临床应用价值的人单区抗体。除了来源于传统抗体外，单区抗体亦可源于一类特殊的抗体。在骆驼科动物[例 如单峰骆驼(dromedary)，骆驼(camel)，美洲驼羊(llama)，羊驼(alpaca)]和软骨鱼 (例如鲨鱼)血清中存在天然的缺失轻链的抗体，其中来自骆驼科动物的称为重链抗体 (heavy-chain antibody),来自软骨鱼的禾尔为 Ig-NAR 抗体(immunoglobulin-like novel antigen receptor)。克隆重链抗体或者Ig-NAR的可变区构建的只由一个重链可变区组成 的抗体禾尔为 VHH 抗体(variable domain of heavy chainof heavy-chain antibody, VHH) 或者V-NAR抗体(variable domain of Ig-NAR)。VHH抗体和V-NAR抗体也属于单区抗体。单区抗体是目前发现的最小的抗体。单区抗体的优点包括1)分子量仅为15KD左右，只有普通抗体十分之一大小。分子小使得单区抗体应用 于临床时易穿透机体组织，对抗体进行基因工程改造时操作方便，同时作为最小的抗体，仅 有三个互补决定区(CDR)，文库构建过程更加简单；2)单区抗体结构使得其相对其他小分子抗体溶解度更高，不易形成聚集体；3)单区抗体结构稳定，研究证实，将VHH抗体在37°C放置一周或在高温条件(90°c )下保存单区抗体，它都能保持比较好的生物活性；4)单区抗体可于大肠杆菌中大量表达，利于低成本制备。另一方面，由于单区抗体仅含有一个抗原识别结合单位，使得其亲和力较传统抗体低，限制了它在临床上的利用。在肿瘤靶向的应用经验显示，即使是高亲和力的单价结合 仍然在血液中很快被清除，而且与目标抗原结合时间相对较短。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白多聚体，用于解决目前单区抗体亲和力低，与 目标抗原结合时间短的不足。本发明融合蛋白多聚体的融合蛋白由A、B两个部分构成，其中A为单区抗体，B为 能够使融合蛋白多聚化的多肽，包括来源于TNF α、ACRP30、P53、C0MP和C4BP蛋白及其突 变体的多肽序列。具体地说，这些多肽选自TNFa的AA80-235、ACRP30的AA16-108、P53的 AA319-360、COMP 的 AA29-76 和 C4BP α 链 C 末端(AA541-597)。所述单区抗体为黑色素瘤抗原MART-I抗体、黑色素瘤抗原gplOO抗体、CEA-6抗 体、EGFR抗体或者VEGFR抗体。本发明融合蛋白多聚体可通过如下方法制得将编码A多肽的DNA与编码B多肽 的DNA重组，得到融合基因，将该基因克隆到表达载体，将所述表达载体导入宿主，培养并 诱导表达融合蛋白，经分离纯化后即得融合蛋白多聚体。在本发明的一个实施例中，将MTl (抗MART-1)编码基因与COMP多肽编码基因融 合，可操作地接入到PVT2表达载体，得到重组表达质粒MT1C0MP，将所述重组表达质粒转 化大肠杆菌，经培养和诱导表达后，分离纯化得到MT1C0MP蛋白五聚体。实验证明，MTl作 为一种TCR-Iike抗体，用COMP基序融合的MT1C0MP五聚体蛋白能够特异识别细胞表面的 HLA-A2复合物呈递的来源于MART-I的多肽ELAGIGILTV，而且特异结合MART-1-HLA-A2复 合物的亲和力是单体结合的亲和力的IO5倍以上；COMP与单区抗体的融合蛋白可溶性良 好，40mg/mlMTlC0MP 在 50mM Tris,500mM Nacl，200mM 咪唑中保存，于 4°C一年内未见明显 沉淀。在另一个实施例中，将MTl (抗MART-1)编码基因和抗⑶3单链抗体编码基因与 COMP多肽编码基因融合，可操作地插入PEF-Myc-ER表达载体，得到重组表达载体PEF-MCC， 将其瞬时转染293T细胞，经培养后收集细胞，裂解后分离纯化得到双特异性抗体MCC。体外 杀伤实验表明，MCC可以介导非特异的T细胞特异杀伤表面表达MART-1-HLA-A2复合物的 T2细胞。用类似的方法，本发明分别获得了 gpa7C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体gpa7 与COMP的AA29-76融合，抗gplOO) ,ES1C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体ESl与COMP的 AA29-76融合，抗CEA-6)、E2C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体E2与COMP的AA29-76融合， 抗EGFR)、V21C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体V21与COMP的AA29-76融合，抗VEGFR)、 ESlTNF融合蛋白三聚体(将单区抗体ESl与TNF α的ΑΑ80-235融合，抗CEA-6)、E2TNF融 合蛋白三聚体(将单区抗体E2与TNF α的ΑΑ80-235融合，抗EGFR)、ES1ACRP融合蛋白三 聚体(将单区抗体ESl与ACRP30的AA16-108融合，抗CEA-6)、E2ACRP融合蛋白三聚体(将单区抗体E2与ACRP30的AA16-108融合，抗EGFR)、ES1P53融合蛋白四聚体(将单区抗体 ESl与P53的AA319-360融合，抗CEA-6)、E2P53融合蛋白四聚体(将单区抗体E2与P53 的AA319-360融合，抗EGFR)、ES1C4BP融合蛋白七聚体(将单区抗体ESl与C4BP α链C末 端ΑΑ541-597融合，抗CEA-6)、E2C4BP融合蛋白七聚体(将单区抗体Ε2与C4BP α链C末 端ΑΑ541-597融合，抗EGFR)。结果显示，这些多聚抗体的亲和力均显著提高，并且可溶性良 好。本发明融合蛋白多聚体，可以在大肠杆菌中成功表达，表达量高，相对于淋巴细胞 杂交瘤技术或真核表达，原核表达制备工程化抗体技术相对简单，成本更低；本发明提供的 使融合蛋白多聚化的多肽均来自于人源蛋白，当多聚抗体用于临床时，应当不存在强免疫 原性的问题；本发明多聚抗体具有良好的可溶性和生物活性，并且大大提高了抗体蛋白的 亲和力。本发明融合蛋白多聚体可以制成各种生物技术产品，例如制成诊断试剂，用于诸如 黑色素瘤的诊断，用该蛋白多聚体携带治疗药物，用于诸如黑色素瘤的靶向治疗等等。
图1显示的是单区抗体及多聚抗体的结构，图A中MT1S，单区抗体，特异识别由 HLA-A2复合物呈递的来自黑色素瘤抗原MART-I的多肽；MT1C0MP，单区抗体MTl的五聚体； gpa7C0MP，五聚的单区抗体，特异识别由HLA-A2复合物呈递的来自黑色素瘤抗原gplOO的 多肽；E2C0MP，五聚的单区抗体，特异识别表皮生长因子受体；MCC，MT1C0MP携带功能分子 抗CD3单链抗体后，形成多价的双特异抗体；COMPcc，来自软骨基质蛋白的卷曲螺旋序列； L，连接体；myc，c-myc检测标签；H，His5纯化标签。图B是不同抗体的结构示意图。图2显示的是色谱法分析MT1C0MP的纯度。图3显示的是MT1C0MP在还原和非还原条件下的蛋白质电泳。图4㈧显示的是酶联免疫吸附测定(ELISA)的示意图。图4 (B) ELISA检测 MT1C0MP的识别特异性，BBM. 1 (抗β 2m)被用作阳性对照验证HLA-A2复合物是否正确折叠 及包被于孔中。图5显示的是抗体的亲和力测定。采用表面等离子体共振技术测定MT1C0MP和 MTlS的亲和力。所有测定中样品同时流过相同密度的gpl00/HLA-A2复合物包被的通道 以进行结合的背景分析。(A)在芯片上固定1000RU的MART 1/HLA-A2复合物，设置5个 浓度梯度(0. 125μΜ，0· 25μΜ，0· 5μΜ，1μΜ，2μΜ)分析MTlS的亲和力。(B)在芯片上固 定1000RU的MART-1/HLA-A2复合物，分析15nM MT1C0MP流过通道时响应情况。(C)提高 MART-1/HLA-A2复合物在芯片上固定的密度至3000RU，同样分析15nMMTlC0MP流过通道时 响应情况。图6显示的是MT1C0MP特异识别表达MART-1-HLA-A2复合物的T2细胞。图(A) T2 细胞经过MART-1，gplOO或不加肽刺激后，MT1C0MP仅识别MART-1。图(B)BB7. 2抗体验证 T2经过多肽刺激后细胞表面稳定表达肽-HLA-A2复合物。图7显示的是MCC的western blot检测。图8显示的是PBMC在体外经过MCC介导对表面含有MART-1-HLA-A2复合物的T2的杀伤作用。图(A)不同效靶比情况下，在杀伤体系中分别加入MCC，PBS，MT1S和MT1C0MP 时的杀伤情况，后三组是阴性对照。图⑶固定效靶比为10，分析不同浓度的MCC对杀伤作用的介导能力。图9显示的是gpa7C0MP特异识别表达gpl00-HLA_A2复合物的T2细胞。图(A) T2细胞经过gplOO，CMV, HBV或不加肽刺激后，gpa7C0MP仅识别gplOO。图(B)BB7. 2抗体 验证T2经过多肽刺激后，细胞表面稳定表达肽-HLA-A2复合物。图10显示的是FACS分析E2C0MP对于结肠癌细胞系colon205的结合情况。图11显示的是E2C0MP抑制人表皮样癌细胞系A431的增殖情况。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中涉及到的百分号“ ％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指溶液IOOml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时 容量的比例。本发明分别获得了 gpa7C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体gpa7与COMP的 AA29-76融合，抗gplOO) ,ES1C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体ESl与COMP的AA29-76融 合，抗CEA-6)、E2C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体E2与COMP的AA29-76融合，抗EGFR)、 V21C0MP融合蛋白五聚体(将单区抗体V21与COMP的AA29-76融合，抗VEGFR) ,ESlTNF融 合蛋白三聚体(将单区抗体ESl与TNF α的ΑΑ80-235融合，抗CEA-6)、E2TNF融合蛋白三聚 体(将单区抗体E2与TNF α的ΑΑ80-235融合，抗EGFR)、ESIACRP融合蛋白三聚体(将单 区抗体ESl与ACRP30的ΑΑ16-108融合，抗CEA-6)、E2ACRP融合蛋白三聚体(将单区抗体 Ε2与ACRP30的ΑΑ16-108融合，抗EGFR)、ES1P53融合蛋白四聚体(将单区抗体ESl与P53 的AA319-360融合，抗CEA-6)、E2P53融合蛋白四聚体(将单区抗体E2与P53的AA319-360 融合，抗EGFR)、ES1C4BP融合蛋白七聚体(将单区抗体ESl与C4BP α链C末端ΑΑ541-597 融合，抗CEA-6)、E2C4BP融合蛋白七聚体(将单区抗体Ε2与C4BP α链C末端ΑΑ541-597 融合，抗EGFR)。结果显示，这些多聚抗体的亲和力均显著提高，并且可溶性良好。以下以COMP为例，详细说明本发明融合蛋白多聚体的构建以及活性检测。实施例1单区抗体五聚体蛋白的制备和验证1.克隆 MT1C0MP 和 MTlS 将MTl用COMP融合制成五聚体(方法见图1)，首先用PCR法扩增表达MTl的基因片段，所用引物为MTlF 5' TAATAAGAAGACCGCAGGCCGATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGG 3‘ ；sdAbR 5' ATT ATTATGGGCCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT 3‘模板表达MTl的噬菌体(北京表源生物技术有限公司)反应体系10Xpfubuffer 10 μ 1, pfu 1 μ 1, dNTP 8 μ 1, MTlF 20 μ 1, sdAbR 20 μ 1，模板 1μ 1，H2O 40 μ 1。反应程序94°C5min ；94°C 30s，60°C，30s，72°C 40s，30 循环；72°C IOmin两端带有Bbs I和Apa I酶切位点，酶切消化后插入Bbs I和Apa I消化后的pVT2 (Zhang 等，J Mol Biol，335，2004，49-56)，得到质粒 MT1VT1B。然后 PCR 扩增 COMP 片 段，所用引物为compF 5'ATTATTATGGGCCCGGCGGCGGCTCCGGTGGCGGCGGTTCCGACCTGGGTCCACAGATG 3‘compR 5' GAAGTCCGGACCCACCTCCGCCCTGCTGCATCCCGCACGC 3‘模板b2mCOmp-PET28a(北京表源生物技术有限公司)反应体系10 Xpfu buffer 10 μ 1, pfu 1 μ 1, dNTP 8 μ 1，compF 20 μ 1, compR 20 μ 1，模板 1μ 1，H2O 40 μ 1。反应程序94°C5min ；94°C 30s，55°C，30s，72°C 30s，30 循环；72°C IOmin两端带有Apa I和BspE I酶切位点，酶切消化后插入Apa I和BspE I消化后的 MTIVTIB，替换了其中的VTIB，得到质粒MT1C0MP。为验证单区抗体五聚体相对于单体的功能变化，合成原核表达单区抗体MTlS作 为参照，合成引物 ABF 和 ABR (ABF 5 ‘ CGGCGGCGGCT 3' , ABR 5' CCGGAGCCGCCGCCGGGCC 3')，退火后两端含Apa I和BspE I粘性末端，中间编码三个甘氨酸，插入Apa I和BspE I消化后的MT1VT1B，删除了其中的VT1B，得到质粒MT1S。2.表达纯化 MT1C0MP 和 MTlS 参照(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，科学出版社，2002，96-99)方法，分别将 质粒MT1C0MP和MTlS转化大肠杆菌TG1，并诱导表达。这些蛋白表达后，将被分泌至TGl的 周质腔中，利用其所带His5标签，通过IMAC的方法，可获得纯度为95%以上的目的蛋白。克隆接种至10ml LB(含有100μ g/ml Amp)，37°C，过夜，220rpm ；将过夜培养物 1 100 稀释至 IL LB(含有 ΙΟΟμ g/ml Amp)，37 °C，220rpm，培养 5h ；加入终浓度为 ImM 的 1卩丁6，241，180印111，继续培养2211 ；8000g，15min，4°C离心收菌；菌体用 20mM Tris-cl， pH8. 0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT,0. 5h ；超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm, 20min 离心 3 次；上清使用 GE healthcare 的 chelating sepharose Fast Flow 柱料纯化， 步骤参照其厂家提供的说明书。MT1C0MP于200mM咪唑时洗脱，MTlS大约于60mM咪唑时洗脱。其中MTlS的产量 高达50-100毫克每升培养物，五聚体MT1C0MP相对低一些，约5_10毫克每升培养物。为分析MT1C0MP 在溶液中是否均一，将 2mg MT1C0MP 换至 20mM Tris-cl, pH8. 0, 50mMNaCl 的缓冲液中。样品通过 20mM Tris-cl, pH8. 0,50mM Nacl 平衡好的 superdex 200柱子。整个操作参考AKTA Purifier提供的手册。结果显示纯化好的MT1C0MP通过 superdex 200柱子时未见明显的聚集体或降解产物，主要以一个均一的峰出现(见图2)。从COMP蛋白的晶体结构可知，单体之间存在一个链间二硫键，两两相连，形成五 聚体，该二硫键所需的cys位于COMP基序上。当COMP基序携带其它多肽形成五聚体时， 链间二硫键依然存在，通过非还原SDS-PAGE可以很容易检测到。用不含DTT的loading buffer处理MT1C0MP，然后于6% SDS-PAGE中进行电泳，分析MT1C0MP是否借助于二硫键形 成多聚体，在非还原电泳情况下，MT1C0MP以一条分子量远大于单体的条带出现(见图3)。 结果说明，MT1C0MP是以多聚体形式存在，并且单体之间通过链间二硫键相连。通过质谱分析MT1C0MP的分子量，方法是将MT1C0MP换缓冲液至25mMNH4HC03，然后 用MALDI串联飞行时间质谱仪(MALDI-T0F-T0F)分析其分子量，结果表明MT1C0MP的分子量为109kD，而MT1C0MP作为单体时的理论分子量为21. 7kD，因此从分子量看，MTICOMP是
以五聚体存在。 实施例2MT1C0MP五聚体融合蛋白的抗原特异性实验用ELISA法分析MT1C0MP的抗原特异性。
1)生物素化的牛血清白蛋白和HLA-A2复合物的制备生物素化的牛血清白蛋白(BSA-biotin)是通过使用 sulfo-NHS-LC-Biotin (pierce, Rockford)标记BSA获得，具体操作严格按照厂家 提供的说明。生物素化的HLA-A2复合物的制备是根据Dirk Busch制备HLA-A2复 ■a ^ B M W rjP ^tU ^Kp M (http //www. mikrobio. med. tu-muenchen. de/category/ laboratory-group-busch/)(方法如下首先在大肠杆菌表达HLA-A2和β 2m的包涵体 (HLA-A2和β2πι基因由北京表源提供)，纯化后，与不同的多肽(HLA-A2限制性，包括 MART-I (ELAGIGILTV), gplOO (IMDQVPESV), CMV (NLVPMVATV), FLU (GILGFVFTL)，均在北京赛 百盛公司合成)进行重折叠，折叠好的肽-HLA-A2复合物在体外利用BirA酶(北京表源) 生物素化，最后通过superdex200柱子纯化生物素化的HLA-A2复合物)。2) ELISA 实验该实验方法主要参考Paula henderikx 的记述(Cancer Research, 1998,58, 4324-4332)，略有改动(见图4A)，流程如下过夜包被BSA-biotin (10 μ g/ml,溶于 PBS, ρΗ7· 4)于 96 孔酶标板(NUNC, DENMARK, maxisorp) ；PBST 洗 3 次，加入抗生蛋白链菌素(str印tavidin) (10 μ g/ml，溶于 PBS, ρΗ7· 4)，Ih ；PBST洗3次，于不同孔中加入呈递不同肽(MART-1, gplOO, CMV和FLU)的 生物素化 HLA-A2 复合物(5 μ g/ml, PBS, ρΗ7· 4)，孵育 Ih ；PBST 洗 1 次，加入 2% MPBS (2% 脱脂奶粉PBS缓冲液，ρΗ7· 4)封闭30min。除去2 % MPBS，加入MT1C0MP (50 μ g/ml，溶于 PBS)，孵育lh。PBST洗3次，加入合适浓度的抗c-myc (9E10,北京表源，稀释于2% MPBS)， 孵育lh。PBST洗3次，加入合适浓度的羊抗鼠-辣根过氧化物酶(稀释于2%MPBS)，孵育 lh。PBST洗3次，PBS洗3次，加入50 μ 1显色液(ΤΜΒ，晶美)，孵育IOmin ；加入50 μ 1 2Μ H2SO4中止反应，测量450nm处的吸光度A45tl值。同时针对呈递不同肽的生物素化HLA-A2复 合物，均使用BBM. 1(抗β2πι)作为阳性对照验证HLA-A2复合物是否正确折叠及包被于孔 中。从ELISA结果看，对于HLA-A2复合物呈递的不同肽，MT1C0MP具有识别的特异性， MT1C0MP只结合来自MART-I的多肽，不结合来自gplOO，CMV和FLU的多肽(见图4B)。进一步通过流式细胞术(FACS)分析五聚的TCR样抗体识别细胞的能力。1)将T2细胞于RlO培养基(补充10% FBS，谷酰胺，青霉素/链霉素的RPMI 1640 介质)中传代培养，700rpm，3min离心收取细胞，加适量RlO悬起浓度为2X106/ml，加入肽 gplOO 或 MART-I (终浓度为 20 μ M)，37°C，4h。2)用SB缓冲液(染色缓冲液，PBS+0. 5% BSA+2mM EDTA)洗细胞两次，并悬至浓度 为5 XlOVml ο加入MTlCOMPdO μ g/ml)作为一抗，30min，冰上；SB洗后，加入抗c_myc作 为二抗，30min，冰上；SB洗后，加入羊抗鼠-FITC作为三抗，30min，冰上；SB洗后，进行FACS 分析。FACS结果用flow jo软件处理。实验结果见图6，T2细胞经过肽gplOO或MART-I刺激后，可使得细胞表面稳定表达大量的gpl00-HLA-A2复合物或MART-I-HLA-A2复合物，MT1C0MP可以特异识别结合MART-I刺激的T2，不识别gplOO刺激的T2。实施例3MT1C0MP五聚体融合蛋白的亲和力实验采用表面等离子体共振(surface ρlasmon resonance, SPR)技术测定MT1C0MP五 聚体融合蛋白，MTlS的亲和力，检测设备是Biacore 3000 (Biacore AB公司，瑞典)，所用芯 片为Sensor chipSA(BiacoreAB公司，瑞典)，芯片的准备按照厂家提供的说明进行，整个 过程使用PBST作为运行缓冲液。加入生物素化的MART-1-HLA-A2复合物，同时将生物素化 的gpl00-HLA-A2复合物加入另一通道，用来计算检测时的背景，复合物被固定的密度见图 5说明。MTlS设五个浓度梯度0. 125μΜ，0. 25 μ Μ，0. 5 μ Μ，1 μ Μ，2 μ Μ，由低向高流过芯片， 两个浓度之间用IOmM硼酸盐缓冲液(ΡΗ8. 5，含IM NaOH和0. 1% Tween-20)再生HLA-A2 复合物表面。15nM的MT1C0MP被用于分析芯片中固定低密度(1000RU)和饱和(3000RU) HLA-A2复合物两种情况时的亲和力.所得数据用随机附带软件分析得出平衡常数(Kd)。分析COMP基序介导的MTl五聚化，是否提高了其亲和力，通过BIACORE分析获知 MTlS和MT1C0MP针对抗原的亲和力。MTlS特异结合其抗原MART-1-HLA-A2复合物的平衡 常数为1. 48 μ M(见图5A)。MT1C0MP特异结合MART-1-HLA-A2复合物(1000RU)后，解离缓 慢，选取解离曲线中两段，计算瞬时观察到的平衡常数分别为419pm和34. 8pm(见图5B)。 当MT1C0MP与过量的MART-1-HLA-A2复合物结合后，解离更加缓慢，几乎无法检测到(见 图5C)。因此MT1C0MP与MART-1-HLA-A2复合物充分结合情况下，平衡常数绝对值应小于 34. 8pM，也就是说亲和力是单体MTlS的IO5倍以上。实施例4双特异性融合蛋白多聚体MCC的制备及其活性检测1、构建表达载体基因合成抗人⑶3单链抗体的DNA编码序列参照文献(Arakawa等，J Biochem, 1996，120，657-62)中所述的抗人 CD3 单链抗 体序列，按照文献(Young等，Nucl. Acids Res. 2004，32，e59)中所述方法，合成长度为50bp 的核苷酸片段，其中连接肽序列包含在轻链合成序列之中。相邻的正义和反义核苷酸链有 IObp的互补区域，通过DA-PCR、OE-PCR、Full-length-PCR三步分别合成该抗体的重链可变 区VH和轻链可变区VL，再通过合适的酶切位点将VH和VL连接成为单链抗体分子。所用酶 切位点 VH 5，为 BspEI, 3，% HindIII, VL 5，% HindIII, 3' % BamHI 以下为构建单链抗体所用的寡核苷酸片段VH ρ1AGTCTCCGGACAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACp2TAGCCAGAAGCCTTGCAGGACATCTTCACTGAGGCCCCAGGTCTTGCCAGp3CTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGp4TAGGATTAATGTATCCAATCCATTCCAGACCCTGTCCAGGCCTCTGTTTTp5ATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAp6GTAGGCTGTGCTGGAGGATTTGTCTGTAGTCAATGTGGCCTTGTCCTTGAp7CACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTp8TCAAGGCAGTAATGATCATCATAATATCTTGCACAGTAATAGACTGCAGAp9ACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCC
piOGAGAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGCTGAGGAGVL primerlGCTAAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTACAAATTGTTCprimer2TCCCCTGGAGATGCAGACATGATTGCTGGAGACTGGGTGAGAACAATTTGprimer3CTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTprimer4TGGGGGAGGTGCCTGACTTCTGCTGGTACCAGTTCATGTAACTTACACTTprimer5ACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGT
primer6GTAAGAGGTCCCAGACCCACTGCCCCTGAAGTGAGCAGGGACTCCAGAAGprimer7GACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCAprimer8AACGTGAATGGGTTACTACTCCACTGCTGGCAGTAATAAGTGGCAGCATCprimer9CATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGCTGATACTprimer1OACGTGGATCCAGTTGGTGCAGTATCAGCC划线部分为酶切位点。具体步骤如下IDA-PCR 重链和轻链均使用相同的方法由10条寡核苷酸链合成。此步骤合成四个片段，由invitrogen公司合成的引物用水溶解后至引物浓度为 100μΜο PCR在50 μ 1反应体系中进行。PCR所需其他试剂购自天根生化。外引物浓度为 内引物的5倍。各引物按照以下情况分组1-2-3-4，3-4-5-6，5-6-7-8，7-8-9-10。例如片段1合成时反应体系为IOXpfu buffer 5 μ 1, dNTP 4 μ 1, pfu 0. 5μ 1, H2O 28. 5 μ 1, primer 15μ 1, primer45 μ 1, primer 21 μ 1, primer 31 μ 1。反应条件94°C Imin94°C 20s, 45°C 30s，72°C 30s，20 循环72 °C 5min得到大约大小为170bp的DNA片段1。同样的方法得到片段2、3、4。20E-PCR各取以上DA-PCR产物20 μ 1，即总体积为80 μ 1，补加220 μ 1 H2O,总体积为 300 μ 1。用标准方法饱和酚氯仿抽提，氯仿重复抽提一次去除酚，最后用乙醇沉淀的方法收 集 DNA。所得 DNA 用 81 μ 1 H2O 溶解后，补加 IOXpfu buffer 10 μ l,dNTP 8μ l,pfu 1 μ 1, 总体积100 μ 1。进行以下反应94°C Imin94°C 20s,60°C, 30s, 72°C 90s，15 循环72 °C 5min可得相对完整的VH和VL序列。3Ful1-length PCR 取OE-PCR 产物 2 μ 1，加入 IOXpfu buffer 10 μ 1, pfu 1 μ 1，dNTP 8 μ 1，引物 1 20 μ 1，引物 10 20 μ 1，H2O 39 μ 1。总体系 100 μ 1。
反应条件94°C Imin94°C 20s,60°C, 30s, 72°C 90s，30 循环72 °C 5min琼脂糖凝胶电泳显示分别得到大小正确的VH和VL片段。测序与文献中所述 抗人CD3单链抗体有一个氨基酸的差异，即轻链N端第一位氨基酸由D突变成了 Q。双特异性抗体的原核及真核表达载体的构建VH以及VL分别通过BspEl，Hindi11和Hindi11，BamHI酶切过夜后用胶回收试剂 盒回收DNA片段。与用BspEI和BamHI酶切后的载体MT1C0MP连接。得到双特异性抗体 MCC的原核表达载体。通过SalI和NotI酶切位点以及以下两条引物smccsall和apefnotl (将抗体MCC 的编码序列以及其下游myc标签和his标签作为一个整体片段扩增得到)将MCC以及原核 载体上的myc标签和his标签克隆至PEF-Myc-ER(Invitrogen)，并在3’末端引入终止密码 子，最后得到MCC的真核表达载体PEF-MCC。具体构建过程如下首先通过PCR扩增一个完整的长片段，该片段包括SalI和NotI酶切位点，MCC抗 体基因，myc标签，his标签和3’末端的终止密码子引物smccsall :ACGCGTCGACGATGTGCAGCTGCAGGCGapefnotl :AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGGTTCAGATC模板上一步骤构建的MCC的原核表达载体反应体系10Xpfu buffer 10 μ 1, pfu 1 μ 1, dNTP 8 μ 1，smccsall 20 μ 1, apefnotl 20 μ1 μ 1, H2O 40 μ 1。反应程序94°C5min ；94°C 30s，60°C，30s，72°C 2min，30 循环；72°C IOmin0然后用Sail和NotI分别过夜酶切PCR产物和表达载体PEF-Myc_ER，胶回收试剂 盒回收DNA片段，连接酶切片段可得MCC的真核表达载体PEF-MCC。2、转化宿主并表达抗体293T细胞生长至密度为80%左右时，倒去培养基，于IOcm皿中加入无血清的DMEM 6ml，取20 μ g PEF-MCC质粒溶于250 μ 1 H2O中，与250 μ 1 0. 5Μ Cacl2混合，然后慢慢滴 Λ 500 μ 1 2 XHepes (0. 05Μ H印es，0.28M Nacl, 1. 5mM Na2HPO4, pH 7· 00)缓冲液中，同时剧 烈振荡混合，静置15分钟后，振荡几秒钟，然后加入培养皿中，轻轻混合，细胞放入培养箱 培养。4小时后将培养液换成D10(DMEM，补加抗生素及10%小牛血清)。48小时后收取细 胞，先用 PBS 缓冲液洗一次，裂解液(50mM Tris-Cl, 500mM NaCl, 1% NP40, ImM PMSF, 1 μ g/ ml Ieup印tin，1 μ g/mlp印statin，pH 8.0)重悬至细胞密度约为106/ml。冰上放置30min 后，超声继续破碎细胞。13000rpm，20min离心，取上清，金属离子亲和层析法纯化蛋白。将 在100mM、200mM、500mM咪唑下洗脱的蛋白收集，并过夜透析将其溶解缓冲液换成PBS，离心 去沉淀后，浓缩，并做western blot检测，一抗为抗myc (北京表源生物技术有限公司)，二 抗为HRP-羊抗鼠抗体。结果如图7所示，瞬时转染真核表达载体pEF-MCC于293T细胞后，MCC得到表达，可以通过western blot检测到。并且采用不加DTT的上样缓冲液处理样品，可以检测到多聚的MCC。3、体外杀伤实验取1000万T2细胞，PBS洗一次，200 μ 1 PBS悬起细胞。准备CFSE溶液(取0.5 μ 1 5mM CFSE储存液加入1. 25ml HBSS中)，取200 μ 1 CFSE溶液加入Τ2中，37度染10分钟， 加500 μ 1小牛血清中止反应一分钟。HBSS洗一次细胞。RlO悬起Τ2至浓度为200万每毫 升，然后加入多肽MART-I (终浓度为20 μ Μ)刺激，37度培养4小时。将0ΚΤ3及IL2刺激后的PBMC (外周血单核细胞)用R10(RPMI 1640，补加抗生素 及10%小牛血清)悬起，按合适效靶比(E T)取PBMC加入96孔板中，靶细胞(上述以 多肽刺激的T2)固定为1万个每孔。效应细胞，靶细胞和抗体(MCC或者对照)在孔中共孵 育，以RlO将反应体积补至200 μ 1。实验分别按两种方案进行一种是设计不同的效靶比， 实验组每孔加入约2ng MCC抗体，对照组以PBS，IOOng MT1C0MP或IOOng MTlS代替MCC ； 另一种是固定效靶比为10，加入不同浓度的MCC。37度孵育4小时。以1 μ g/ml PI染细胞，冰上3分钟后，FACS分析杀伤情况。死亡率(％ ) = CFSE 与PI双染的细胞数/CFSE阳性的细胞数X 100。结果如图8所示。由A图可知，与对照组相比，MCC在体外可以有效介导0KT3和 IL2刺激后的PBMC杀伤细胞表面含有MART-1-HLA-A2复合物的T2。由B图可知，随着MCC 浓度的增加，其介导的杀伤作用同时亦递增。实施例5gpa7C0MP多聚体的制备及其检测gpa7C0MP的获得采用与MT1C0MP相同的策略，只是抗体为抗黑色素瘤抗原gplOO。FACS分析gpa7C0MP对于细胞表面的gp 100-HLA-A2复合物的识别。T2于RlO (补充10% FBS，谷酰胺，青霉素/链霉素的RPMI 1640介质)中传代培 养，实验时，700rpm, 3min离心收取细胞，加适量RlO悬起浓度为2 X 106/ml，加入肽gplOO、 CMV 和 HBV (终浓度为 20 μ M)，37°C，4h。SB(染色缓冲液，PBS+0. 5%BSA+2mM EDTA)洗细胞两次，并悬至浓度为5 X 106/ml。 加入gpa7C0MP(10y g/ml)作为一抗，30min，冰上。SB洗后，加入抗c_myc作为二抗，30min， 冰上。SB洗后，加入羊抗鼠-FITC作为三抗，30min，冰上。SB洗后，进行FACS分析。FACS 结果用flow jo软件处理。结果如图9所示，由FACS结果可知，gpa7C0MP特异识别结合gplOO多肽刺激的T2， 不识别CMV和HBV多肽刺激的T2。实施例6E2C0MP蛋白多聚体的制备及其检测E2C0MP的获得采用与实施例1中MT1C0MP相同的策略，只是抗体为抗EGFR。FACS分析E2C0MP对于结肠癌细胞系colon205的结合情况SB(染色缓冲液，PBS+0. 5%BSA+2mM EDTA)洗细胞两次，并悬至浓度为5 X 106/ml。 加入E2C0MP (10 μ g/ml)作为一抗，30min,冰上。SB洗后，加入抗c_myc作为二抗，30min,冰 上。SB洗后，加入羊抗鼠-FITC作为三抗，30min，冰上。SB洗后，进行FACS分析。对照仅 加抗c-myc和羊抗鼠-FITC。FACS结果用flowjo软件处理。结果如图10所示，由FACS结果可知，E2C0MP可以结合结肠癌细胞系cOlOn205。实施例7E2C0MP蛋白多聚体抑制人表皮样癌细胞系A431增殖实验使用Cell Counting Kit_8(CCK_8，日本同仁化学研究所)检测细胞数量的变化。
在96孔板中接种100 μ 1人表皮样癌细胞系A431细胞悬液(细胞培养基为含2ng/ ml表皮细胞生长因子的D10)，每孔1万个，空白孔仅含有细胞培养基。将培养板在培养箱 预培养24小时。将培养基换成新鲜的含有2 μ g/ml丝裂霉素C(本实验中用作阳性对照) 或者100 μ g/ml E2C0MP的细胞培养基，同时设置一组不添加以上两种药物的阴性对照孔。 继续孵育48小时。向每孔加入IOylCCK-S溶液。将培养板在培养箱内孵育4小时。用酶 标仪测定在450nm处的吸光度(A450)。药物对A431增殖的抑制率按以下公式计算抑制率 (%)=(药物组OD45tl-空白组0D45Q)/(阴性对照组OD45tl-空白组OD450) X 100。结果如图11所示，由图可知，E2C0MP蛋白多聚体可在一定程度上抑制人表皮样癌 细胞系A431的增殖，抑制率约为20%。序列表说明SEQ ID No. 1&2是抗黑色素瘤抗原MART-I基因及其蛋白序列，SEQ ID No. 3&4是 抗黑色素瘤抗原gpioo基因及其蛋白序列，SEQ ID No. 5&6是抗CEA-6基因及其蛋白序列， SEQ IDNo. 7&8是抗EGFR基因及其蛋白序列，SEQ ID No. 9&10是抗VEGFR基因及其蛋白序 列，SEQID No. 11&12 是抗 CD3 基因及其蛋白序列，SEQ ID No. 13&14 是 mTNF α 的 ΑΑ80-235 基因及其蛋白序列，SEQ ID No. 15&16是hACRP30的AA16-108基因及其蛋白序列，SEQ ID No. 17&18 是 P53 的 AA319-360 基因及其蛋白序列，SE Q ID No. 19&20 是 COMP 的 AA29-76 基 因及其蛋白序列，SEQ ID No. 21&22是C4BPa链C末端(AA541-597)基因及其蛋白序列， SEQ ID No. 23&24是用于扩增MTl的基因片段的引物，SEQ ID No. 25&26是用于扩增COMP 片段的引物，SEQ IDNo. 27&28是引物ABF和ABR ;SEQ ID No. 29 48合成抗人CD3单链抗 体的 DNA 的引物；SEQID No. 49 50 是引物 smccsall、apefnotl。
权利要求
一种融合蛋白多聚体，其特征在于，组成融合蛋白多聚体的融合蛋白是由成分A和成分B构成，其中成分A是单区抗体，成分B是将融合蛋白多聚化的来源于TNFα、ACRP30、P53、COMP和C4BP蛋白及其突变体的多肽序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白多聚体，其特征在于，所述单区抗体来源于抗体的重 链可变区或者轻链可变区。
3.如权利要求1所述的融合蛋白多聚体，其特征在于，所述单区抗体来源于骆驼科动 物体内重链抗体或者软骨鱼体内Ig-NAR抗体的可变区，或者来源于人体内抗体的可变区。
4.如权利要求1所述的融合蛋白多聚体，其特征在于，所述单区抗体是黑色素瘤抗原 MART-1抗体、黑色素瘤抗原gplOO抗体、CEA-6抗体、EGFR抗体或者VEGFR抗体。
5.如权利要求4所述的融合蛋白多聚体，其特征在于，所述融合蛋白还包括抗人CD3单 链抗体。
6.如权利要求5所述的融合蛋白多聚体，其为MCC融合蛋白多聚体。
7.如权利要求1-6任一项所述的融合蛋白多聚体，其特征在于，所述成分B选自TNFa 的 AA80-235、ACRP30 的 AA16_108、P53 的 AA319-360、C0MP 的 AA29-76 和 C4BP a 链 C 末端 AA541-597。
8.—种DNA序列，其特征在于所述DNA序列编码组成权利要求1_7之任一所述融合蛋 白多聚体的融合蛋白。
9.一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含权利要求8所述的DNA序列。
10.一种宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞被权利要求9所述的表达载体转染。
全文摘要
本发明涉及一种融合蛋白多聚体。该融合蛋白多聚体是由成分A和成分B构成，其中成分A是单区抗体，成分B是将融合蛋白多聚化的来源于TNFα、ACRP30、P53、COMP和C4BP蛋白及其突变体的多肽序列。本发明融合蛋白多聚体，可以在大肠杆菌中成功表达，表达量高，其制备相对简单，成本低；本发明多聚抗体具有良好的可溶性和生物活性，并且大大提高了抗体蛋白的亲和力。本发明融合蛋白多聚体可以制成各种生物技术产品，例如制成诊断试剂，用于诸如黑色素瘤的诊断，用该蛋白多聚体携带治疗药物，用于诸如黑色素瘤的靶向治疗等。基于本发明设计的多聚抗体用于临床时，应当可以避免强免疫原性的问题。
文档编号C12N15/63GK101830986SQ20101012268
公开日2010年9月15日 申请日期2010年3月2日 优先权日2010年3月2日
发明者刘小立, 孙美艺, 朱学锴 申请人:北京表源生物技术有限公司