专利名称：：转基因抗虫棉gk12的转化体特异性pcr检测方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
。特别是涉及一种鉴别转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR方法及其依赖的转化体特异性序列。
背景技术：
：我国是转基因作物的主要种植国家之一，2009年种植面积位于全球第六位。我国已经批准商业化种植的转基因作物包括转基因抗虫棉花、抗木瓜环斑病毒的转基因番木瓜等。其中，转Bt基因抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2009年种植面积达370万公顷，占我国棉花种植总面积的近70%。我国目前广泛种植的转基因抗虫棉中，以Monsanto公司的M0N531转化体(如新棉33B等)和中国农业科学院生物技术研究所研制的国抗系列(如GK12等)为两大重要的主栽品系。目前M0N531的转化体特异性序列和转化体特异性检测方法已经有报道，但国抗系列的代表品系之一GK12的转化体特异性序列和转化体特异性检测方法尚未见报道。目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类一、筛选检测，以转基因通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异性检测，以转化体特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。
发明内容针对上述领域中的空白，本发明提供了转基因抗虫棉GK12的转化体特异性序列以及鉴别GK12的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转基因抗虫棉GK12，以及以GK12为亲本的棉花品系。转基因抗虫棉GK12转化体特异性序列，如SeqIDNo.1所示，其中转化载体序列位于l-546bp，棉花基因组序列位于547-1625bp。转基因棉GK12的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的正向引物依据SEQIDNOl中1-546位序列设计，反向引物依据SEQIDNOl的547-1625位序列设计。根据权利要求1所述的PCR检测方法，所述正向引物为GK12-F:5'-CCGCAATGTGTTGTTAAGT-3'，所述反向引物为GK12-R:5'-TTCCCACATGGCCAAAAG-3'。本发明提供的转基因抗虫棉GK12的转化体特异性序列以及依赖其建立的转化体特异性PCR方法可作为一种鉴定转基因抗虫棉品系GK12，以及以这个品种为亲本的转基因棉品系的有效手段，由于转基因抗虫棉GK12是我国目前广泛种植的转基因抗虫棉品系之一，因此本发明为特异性鉴定转基因抗虫棉GK12提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。图1转基因抗虫棉GK12转化体特异性序列的GenomeWalking扩增A:第一次Walking结果；B:第二次Walking结果M:DNAMarkerDL2000;1-8:DL1-DL8的Walking产物图2转基因棉GK12转化体特异性PCR检测结果M:DNAMarkerDL2000;1:GK12，2_11:10个市场棉花样品具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。实施例l转基因抗虫棉GK12转化体特异性序列的克隆l实验材料1.1植物材料转基因抗虫棉GK12，本实验室有保存，可向公众发放。1.2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。1.3实验仪器PCR扩增仪Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA测序仪(A卯liedBiosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2.1棉花基因组DNA提取与检测2.1.1棉花基因组DNA提取取子叶期的幼嫩棉花叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。2.1.2DNA检测取5iU提取的DNA溶液，以O.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。2.2Genomewalking分离转基因抗虫棉GK12的转化体特异性序列Genomewalking也是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，主要步骤为基因组DNA酶切、与接头连接、两次巢式PCR扩增等。本实施例采用Genomewalking的方法获得了转基因抗虫棉GK12的转化体特异性序列。具体步骤参照GenomeWalkerUniversalKit(Takara大连公司)试剂盒说明，本实施例进行了部分改进，主要操作步骤如下。2.2.1基因组DNA酶切分别用DraI、StuI、Pvu11、EcoRV、NruI、PmacI、ScaI禾PSmaI酶切GK12基因组DNA，标记为DL1DL8。酶切体系为基因组DNA(O.1yg/yL)，25yL;10X酶切Buffer,lOiiL;内切酶(10U/iiL)，8iiL;ddH20，57iiL;总体积100iiL。37。C温浴2h，取出离心管，低速离心510s，继续温浴1618h。各取5iiL进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全。2.2.2纯化酶切产物按回收试剂盒说明书纯化酶切产物。2.2.3连接反应连接反应体系纯化的酶切产物，4iiL;接头(25iiM)，1.9iiL;10X连接Buffer,1.6iiL;T4DNA连接酶(6U/iiL)，0.5iiL;ddH20，8iiL;总体积16iiL。混合反应液，16t:温浴过夜，然后7(TC变性5min。每管加入72yLddH20，混匀，-2(TC保存备用。2.2.4PCR反应GenomeWalking共需要两轮PCR反应，其PCR的反应体系见表1。表1反应体系(iiL)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>两轮PCR扩增的程序见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2Ge謹eWalking扩增程序2.2.5序列测定和分析PCR扩增产物在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收扩增片段，连接到pGEM-Teasy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer进行序列测定。采用软件vectorNTIlO.0(Invitrogen)对测定的序列进行拼接和分析。在NCBI数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的基因组序列。3实验结果3.1转基因抗虫棉GK12转化体特异性序列测定经过两次GenomeWalking获得转基因抗虫棉GK12的转化体特异性序列。第一次GenomeWalking以引物GW1-P1和GW1-P2(表3)分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，结果获得639bp的扩增产物(图1A)。第二次GenomeWalking以第一次产物序列为基础设计引物GW2-P1和GW2-P2(表3)，分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，结果获得1115bp的扩增产物(图2A)。表3GenomeWalking引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>547-1625bp为棉花基因组序列。实施例2本发明的转化体特异性PCR方法应用于鉴别转基因抗虫棉GK121实验材料1.1植物材料转基因抗虫棉GK1210个棉花材料，购自市场。1.2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。1.3实验仪器PCR扩增仪Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2.1棉花基因组DNA提取与检测见实施例1中2.1棉花基因组DNA提取与检测。2.2鉴别转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR方法本发明的PCR方法应用于鉴别棉花样品中是否含有转基因抗虫棉品系GK12。采用引物GK12-F/GK12-R组合(序列见表4)，检测购自市场的10个棉花样品，见图2。实验结果表明，转基因抗虫棉GK12能特异性扩增出150bp的产物，检测的10个市场样品中有1个也能扩增出相同大小的片段。分别克隆GK12和能扩增出150bp的市场样品的扩增片段，按实施例1中"2.2.5序列测定和分析"进行序列分析。序列分析结果表明，市场样品的扩增片段序列与GK12的扩增序列完全一致，也均与序列SEQIDN01的491-640位完全一致。检测结果表明本发明提供的PCR方法能很好地鉴别出棉花样品中是否含有转基因抗虫棉GK12。PCR反应体系为0.25iiLrTaq(5U/iiL)，5iiL10XPCRBuffer(Mg2+Plus)，4iiLdNTP(各2.5mM)，引物各2yL(10yM)，模板各2yL(20ng/yL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50iiL。扩增程序为94°C预变性4min;94°C变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸30sec，35个循环；72。C10min。表4鉴别转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR引物7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的正向引物依据SEQIDNO1中1-546位序列设计，反向引物依据SEQIDNO1的547-1625位序列设计。2.根据权利要求1所述的PCR检测方法，所述正向引物为GK12-F:5'CCGCAATGTGTTGTTAAGT-3'，所述反向引物为GK12-R:5'TTCCCACATGGCCAAAAG-3'。全文摘要本发明涉及“转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR检测方法”，属于生物
技术领域：
。转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的正向引物依据SEQIDNO1中1-546位序列设计，反向引物依据SEQIDNO1的547-1625位序列设计。本发明方法可作为一种鉴定转基因抗虫棉品系GK12，以及以这个品种为亲本的转基因棉品系的有效手段。本发明方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。文档编号C12Q1/68GK101792814SQ20101014393公开日2010年8月4日申请日期2010年4月7日优先权日2010年4月7日发明者孙爻,张永军,彭于发,王奕海,谢家建申请人:中国农业科学院植物保护研究所