专利名称：检测人乳头瘤病毒的基因芯片及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种含有人乳头瘤病毒(HPV)各亚型探针的基因芯片，本发明还涉及一种用于HPV检测及分型的试剂盒。
背景技术：
全球每年约有51万名妇女被诊断为宫颈癌，其是仅次于乳腺癌的人类第二大妇 科恶性肿瘤，并且其发病现在呈年轻化趋势。在国内，每年新增宫颈癌病例约13. 5万，占全 球发病数量的1/3，约有8万人因此病死亡。研究发现90%以上的宫颈癌患者伴有人乳头瘤 病毒(human papillomaviruses, HPV)感染。宫颈癌及其癌前病变的发生是多种因素协同 作用的结果，高危型HPV感染时宫颈癌演变的始动因素，而HPV与宿主染色体的整合则是推 动宫颈癌变进展的重要事件。因此检测宫颈病变中HPV感染及整合情况，有利于早期发现、 早期诊断宫颈癌及癌前病变；及时治疗控制HPV感染，可预防宫颈内瘤变发生，能有效降低 宫颈癌的发病率和死亡率，对宫颈癌的防治有极大的临床价值。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒。人类是HPV 的唯一宿主，它定向感染人体皮肤及粘膜的复层鳞状上皮内，具有高度的宿主特异亲和力。国际癌症研究中心(IARC)专题讨论会(1995年)明确提出，HPV感染是宫颈癌的 主要病因。目前鉴定出HPV亚型100余种，其中30余种与宫颈感染和病变有关，根据其致病 力的大小分为高危型和低危型两种将HPV6、11、40、42等归为低危型，主要引起生殖道、肛 周皮肤和阴道下部的外生殖性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤变(CIN I)；高危型主要为 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 等，主要导致高 度子宫颈上皮内瘤变(CIN II、CIN III)和宫颈癌的发生，尤其是HPV16和18型。因此，检 测出样本中的具体HPV亚型对于宫颈癌的防治具有重要的指导意义。HPV病毒无法在体外培养，在体内也不能被诱导出易于检测的免疫反应，因此无法 采用血清学检测的方法对其进行诊断和分型。早期HPV的诊断主要是根据典型的临床表现 和肉眼可见的尖锐湿疣；或是根据细胞学或病理学特征性改变来判断，包括巴氏涂片(Pap Smear)和液基薄层细胞检测(TCT)，但常会出现一种未确定意义的非典型鳞状上皮细胞 (ASCUS)，常可掩盖一部分有意义的组织病理学异常而出现假阴性结果，需结合分子生物学 技术进行确诊。近年来各种分子生物学技术广泛应用为检测病毒基因组的诊断技术，其中普通及 荧光PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，但是由于其高灵敏度，容易因非特异性扩 增而出现假阳性，并且由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。HC2则是目前唯一获得 美国FDA批准的，可以应用于临床的诊断方法。但该方法只能检测出样本中是否有HPV的 感染，不能鉴定出具体的HPV病毒亚型，不利于临床跟踪检查和治疗。高危型HPV DNA整合到宿主基因组将导致宿主细胞产生包括抑癌基因功能缺陷、 激活癌基因、基因组不稳定性和细胞永生化等一系列不可逆的链式反应，是宫颈癌变的重 要机制之一，其警示价值高于目前的一般HPV-DNA感染检测，但目前市售的试剂盒所采用的探针均缺少针对HPV整合情况的检测，此外目前已有的HPV检测膜条并未明确分区检测 HPV，对于普通临床医生容易误诊，本发明针对以上2种对临床有重要意义的指标进行了检 测和改进，使得临床HPV感染的检测更丰富，更精确，更实用，更有价值。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种可用于检测27种HPV亚型与人染色体整合状态的基因芯片一种检测人乳头瘤病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳 头瘤病毒检测探针，其特征在于，所述检测探针包括SEQ ID No. 9-37的核苷酸序列HPV6 5' -AACTACATCTTCCACATACAC-3，(SEQ ID No. 9)HPVll :5，-GTCTAAATCTGCTACATACAC-3，(SEQ ID No. 10)HPV16 :5，-ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3，(SEQ ID No. 11)HPV18 :5，-ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3，(SEQ ID No. 12)HPV31 :5，-CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3，(SEQ ID No. 13)HPV33 :5，-GTACTAATATGACTTTATGC-3，(SEQ ID No. 14)HPV35 :5，-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3，(SEQ ID No. 15)HPV39 :5，-TATAGAGTCTTCCATACCT-3，(SEQ ID No. 16)HPV40 :5，-CCCCACACCAACCCCATATAA-3，(SEQ ID No. 17)HPV42 :5，-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3，(SEQ ID No. 18)HPV43 :5，-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3，(SEQ ID No. 19)HPV44 5' -CTACACAGTCCCCTCC-3，(SEQ ID No. 20)HPV45 5' -CTCTACACAAAATCCTGTG-3，(SEQ ID No. 21)HPV51 :5，-CTGCTGCGGTTTCC-3，(SEQ ID No. 22)HPV52 :5，-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3(SEQ ID No. 23)HPV53 5' -CGCAACCACACAGTCTATG-3，(SEQ ID No. 24)HPV54 5' -ACAGCATCCACGCAGG-3，(SEQ ID No. 25)HPV56 5' -CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3，(SEQ ID No. 26)HPV58 :5，-CACTGAAGTAACTAAGG-3，(SEQ ID No. 27)HPV59 5' -TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3，(SEQ ID No. 28)HPV66 :5，-TAATGCAGCTAAAAGC-3，(SEQ ID No. 29)HPV68 5' -TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3，(SEQ ID No. 30)HPV70 5' -AACGGCCATACCTGCTGTATAT-3，(SEQ ID No. 31)HPV73 5' -TAGGTACACAGGCTAGTAG-3，(SEQ ID No. 32)HPV83 5' -GCTACACAGGCTAATGAATACACA-3，(SEQ ID No. 33)HPVmm4 5' -CACTGCTGTTACTCAATCTG-3，(SEQ ID No. 34)HPVCP8304 5' -GCTACATCTGCTGCT-3，(SEQ ID No. 35)GP :5，-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3，(SEQ ID No. 36)ALU 5' -AGCTACTCGGGAGGCTGAGGC-3，(SEQ ID No. 37)进一步地，所述固相载体优选为尼龙膜；所述检测探针的3’端具有氨基标记。
本发明的HPV常见亚型的特异性探针的设计是根据HPV Ll区域，针对不同的亚型 设计的与HPV DNA互补的核苷酸序列的检测探针(SEQ ID No. 9-35)。上述的27种HPV亚 型特异性探针，对应包括了 22种高危及中危型HPV，5种低危型HPV和2种高危型HPV整合 (HPV16/HPV18)。SEQ ID No. 36是针对人GAPDH基因的探针，由于该类引物对HPV的检测、特别是对 多亚型感染的检测比较敏感，提高了 HPV检测的准确性。本发明中探针为3'氨基修饰探针(C7)，较5’氨基修饰探针能得到更好的杂交效^ ο本发明中27种探针的Tm在42°C _55°C之间，相对比较均一，即27种亚型探针和对应的PCR产物杂交时最佳温度条件基本一致，有利于在同一杂交温度下以相近的效率同 步结合，使检查的准确性大大增加。在本发明的实施方案中，可以用一条窄线代替了一般采用的原点的点探针的方 式，使得单位面积上的所载有的信息量大大增加。本发明的基因芯片用以下方法制备而成(I)DNA探针的制备合成与HPV DNA互补的3，末端经过氨基化的DNA片段；从 HPV DNA的Ll区域中挑选出特定的序列，根据碱基互补特点，设计并合成出3’末端经过氨 基化的DNA片段；(2)固定探针将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上；先对尼龙膜进行活化 处理，然后将探针划在膜上，通过探针末端的氨基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固的 将探针固定在膜上；(3)制备基因芯片利用NaOH停止反应，封闭未结合探针的表面负电荷基团，制得 基因芯片。本发明还提供了一种快速、高通量的检测样本中HPV各亚型的检测试剂盒，包括(i)基因芯片，固定于其上的检测探针为SEQ ID No. 9-37的核苷酸序列；(ii)检测用引物序列，用于扩增临床样本中的人乳头瘤病毒DNA序列，所述的引 物序列为Gl :5，-CARGGACATAAYAATGGYATTTGCTG-3，(SEQ ID No. 1)G2 5' -CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3，(SEQ ID No. 2)G3 5' -GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3，(SEQ ID No. 3)G4 5' -GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3，(SEQ ID No. 4)16:5，-CATGCGGGTGGTCAGGTAATAT-3，(SEQ ID No. 5)18:5，-CATTTTGGGAATAATGTAATTGATTGT-3，(SEQ ID No. 6)(iii)用于扩增临床样本中的人GAPDH基因，末端标记有生物素，其引物序列为GPl :5，-GCTTCTCTGCTGTAGGCTCATT-3，(SEQ ID No. 7)GP2 5' -GTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3，(SEQ ID No. 8)(iv)人乳头瘤病毒专用裂解液，其成分为20mmol/TriS.HCL pH8.0,0. 5 % Triton-X-100,10% chelex-100 ；(ν) PCR 反应液；(vi)显色试剂。
进一步地，所述检测用引物序列的5’和3’端均带有生物素标记；所述PCR反应 液包括2X PCR Mix,20mM Tris-HCl (pH8. 9), 50mM KCl,3mM MgCl2,0. 4mM dNTPs, ImM DTT, 10% glycerol, 0. 16% NP-40,0. ImM Tween-20, 50U/mlTaq DNA polymerase。本发明的HPV检测试剂盒中，HPV16/18与染色体整合扩增的引物为SEQ IDNo. 5-6，可检测2种高危型HPV整合情况。本发明的阳性对照为人GAPDH，其扩增引物为SEQ ID No. 7_8，与HPV同时扩增，同 时检测。利用本发明所述的HPV检测试剂盒检测HPV感染，具体步骤如下(1)扩增样品将临床样本中提取的DNA通过HPV基因分型检测试剂盒进行扩增， 所用引物的5’和3’端均标记有生物素，扩增得到5’和3’端均带有生物素标记的DNA产 物；
(2)杂交将上述扩增得到的DNA与基因芯片上分布的DNA探针进行反应；(3)显色滴加显色试剂，肉眼直接观察结果。本发明的用于检测HPV的试剂盒能够快速、准确的检测出HPV感染及鉴定具体的 亚型，操作简单，灵敏度高，对于宫颈癌的早期诊断、预防、治疗和术后跟踪具有重大意义。
图1是使用本发明的HPV检测试剂盒检测临床样本的结果图。
具体实施例方式实施例1 基因芯片的制备根据世界范围内的HPV感染研究结果和国内的实际HPV感染情况，选出27种HPV 亚型，包括22种高危型及中危型HPV，5种低危型HPV和2种整合型(16/18型)。针对每种 HPV亚型，设计合成3’端带有氨基的特异性探针(SEQID No. 9_37)。将膜条按要求裁剪；浸泡于新鲜配制的EDAC溶液中30min ；用蒸馏水洗膜3次， 2min/次，在滤纸上晾干，将膜片固定在滤纸上；按照膜上的格子按顺序每格划探针3次；点 好的膜于室温放置20min晾干；用0. 5N NaOH浸泡膜条5min ；弃去NaOH，用蒸馏水洗涤3 次，2min/次；充分晾干后，干燥瓶内保存备用。实施例2 样品制备采用煮沸法制备和纯化临床样本中的DNA。PCR反应体系为20ul，具体配方如下2X PCR Mix10 μ 1Plus solution2μ 1
SeqNo. 1-2 (IOOuM) 0. 03 μ 1SeqNo. 2-4 (IOOuM) 0. 03 μ 1SeqNo. 5-6 (IOOuM) 0. 03 μ 1去离子水5. 91 μ 1模板 DNA2ul每次实验设立一个阴性对照，即以2ul无菌水为模板。
按以下条件进行扩增Stagel -MV 3minStage2 :94°C 20s51°C Imin72°C 30s40cyclesStage3 :72°C 2min实施例3 :HPV DNA检测将实施例2中扩增得到的DNA样品用实施例1中制备的基因芯片进行杂交反应， 最后根据显色情况进行判读，有显色的位置表示相应的HPV亚型。1、杂交取5ml离心管，标明患者编号，放入同样标有患者编号的膜条，加入3ml杂交液 (0. 3mol/L NaCl，IOmmol/L NaH2PO4, 2mmol/L EDTA，0. 1% SDS, ρΗ7· 4)及 PCR 产物，沸水浴 IOmin ；51°C 杂交 lh。取50ml离心管，加入40ml B液预热至51 "C。对照取IOul PC加入阴性对照的杂交管中进行杂交，方法同上。2、洗膜取出膜条，移至装有预热洗膜液(75mmol/LNaCl, 2. 5mmol/L NaH2PO4,0. 5mmol/L EDTA，0. 1% SDS, ρΗ7· 4)的50ml离心管中，于51°C轻摇洗涤15min (每管40ml溶液，最多 可同时洗涤5张膜)。3、显色用杂交液配制1 2000的POD (过氧化物酶)溶液(五张膜条可用6ul POD母液， 配制成12ml使用液)，室温轻摇浸泡30min，弃去POD溶液。用杂交液室温轻摇洗涤2次， 5min/次。用0. lmol/L柠檬酸钠室温洗膜l-2min,同时新鲜配制显色液(19ml 0. lmol/L 柠檬酸钠，Iml TMB, IOul 3% H2O2)。将膜条浸泡于显色液中避光显色5min左右可见斑点 显现，将膜条浸泡于清水中结束显色反应，并于4°C保存。4、结果判读作为对照，在膜条的阳性质控PC位置会出现蓝色斑点，提示本次杂交、显色工作 正常，此次结果判读视为有效。结果见图1所示，阳性质控PC正常高危型HPV16/HPV33/低危型HPV42 整合型HPV1权利要求
一种检测人乳头瘤病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳头瘤病毒检测探针，其特征在于，所述检测探针包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列HPV65’-AACTACATCTTCCACATACAC-3’(SEQ ID No.9)HPV115’-GTCTAAATCTGCTACATACAC-3’(SEQ ID No.10)HPV165’-ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3’(SEQ ID No.11)HPV185’-ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3’(SEQ ID No.12)HPV315’-CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3’(SEQ ID No.13)HPV335’-GTACTAATATGACTTTATGC-3’(SEQ ID No.14)HPV355’-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3’(SEQ ID No.15)HPV395’-TATAGAGTCTTCCATACCT-3’(SEQ ID No.16)HPV405’-CCCCACACCAACCCCATATAA-3’(SEQ ID No.17)HPV425’-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3’(SEQ ID No.18)HPV435’-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3’(SEQ ID No.19)HPV445’-CTACACAGTCCCCTCC-3’(SEQ ID No.20)HPV455’-CTCTACACAAAATCCTGTG-3’(SEQ ID No.21)HPV515’-CTGCTGCGGTTTCC-3’(SEQ ID No.22)HPV525’-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3(SEQ ID No.23)HPV535’-CGCAACCACACAGTCTATG-3’(SEQ ID No.24)HPV545’-ACAGCATCCACGCAGG-3’(SEQ ID No.25)HPV565’-CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3’(SEQ ID No.26)HPV585’-CACTGAAGTAACTAAGG-3’(SEQ ID No.27)HPV595’-TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3’(SEQ ID No.28)HPV665’-TAATGCAGCTAAAAGC-3’(SEQ ID No.29)HPV685’-TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3’(SEQ ID No.30)HPV705’-AACGGCCATACCTGCTGTATAT-3’(SEQ ID No.31)HPV735’-TAGGTACACAGGCTAGTAG-3’(SEQ ID No.32)HPV835’-GCTACACAGGCTAATGAATACACA-3’(SEQ ID No.33)HPVmm45’-CACTGCTGTTACTCAATCTG-3’(SEQ ID No.34)HPVCP83045’-GCTACATCTGCTGCT-3’(SEQ ID No.35)GP5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3’(SEQ ID No.36)ALU5’-AGCTACTCGGGAGGCTGAGGC-3’(SEQ ID No.37)
2.如权利要求1所述的检测人乳头瘤病毒的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为 尼龙膜。
3.如权利要求2所述的检测人乳头瘤病毒的基因芯片，其特征在于，所述检测探针的 3’端具有氨基标记。
4.一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，包括 (i)如权利要求1-3之一所述的基因芯片；( )检测用引物序列，用于扩增临床样本中的人乳头瘤病毒DNA序列，所述的引物序 列为Gl :5’ -CARGGACATAAYAATGGYATTTGCTG-3，(SEQ ID No. 1) G2 :5’ -CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3，(SEQ ID No. 2) G3 5' -GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3，(SEQ ID No. 3) G4:5，-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3，(SEQ ID No. 4) 16 5' -CATGCGGGTGGTCAGGTAATAT-3，(SEQ ID No. 5) 18 5' -CATTTTGGGAATAATGTAATTGATTGT-3’ (SEQ ID No. 6)(iii)用于扩增临床样本中的人GAPDH基因，末端标记有生物素，其引物序列为 GPl :5，-GCTTCTCTGCTGTAGGCTCATT-3’ (SEQ ID No. 7)GP2 :5’ -GTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’ (SEQ ID No. 8)(iv)人乳头瘤病毒专用裂解液，其成分为20mmol/TriS.HCL pH8. 0,0.5 % Triton-X-100,10% chelex-100 ；(v)PCR反应液；(vi)显色试剂。
5.如权利要求4所述的用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测用引 物序列的5’和3’端均带有生物素标记。
6.如权利要求4所述的用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应 液包括2X PCR Mix,20mM Tris-HCl (pH8. 9), 50mM KCl,3mM MgCl2,0. 4mM dNTPs, ImM DTT, 10% glycerol, 0. 16% NP-40,0. ImM Tween-20, 50U/mlTaq DNA polymerase。
全文摘要
本发明公开了一种检测人乳头瘤病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳头瘤病毒检测探针，所述检测探针包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；本发明的27种HPV亚型特异性探针，对应包括了22种高危及中危型HPV，5种低危型HPV和2种高危型HPV整合(HPV16/HPV18)。本发明还公开了一种快速、高通量的检测样本中HPV各亚型的检测试剂盒，包括基因芯片，固定于其上的检测探针为SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；检测用引物序列，用于扩增临床样本中的人乳头瘤病毒DNA序列；用于扩增临床样本中的人GAPDH基因；人乳头瘤病毒专用裂解液；PCR反应液和显色试剂。本发明的HPV检测对于HPV的临床诊断和宫颈癌的早期预防、诊断、治疗和术后跟踪有重大意义。
文档编号C12Q1/70GK101818213SQ20101015198
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者方国伟, 石慧, 董正伟, 郭兴中, 郭尧 申请人:济南艾迪康医学检验中心有限公司