专利名称：菠萝中性转化酶基因Ac-NI1、其编码蛋白质以及其基因克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种基因技术，属于生物技术领域，具体涉及一种菠萝中性转化酶基 因Ac-Nil、其编码蛋白质以及其基因克隆方法。
背景技术：
转化酶的分子量大小在50kD至SOkD之间，为单体或二聚体，可分为酸性转化酶 (Al)和中性或碱性转化酶(Ni)，催化如下反应Suc+H20 —— Fru+Glu。NI大多被认为是 一种胞质酶，其最适PH值在7. 0左右，也可分为可溶性的和不溶性的两种，前者分布于细胞 质中，后者存在于细胞壁上(Lowell和Tomlinson，1989 ;Klann等，1996 ;Xu等，1995)。在 Lesculentum番茄果实液泡中有高活性的Ivr，所以液泡中积累了大量的果糖和葡萄糖， 蔗糖的含量很少。在L. perur和L. chmielewskii番茄果实中液泡Ivr活性极低，所以在液 泡中大量积累蔗糖，而果糖和葡萄糖的含量很少(D’ Aoust等，1999)。近年来研究表明，在 苹果(赵智中等，2001)、温州蜜柑(Beurter，1985)果实的发育早期蔗糖积累受Ivr影响较 大，幼果内蔗糖的积累与Ivr的活性呈显著负相关。‘纽荷尔’脐橙幼果中转化酶对糖的积 累影响较大(王利芬等，2004)。宁夏枸杞果实发育过程中，蔗糖的含量与3种代谢酶均无 显著相关性，己糖的积累与转化酶活性呈现极显著的正相关，SS和SPS与这几种糖均不存 在显著的相关性(郑国琦等，2008)。杨梅果实发育期间中，转化酶的变化与蔗糖积累呈负 相关(谢鸣等，2005)。可见，Ivr是蔗糖在这些果实内代谢的一个关键酶。目前已从葡萄、桃、樱桃、苹果、草莓、甘蔗、柑橘、甜瓜等作物中克隆到相应的转 化酶基因。在模式植物拟南芥中已分离出9个编码NI的基因(The Arabidopsis Genome Initiative2000)；在水稻中已分离出8个基因编码NI的基因(International Rice Genome Sequencing Project2005) 0从胡萝卜中克隆的NI的N_端无信号肽，富含半胱氨 酸，且与AI的同源性很低(Lee和Sturm，1996)。从桃中分离出的编码NI基因的cDNA，命 名为PpNIl，长为1578bp，与胡萝卜中的NI基因的同源性高达84%的，含有NI基因典型 的高保守盒，属于NI基因家族的α亚族(Nonis等，2007)。在甘蔗中分离出的编码NI的 SNI基因片段，含有1. 7kb的开放阅读框，编码572个氨基酸，分子量约为64. 3kDa，等电点 为8. 57 (Bosch等，2004)。从甜菜中分离NI的编码基因BVInv-N，含有特有的开放阅读框， 编码617个氨基酸，分子量为69. 5KDa，等电点为6. 84，在这个基因两端有两个特殊区域， 5'具有长为197bp的非编码区，而在3'除含有439bp的非编码区还有一个poly-A尾巴 (Maria-Cruz 等，2007)。转化酶基因的表达也呈现时空特异性。目前在桃、葡萄、日本梨、胡萝卜、甘蔗的等 作物中已有许多转化酶基因的相关报道，但在菠萝上未发现相关研究报道。为此，对菠萝中 性转化酶基因的克隆以及在不同发育时期的表达进行研究，将有助于弄清菠萝果实糖积累 的分子机理，同时获得可应用于菠萝果实品质改良的基因资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菠萝果实中性转化酶基因Ac-NIl的核苷酸序列，其 核苷酸序列如SEQ ID NO :1，含1034bp。本发明的另一个目的在于提供一种菠萝果实中性转化酶基因Ac-NIl编码的蛋白 序列，含345个氨基酸残基，含有植物中性转化酶结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2。同时，本发明还提供该中性转化酶基因Ac-NIl的克隆方法。本发明所提供的中性转化酶基因，来自菠萝(Ananas comosus)，命名为Ac-NIl基 因，核苷酸序列如SEQ ID NO =I0上述菠萝果实中性转化酶基因Ac-NIl编码的蛋白质，来自菠萝(Ananas comosus)，命名为Ac-NIl蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2。上述菠萝果实中性转化酶基因Ac-NIl的克隆方法，包括如下步骤(1)选用菠萝果实作为实验材料，采用改良SDS法提取菠萝果实中的总RNA，RNA含 量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；(2)以获得的总RNA为模板，采用Takara公司生产的mRNA Selective PCR Kit进 行反转录获得cDNA ；(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计菠萝Ac-NIl基因编码区引物正向引物5，-CAG(T/C)T(T/G/A)CAGAG(C/T)TGGGAGA-3，如SEQ ID NO 3反向引物5，-GTGTC(A/G)TA(A/C)TA(T/C)TCAGGCCA-3‘如SEQ ID NO 4用第一链反转录产物10 μ 1作为PCR的模板，反应体系为10XPCR Buffer II 2. 5 μ l,25mM MgCl2 1. 5μ IUOmM dNTP/analog Mixture 1 μ 1、ExTaq 0· 2 μ 1、上游引物 (20 μ Μ) 1 μ 1、下游引物(20 μ Μ) 1 μ 1、再补足Rnase Free H2O至总体积25 μ 1 ；扩增程序为 85°C变性 lmin，54°C复性 lmin，72°C延伸 2min，30 个循环后，72°C总延伸 IOmin0(4)PCR产物回收后与pGEM-T easy Vector连接，连接产物转化Ε· coli DH 5 α 感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得 Ac-NIl 基因。本发明的有益效果是本发明涉及一种菠萝果实中性转化酶基因Ac-NIl及其编码的蛋白质和该基因的 克隆方法。该基因来自菠萝(Ananas comosus)，因此该基因的大量表达，有利于果糖和葡萄 糖的积累，改变了果实中糖分的组成和比例，从而改变了果实的品质。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明做进一步详细的描述，这些实施例只用来说明本发 明，并不限制本发明的范围。菠萝果实中性转化酶基因Ac-NIl的分子克隆选用巴厘菠萝果实作为实验材料，提取果肉中的总RNA。以获得的总RNA为模 板，反转录合成cDNA。根据NCBI数据库中的EST信息设计菠萝Ac-NIl基因编码区引 物正向引物5，-CAG (T/C) T (T/G/A) CAGAG (C/T) TGGGAGA-3，，反向引物5，-GTGTC (A/G) TA (A/C) TA (T/C) TCAGGCCA-3，。采用 Takara 的 Ex-Taq 酶进行 PCR 扩增，PCR 产物回收后与 pGEM-Teasy (Promega)载体连接，连接产物转化Ε. coli DH 5 α感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得Ac-NIl基因。
以上所述，仅为本发明的较佳实例而已，并不用于限定本发明的保护范围。
权利要求
一种菠萝中性转化酶基因Ac NI1，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO1。
2.—种权利要求1所述菠萝中性转化酶基因Ac-NIl编码的蛋白质，其特征在于其氨 基酸序列如SEQ ID NO :2ο
3.—种权利要求1所述菠萝中性转化酶基因Ac-NIl的克隆方法，其特征在于包括如 下步骤(1)选用菠萝果实作为实验材料，采用改良SDS法提取菠萝果实中的总RNA，RNA含量 及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；(2)以获得的总RNA为模板，采用Takara公司生产的mRNASelective PCR Kit进行反 转录获得cDNA ；(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计菠萝Ac-NIl基因编码区引物正向引物5，-CAG(T/C)T(T/G/A)CAGAG(C/T)TGGGAGA-3‘反向引物5，-GTGTC(A/G)TA(A/C)TA(T/C)TCAGGCCA-3‘用第一链反转录产物IOy 1作为PCR的模板，反应体系为10XPCR Buffer II 2. 5 μ l,25mM MgCl2 1. 5μ IUOmM dNTP/analog Mixture 1 μ 1、ExTaq 0· 2 μ 1、上游引物 (20 μ Μ) 1 μ 1、下游引物(20 μ Μ) 1 μ 1、再补足Rnase Free H2O至总体积25 μ 1 ；扩增程序为 85°C变性 lmin，54°C复性 lmin，72°C延伸 2min，30 个循环后，72°C总延伸 IOmin ；(4)PCR产物回收后与pGEM-Teasy Vector连接，连接产物转化Ε. coli DH 5α感受态 细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得Ac-NIl 基因。
全文摘要
本发明涉及菠萝中性转化酶基因Ac-NI1，其核苷酸序列如SEQ ID NO1，一种菠萝中性转化酶基因Ac-NI1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO2，同时，本发明还涉及菠萝中性转化酶基因克隆方法采用改良SDS法提取菠萝果实中的总RNA，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；以获得的总RNA为模板，进行反转录获得cDNA；用第一链反转录产物10μl作为PCR的模板，扩增PCR，转化，筛选阳性克隆，经PCR进一步验证后测序，获得Ac-NI1基因；筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得Ac-NI1基因；菠萝果实中性转化酶基因的大量表达，有利于果糖和葡萄糖的积累，改变了果实中糖分的组成和比例，从而改变了果实的品质。
文档编号C12N15/10GK101899451SQ20101019667
公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者姚艳丽, 孙光明, 张秀梅, 杜丽清, 谢江辉 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所