专利名称：一种猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物传染病技术领域，具体涉及一种分泌核酸酶SsnA基因的分离和 克隆，将所述的基因通过大肠杆菌表达，获得重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/ PET28a-SsnA)，利用该菌株表达猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA，并建立酶联免疫吸附试验 (ELISA)鉴别诊断方法，用于区分猪链球菌2型灭活疫苗免疫猪与感染猪。本发明提供含有 猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA的表达质粒(pET_28a(+))、重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/PET28a-SsnA, SsnA蛋白的表达和纯化方法以及用该蛋白建立的可区分猪链球 菌2型灭活苗免疫猪血清和感染猪血清的鉴别诊断方法。
背景技术：
猪链球菌(Str印tococcus suis, S. suis)是引起猪链球菌病的主要病原，依据猪 链球菌表面的荚膜多糖(CPS)可以将S. SUiS分为35个血清型，分别为1/2型和1 34 型，但最近也有人提出32型和34型应该归于Str印tococcus orisratti，而不应该归于猪 链球菌。在猪链球菌35个血清型中，猪链球菌2型(SS2)是流行最广的病原(Hill J. et al.，2005)。该型亦是临床分离频率最高的血清型。SS2是一种重要的人畜共患病病原 体，能引起猪脑膜炎(meningitis)、心内膜炎(endocarditi)、败血症(s印ticemia)、关节 炎(arthritis)、浆膜炎(polyserositis)、肺炎(pneumonia)等，常引起断奶仔猪或育肥 猪突然死亡；人类感染该菌，可导致脑膜炎，引发永久性耳聋、败血症、心内膜炎，甚至死亡 (Vecht U et al.，1985 ；Clifton-Hadley FA, 1983 ；Gottschalk M et al. ,2000) 我国于 1991年在广东省首次报道了该病的发生。1998-1999年夏季在我国江苏省部分地区猪群中 暴发流行，并导致特定人群致死的疫病由猪链球菌2型所引起。2005年夏季，四川省多个地 区发生猪链球菌2型病疫情，造成500多头生猪死亡，人感染200多例，死亡30多例，进一 步证实该病已在我国开始广泛流行。由于对猪链球菌的致病机制还不清楚，无有效的检测和诊断方法，在很多国家猪 链球菌一直未得到有效的控制。特别是对猪链球菌抗体检测的方法国内外一直无商品化的 试剂盒，对于感染和免疫无法进行有效的区分。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目的是分离和克隆猪链球菌2 型分泌核酸酶SsnA基因片段。其第二个目的是利用所克隆的分泌核酸酶SsnA基因片段转 化大肠杆菌，获得一种能特异性表达该分泌核酸酶SsnA的重组大肠杆菌。本发明的第三个 目的是获得一种蛋白，为猪链球菌2型的检测诊断试剂盒和ELISA方法提供一种新抗原。本发明通过以下技术方案实现申请人:通过基因克隆方法，从猪链球菌2型中分离克隆得到一种分泌核酸酶SsnA 基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，序列长度为1131bp，其对应的氨基酸 序列如序列表SEQ ID NO :2所示，包含377个氨基酸。将所述的分泌核酸酶SsnA基因片
3段转化大肠杆菌，获得一种包含猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因并能表达该基因的重组 大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/PET28a_SsnA，将该重组大肠杆菌于2010年6月24日 送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为 CCTCC NO :M2010155o1、重组大肠杆菌的制备步骤1)以猪链球菌2型(Streptococcus suis2, SS2)基因组为模板，设计引物对，通 过PCR方法扩增得到猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因；该基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示；2)将猪链球菌2型分泌核酸酶基因SsnA基因插入原核表达载体pET_28a (+)(购 自Novagen公司)的BamHI和XhoI多克隆位点，构建得到中间表达质粒pET28a_SsnA ；3)将步骤2)的中间表达质粒pET28a-SsnA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用卡 那霉素抗性筛选单个重组大肠杆菌，经诱导(见后面的详细过程所述)得到特异性地表达 分泌核酸酶基因SsnA蛋白；其中步骤1)所述的引物对的DNA序列如下所示正向引物P15，-GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3，，反向引物P25，-TGGCTCGAGCATCTGGTGTGACAT-3，。2、猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA的表达及纯化步骤挑取单个重组大肠杆菌BL21/PET28a-SSnA菌落至LB培养基加卡那霉素至终浓 度50 μ g/mL, 37°C摇床培养12小时后放4°C冰箱过夜；用含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养 基将该菌液按1 100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37°C摇床培养至OD60(fe0.6,用 0. 8mmol/L的异丙基硫代- β _D_半乳糖苷进行诱导，每小时取样100 μ 1，诱导3_4小时后 进行SDS-PAGE电泳分析，诱导的菌体经离心、超声波破碎后取上清，经纯化、变性、复性等 处理后分装于-20°C保存备用。上述的猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因特异性蛋白可用于制备防制猪链球菌 2型的新兴抗原，药物，疫苗或诊断试剂盒的开发。更详细的技术方案如下所述1)、以猪链球菌2型基因组为模板，设计引物，通过PCR扩增得到SsnA基因片段， 经测序确定该SsnA基因片段的DNA序列如序列表SEQ ID N0:1所示。序列长度为1131bp， 其编码阅读框为SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列的第l_1131bp处所显示的区域，编码377
个氨基酸。2)、将猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因片段插入到原核表达载体pET_28a(+) 的BamHI和XhoI多克隆位点，得到中间质粒pET28a_SsnA。3)、将步骤2)所述的中间质粒pET28a-SSnA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经卡 那霉素抗性筛选得到阳性重组大肠杆菌(Escherichia coli) BL21/PET28a-SsnA,该菌株的 保藏编号为 CCTCC NO :M2010155o4)、将步骤3)所述的重组大肠杆菌置于LB液体培养基中培养，经异丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，western blot分析，证实该重组大肠杆菌已特异性地表 达猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋白，表达的蛋白以上清的形式存在大肠杆菌BL21中，且 具有免疫学活性。
5)、从步骤4)中所述的上清中纯化SsnA表达蛋白，并用该蛋白包被ELISA酶标板 制备ELISA抗原酶标板。用5%脱脂乳制备血清稀释液，按照ELISA方法检测待检血清。根 据反应后的吸光值确定阴性、可疑、阳性的判断临界值。按照如下的配方配置包被液、洗涤 液、封闭液、底物液A、底物液B、终止液。按以下配方制备包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液):Na2C03 1. 59g，NaHC03 2. 93g，ddH20 加至 IOOOmL(pH9. 6)。20 倍浓缩洗涤液:NaC1160g, KCl 4g, Na2HP04 · 12H20 58g, KH2P04 4g, Tween-20 IOml加双蒸水定容至1000ml。封闭液5g脱脂乳(市售)溶于IOOmL洗涤液。底物液底物液A :0. 006% H202缓冲液；底物液B 取Na2HP04 2Η2014. 2g，柠檬 酸10. 5g，用双蒸水定容至500m配成0. ImL磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5. 0)，然后加联苯二胺 (TMB) 10mg。使用时将底物液A和底物液B按等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。终止液(0.025% HF)浓度 40%氢氟酸(HF) 625 μ L，双蒸水 lOOmL。将SsnA抗原酶标板、猪链球菌2型感染阳性血清、灭活疫苗免疫阴性血清、包被 液、洗涤液、封闭液、底物液A、底物液B、终止液组装成SsnA-ELISA鉴别诊断试剂盒。本发明的有益效果1、本发明的有益效果之一是生物安全性高。本发明所涉及到的原核表达载体 pET-28a是分子生物学中常用的原核表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表 达载体pET-28aSSnA也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌BL21/pET-28aSSnA是将原核 表达载体pET-28aSSnA转化至分子生物学中常用的大肠杆菌BL21感受态细胞后经卡那霉 素抗性筛选获得，也不具生物危险性。本发明所用的抗原酶标板是用猪链球菌2型的免疫 原性蛋白制备的，制备过程中不涉及猪链球菌2型，因此不存在猪链球菌2型的逃逸、扩散 的潜在危险。2、本发明的有益效果之二是生产成本低。本发明所提供的猪链球菌2型鉴别诊断 方法和诊断试剂盒所需抗原是猪链球菌2型免疫原性蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌 BL21/pET-28aSSnA在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。而目前还没有关于猪链球 菌2型鉴别诊断的试剂盒。3、本发明的有益效果之三是可以提供区分猪链球菌2型野毒感染动物和灭活疫 苗免疫动物鉴别诊断方法和鉴别诊断试剂盒。本发明ELISA鉴别诊断方法和试剂盒所用抗 原为猪链球菌2型SsnA蛋白。Michaelc. Fontaln对分泌核酸酶(SsnA)的研究报道，SsnA 表型在猪深层组织和浅层组织分离的细菌中具有显著差异_即深层组织分离的细菌大部 分表现为SsnA阳性，而浅层组织分离菌则表现为阴性(Fontaine MCet al.，2004)。针对这 一现象，推测SsnA蛋白可能可以作为区分猪链球菌感染已否的一个指标。目前我国临床上 还没有检测猪链球菌2型抗体的检测试剂盒。对于猪链球菌2型感染和免疫血清的试剂盒 也没有，因此本实验方法能填补国内这一空白。4、本发明的有益效果之四是提供的鉴别诊断试剂盒使用方便。本发明在提供了鉴 别诊断方法的基础上，还将该方法所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，非常适合 猪链球菌2型的临床大规模检测。
序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的泌核酸酶SsnA基因的部分核苷酸序列，序列 全长为1131bp。序列表SEQ ID NO 2是本发明克隆的泌核酸酶SsnA基因的氨基酸序列，编码377
个氨基酸。图1 是本发明的技术路线图。图2 本发明使用的报道的基因序列的登录号及其在链球菌98HAH33中所处的位 置(括号内显示为有下划线的为所述的抗原基因序列在Genebank的登录号，其后的冒号后 的数字为该登录号所示基因序列在猪链球菌98HAH33基因组中的位置，该位置后显示的加 粗斜体字为所述的猪链球菌的菌株号)。图3 是本发明使用的pET_28a(+)载体质粒图谱。图4 重组蛋白基因PCR图。图中泳道，1和2为扩增的SsnA基因片段，3为DNA 分子 marker ο图5 重组中间质粒pET28a-SSnA的双酶切鉴定图图中泳道，1为质粒双酶切图 谱，2 为 15000bp 的 DNA 分子 marker，3 为 2000bp 的 DNA 分子 marker。 图6 重组抗原纯化SDS-PAGE电泳图中泳道1，3和5均为0小时表达，泳道2为 诱导后1小时表达，泳道4为诱导后3小时表达，泳道6为诱导后6小时表达。图7 重组蛋白纯化图谱1，2用考马斯亮蓝染色；3，4为用银染。图8 :ffestem-blot分析图中泳道1，2为SsnA蛋白。图9 =SsnA-ELISA试剂盒的敏感性分析图谱。图10 制备的SsnA-ELISA试剂盒进行血清学调查图谱。
具体实施例方式实施例1 猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA的表达序列的克隆1)猪链球菌2型(SS2)的培养将猪链球菌2型菌种CVCC606株(购白中国北京，中国兽医药品监察所)接种于 含有10%灭活新生牛血清的TSA固体培养基(购自Sigma公司)上，挑取单个菌落接种于 TSB液体培养基(购自Sigma公司)中，置于摇床中(150r/min)，37°C震荡培养过夜。2) SS2基因组DNA的提取及目的基因的扩增遵照TIANGEN细菌基因组提取试剂盒(购自武汉大风生物技术有限公司)，按照 该试剂盒说明书提供的操作方法提取猪链球菌2型基因组DNA。应用引物设计软件Primer 5. 0，设计了用于扩增分泌核酸酶信号肽后的377个氨基酸序列，设计的引物对的DNA序列 如下 Pl 5' -GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3，弓丨入酶切位点 BamH IP2 5，-TGGCTCGAGCATCTGGTGTGACAT-3，引入酶切位点 Xho I该引物对由上海生工生物技术有限公司合成。本发明的PCR反应体系见表1所示。表IPCR 反应(25 μ L 体系)
权利要求
一种分离克隆的分泌核酸酶SsnA基因，它的部分核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一种分离克隆的分泌核酸酶SsnA基因，它的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/PET28a_SsnA，其包含序列表 SEQ ID NO 1所述的基因，其保藏号为CCTCC NO :M2010155o
4.一种猪链球菌2型的抗原蛋白，它是由序列表SEQ ID N0:1所述的基因转化大 肠杆菌，得到保藏号为CCTCC N0.M2010155的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/ PET28a-SsnA所表达的。
5.一种猪链球菌2型抗原蛋白的制备方法，其步骤包括1)设计引物对，通过PCR方法，从猪链球菌2型中克隆得到一种分泌核酸酶SsnA基因， 它的部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示；2)将猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因插入到原核表达载体pET-28a(+)的BamHI和 XhoI多克隆位点，得到中间质粒pET28a-SsnA ；3)将步骤2)所述的中间质粒pET28a-SSnA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经抗性筛 选得到阳性重组大肠杆菌BL21/PET28a-SsnA，其保藏号为CCTCC NO :M2010155 ；4)将步骤3)所述的重组大肠杆菌在LB液体培养基中培养，经异丙基硫代-β-D-半 乳糖苷诱导，western blot分析，得到具有免疫学活性的猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋 白；5)将步骤4)中所得到猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋白包被ELISA酶标板，得到 ELISA抗原酶标板，按照ELISA方法检测待检血清，判定结果；其他核心试剂还包括如下组分包被液为25mmol/L碳酸盐缓冲液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加双蒸水至IOOOmL, ρΗ9· 6 ；20 倍浓缩洗涤液:NaC1160g, KC14g, Na2HPO4 · 12H20 58g, KH2P044g, Tween-20 IOml 加 双蒸水定容至1000ml ；封闭液浓度为5g脱脂乳溶于IOOmL洗涤液中；底物液底物液A :浓度为0. 006%的H2O2缓冲液；底物液B 取Na2HPO4 · 12H20 14. 2g， 柠檬酸10. 5g，用双蒸水定容至500ml配成浓度为0. ΙΜ,ρΗ为5. 0的磷酸盐柠檬酸缓冲液， 然后加联苯二胺IOmg ；终止液浓度为40%的氢氟酸625 μ L，加双蒸水定容至IOOmL ；其中步骤1)所述的引物对的DNA序列如下所示正向引物Pl 5，-GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3’，反向引物Ρ2 5，-TGGCTCGAGCATCTGGTGTGACAT-3’。
6.权利要求1或2所述的基因在制备猪链球菌2型的抗原蛋白中的应用。
7.权利要求3所述的重组大肠杆菌在制备猪链球菌2型鉴别诊断试剂盒中的应用。
8.权利要求4所述的抗原蛋白在制备猪链球菌2型鉴别诊断试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于动物传染病技术领域，具体涉及一种分泌核酸酶SsnA基因的分离和克隆，将所述的基因通过大肠杆菌表达，获得重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28aSsnA)，利用该菌株表达猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA，建立酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法，用于区分猪链球菌2型灭活疫苗免疫猪与被感染猪。本发明提供含有猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA的表达质粒(pET-28a(+))、重组大肠杆菌菌株BL21/pET28a-SsnA、SsnA蛋白的表达和纯化方法以及用该蛋白建立的可区分猪链球菌2型灭活苗免疫猪血清和感染猪血清的鉴别诊断方法。
文档编号C12N15/70GK101935668SQ20101023156
公开日2011年1月5日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者康超, 张安定, 李冉, 滑亚峰, 金梅林 申请人:华中农业大学;武汉科前动物生物制品有限责任公司